專利名稱：預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種獸用油乳劑滅活疫苗及其制備方法，特別涉及一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗及制備方法，屬于獸用生物防治技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
山羊傳染性胸膜肺炎是我國當前山羊養(yǎng)殖生產(chǎn)中危害較為嚴重的一種條件性傳染病，其致病原主要為綿羊肺炎支原體“Y98”和絲狀支原體山羊亞種“Pm”。國內(nèi)實驗研究表明，“Y98”主要流行于我國西北、東北等地區(qū)，“Pe3”主要流行于西南、華南等地區(qū)。由于該病的流行特點在我國存在地域上的顯著差異，目前國內(nèi)尚無統(tǒng)一的疫苗制品。近年來， 隨著日益增長的市場需求和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，加大了全國各地區(qū)間的種群流動和商品流通，各地方致病原擬將隨種間流動而改變山羊傳染性胸膜肺炎原有的流行規(guī)律及發(fā)病特性；近年的血清學診斷及流行病學調(diào)查研究表明，多菌株的交叉感染現(xiàn)象在各地區(qū)已逐步顯現(xiàn)出來，擬為該病的有效防控提出了新的要求。根據(jù)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所1999一2010 年期間對貴州山羊傳染性胸膜肺炎的血清學診斷、流行病學調(diào)查以及病原分離鑒定研究表明，其絲狀支原體山羊亞種“P(；3”陽性感染率為28. 33-38. 3%，綿羊肺炎支原體“Y98”陽性感染率為15.8%，Ps3與Y98的交叉感染率達13.8%，其臨床發(fā)病率達20— 30%左右，同時， 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所也先后從擬似發(fā)病羊只病理組織中分離出致病原絲狀支原體山羊亞種“Pe3”和綿羊肺炎支原體“Y98”致病株。由于國內(nèi)目前應用的山羊傳染性胸膜肺炎預防疫苗使用效果并不理想，致使該病至今未能得到有效防控，特別是在每年的冬、春季節(jié)，山羊傳染性胸膜肺炎仍呈高發(fā)態(tài)勢，嚴重制約了山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對預防山羊傳染性胸膜肺炎具有良好免疫特異性及使用安全性的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗及制備方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的預防山羊傳染性胸膜肺炎雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗特異性免疫抗原綿羊肺炎支原體“Y98”毒株和絲狀支原體山羊亞種貴州地方株“貴羅Pro”毒株， 每毫升含菌量分別為10 X IO6 —10 X IOltl活菌。經(jīng)優(yōu)選后的標準抗原量為每毫升Y98彡IOX IO9活菌，“貴羅Ps3”彡IOX IO9活菌。一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法其制備步驟為
(I)滅活疫苗的制備
①菌株復壯分別取“貴羅Pe3”、“Y98”凍干毒株于健康山羊氣管內(nèi)注射，復壯觀察，待發(fā)病7-10天后，剖取接種山羊肺、淋巴、胸水等病變組織制成含菌母液；
②母液二次接種健康山羊，待發(fā)病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病變組織接種于選擇性支原體培養(yǎng)基，分離提取復壯菌株；
③復壯菌株擴大培養(yǎng)，制成菌液，經(jīng)檢測和細菌計數(shù)每毫升“貴羅pe3”、“Y98”活菌分別不低于IOXlO9 ；
④滅活將菌液按O.3%比例加入福爾馬林溶液，18°C滅活48h，經(jīng)無菌檢驗合格后作為免疫抗原；
⑤水相制備取合格菌液與土溫-80按I:0. 05混勻；
⑥油相制備94%柏油與6%司本-80混勻后加入2%硬脂酸鋁；
⑦滅活油乳劑制備取油相2份、水相I份進行碾磨乳化。(2)安全檢驗用實驗兔、豚鼠按每只2_3ml肌肉注射滅活苗，觀察10日無異常。(3)效力檢驗選擇健康實驗山羊分別在第7d、15d進行2次免疫接種，第25d頸靜脈采血分離血清,檢測免疫陽性抗體。(4)攻毒試驗對免疫山羊每只按100億活菌量氣管內(nèi)注射，觀察25-30d無異常。(5)疫苗分裝在不低于10萬級生物凈化GMP生產(chǎn)車間條件下無菌密閉封裝。(6)儲存條件2— 8°C恒溫冷藏保存。用法與用量皮下或肌肉注射。成年羊5ml/只，小羊3ml/只，一年注射2次。本發(fā)明應用山羊傳染性胸膜肺炎的主要致病原綿羊肺炎支原體“Y98 ”和絲狀支原體山羊亞種“Pe3 ”作為特異性免疫抗原，研發(fā)出雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗用于山羊傳染性胸膜肺炎的預防免疫，符合當前山羊傳染性胸膜肺炎的流行規(guī)律和發(fā)病特性。本發(fā)明疫苗主要用于山羊傳染性胸膜肺炎的免疫防控。本發(fā)明經(jīng)菌株復壯、菌株擴大培養(yǎng)、滅活、活檢、乳化、安檢、效檢、應用防治等一系列實驗研究表明，羊傳染性胸膜肺炎雙價二聯(lián)滅活油乳劑疫苗具有良好的免疫特異性和敏感性，當菌體抗原量Y98彡IOX 109、“貴羅Pe3”彡IOXlO9 時，其實驗組免疫抗體陽性率為100%，攻毒保護實驗有效率達87. 5%以上；應用推廣試驗免疫抗體陽性率達90. 7-96. 3%。本發(fā)明研究應用的油相、水相乳化抗原雙相包被技術(shù)，具有免疫抗原分布均勻、吸附性好、不易分離的特點，能有效提高疫苗的穩(wěn)定性；在注射部位形成油囊緩慢釋放，在一定時間內(nèi)可增強免疫抗原的持續(xù)作用。本疫苗使用的特異性免疫抗原 “貴羅Pe3”和“Y98”是我國當前山羊傳染性胸膜肺炎發(fā)生并流行的主要致病原，對山羊傳染性胸膜肺炎具有良好的免疫特異性和敏感性，其滅活乳化后具有極高的使用安全性和穩(wěn)定性，完全符合國家對動物防疫制品在特異性、生物安全性等方面的基本要求。對貴州省和全國其他地區(qū)在山羊傳染性胸膜肺炎的生物防治方面具有良好的生產(chǎn)、經(jīng)濟和社會意義。、試驗材料
1.I實驗動物實驗用健康山羊由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所花溪黑山羊良種繁育養(yǎng)殖示范基地提供；實驗用家兔、豚鼠由貴陽醫(yī)學院實驗動物室提供。I. 2實驗菌株綿羊肺炎支原體“Υ98”毒株和絲狀支原體山羊亞種貴州地方株“貴羅Pe3”毒株由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽重大疫病研究室分離鑒定保存。I. 3實驗試劑實驗用營養(yǎng)培養(yǎng)基、支原體選擇性培養(yǎng)基由實驗室制備。山羊傳染性胸膜肺炎ELISA抗體檢測試劑盒和間接血凝檢測試劑盒由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽重大疫病研究室提供。、實驗內(nèi)容及方法
2.I雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備2.I. I菌株復壯分別取Pe3、Y9J*干菌于健康山羊氣管內(nèi)注射，復壯觀察，待發(fā)病7-10 天后，剖取接種山羊肺、淋巴、胸水等病變組織制成含菌母液。母液二次接種健康山羊，待發(fā)病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病變組織接種于支原體選擇性培養(yǎng)基，分離提取復壯菌株。2. I. 2菌液制備將分離復壯的菌株分別接種于犢牛血清營養(yǎng)培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，分別按每毫升IOX IO6UOX IO9UOX IO10活菌量制備菌液。2. I. 3菌體滅活分別將菌液按0. 3%比例加入福爾馬林溶液，18°C滅活48h，經(jīng)無菌檢驗合格后作為免疫抗原。2. I. 4活菌檢測分別取滅活菌液接種于血平板，37°C培養(yǎng)觀察24— 36小時，無活菌生長視為檢驗合格。2. I. 5水相制備取合格菌液與土溫-80按I :0. 05混勻。2. I. 6油相制備94%柏油與6%司本-80混勻后加入2%硬脂酸鋁。2. I. 7乳化取油相2份、水相I份進行充分碾磨乳化。2. I. 8無菌分裝在10萬級生物凈化GMP生產(chǎn)車間進行無菌密閉封裝。2. 2安全檢驗用實驗兔、豚鼠按每只2_3ml肌肉注射滅活苗，觀察10日。2. 3效力檢驗非免疫實驗山羊32只，體重12. 5—20kg，隨機平均分成4組，每組 8只，其中第1-3組為實驗組，第4組為對照組。2. 3. I免疫實驗及分組健康實驗羊分組觀察7d無異常后進行實驗(見表I)。表一
權(quán)利要求
1.一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，其特征在于它是由山羊傳染性胸膜肺炎主要致病原綿羊肺炎支原體“Y98 ”毒株和絲狀支原體山羊亞種貴州地方株“貴羅pe3”毒株為特異性免疫抗原，經(jīng)滅活乳化合成；其中每毫升“γ98”、“貴羅pe3”含菌量分別為 ιοχιο6—ιοχιο10ο
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗， 其特征在于它是由山羊傳染性胸膜肺炎主要致病原綿羊肺炎支原體“γ98”毒株和絲狀支原體山羊亞種貴州地方株“貴羅Pe3”毒株為特異性免疫抗原，經(jīng)滅活乳化合成；其中每毫升 “Υ98”、“貴羅Pe3”含菌量分別不低于IOX IO9。
3.一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法其特征在于制備步驟為(1)滅活疫苗的制備①菌株復壯分別取“貴羅Pe3”、“Y98”凍干毒株于健康山羊氣管內(nèi)注射，復壯觀察，待發(fā)病7-10天后，剖取接種山羊肺、淋巴、胸水等病變組織制成含菌母液；②母液二次接種健康山羊，待發(fā)病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病變組織接種于選擇性支原體培養(yǎng)基，分離提取復壯菌株；③復壯菌株擴大培養(yǎng)，制成菌液，經(jīng)檢測和細菌計數(shù)每毫升“貴羅Pe3”、“Y98”活菌分別不低于IOXlO9 ；④滅活將菌液按O.3%比例加入福爾馬林溶液，18°C滅活48h，經(jīng)無菌檢驗合格后作為免疫抗原；⑤水相制備取合格菌液與土溫-80按I:0. 05混勻；⑥油相制備94%柏油與6%司本-80混勻后加入2%硬脂酸鋁；⑦滅活油乳劑制備取油相2份、水相I份進行碾磨乳化；(2)疫苗分裝在不低于10萬級生物凈化GMP生產(chǎn)車間條件下無菌密閉封裝；(3)儲存條件2—8°C恒溫冷藏保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預防山羊傳染性胸膜肺炎的雙價二聯(lián)油乳劑滅活疫苗及制備方法。它是由綿羊肺炎支原體“Y98”毒株和絲狀支原體山羊亞種貴州地方株“貴羅PG3”毒株作為特異性免疫抗原，經(jīng)菌株復壯、菌株擴大培養(yǎng)、滅活、活檢、乳化、安檢、效檢、應用防制等一系列實驗研究合成。當每毫升抗原含量在Y98 ≥10×109、“貴羅PG3”≥10×109時，其免疫抗體陽性率為100%，攻毒保護實驗有效率達87.5%以上；應用推廣試驗免疫抗體陽性率達90.7-96.3%；表明對山羊傳染性胸膜肺炎具有良好免疫特異性和敏感性，其使用具有可靠的安全性和穩(wěn)定性。
文檔編號A61K39/116GK102580075SQ20121008998
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者尚以順, 文正常, 楊粵黔, 潘淑惠 申請人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所