專利名稱：新型鴨呼腸孤病毒病疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型鴨呼腸孤病毒病疫苗及其在預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病上的應(yīng)用，屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2005年以來在中國福建、廣東和浙江等省番鴨、半番鴨和麻鴨等鴨群發(fā)生的一種以肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜為主要特征的疫病，因其主要病變?yōu)楦纬鲅獕K/斑和壞死點/灶，俗稱“鴨出血壞死性肝炎”。該病無明顯季節(jié)性，各種品種鴨(如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨等)均可發(fā)生，并有逐年增加的趨勢；發(fā)病日齡約為3 25日齡，其中以5 10日齡居多，病程5 7d，發(fā)病率5% 20%、死亡率2% 15%，日齡愈小或并發(fā)感染時其發(fā)病率死亡率愈高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所從病毒理化生物學(xué)、動物回歸試驗、基因組特性及分子水平上首次證實鴨出血壞死性肝炎的病原是一種有別于番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒的病毒-命名為新型鴨呼腸孤病毒(NovelDuck Reovirus, NDRV),至今為止,該病尚無有效的防治方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供新型鴨呼腸孤病毒病(鴨出血壞死性肝炎)疫苗并將其應(yīng)用于預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的首先應(yīng)用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚增殖病毒，收獲含毒尿囊液；或接種番鴨胚成纖維細(xì)胞單層，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時收獲細(xì)胞毒；將上述病毒適當(dāng)濃縮并經(jīng)甲醛滅活后，按適當(dāng)比例與白油佐劑混勻，制成新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗然后將上述滅活疫苗應(yīng)用于預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病取滅活疫苗免疫種鴨一次，I. Oml/羽；4周后加強(qiáng)免疫一次，I. Oml/羽。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于本發(fā)明通過種鴨免疫提高子代母源抗體水平，使雛鴨在易感日齡能抵抗新型鴨呼腸孤病毒的感染；用上述滅活疫苗免疫開產(chǎn)前的種鴨，IOml/羽，間隔28天加強(qiáng)免疫，使免疫種鴨的子代含有較高母源抗體，種鴨免疫所產(chǎn)的子代雛鴨在15日齡內(nèi)能夠抵抗新型鴨呼腸孤病毒的感染。本發(fā)明簡便可行、實用性強(qiáng)，為防治新型鴨呼腸孤病毒病(鴨出血壞死性肝炎)提供了一種安全有效的方法。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。(但不是對本發(fā)明的限制)。首先應(yīng)用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚增殖病毒，收獲含毒尿囊液；或接種番鴨胚成纖維細(xì)胞單層，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%時收獲細(xì)胞毒；將上述病毒適當(dāng)濃縮并經(jīng)甲醛滅活后，按適當(dāng)比例與白油佐劑混勻，制成新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗，然后將上述滅活疫苗應(yīng)用于預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病；種鴨免疫及中和抗體取滅活疫苗免疫種鴨一次，IOml/羽；4周后加強(qiáng)免疫一次，IOml/羽。所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,簡稱CCTCC)，保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學(xué)，保藏日2011年7月29 日，保藏編號=CCTCC NO V201127所述的疫苗制備方法具體步驟如下(I)抗原制備將病毒NDRV-JM85株接種MDEF或11日齡的番鴨胚，收獲細(xì)胞病變達(dá)75%的細(xì)胞毒或24h后死亡番鴨胚的尿囊液病毒，-20°C凍存。當(dāng)尿囊液病毒對番鴨胚的ELD5tl彡1(Γ45/0. Iml或細(xì)胞毒對MDEF細(xì)胞的TCID5tl彡10,/0. Iml時，可用于病毒滅活。將收獲的尿囊液或細(xì)胞毒，按總體積的O. 06%加入純甲醛，37°C滅活24h。取滅活后的病毒液接種9日齡SPF雞胚或11日齡番鴨胚，雞胚及番鴨胚應(yīng)全部存活。(2)疫苗制備按I : I的比例加入白油佐劑和滅活的病毒液，攪拌均勻制成油包水型乳劑疫苗。該疫苗無菌檢驗應(yīng)無菌生長。實驗證明7日齡健康易感番鴨，每羽頸部皮下注射1.0ml的疫苗后，接種鴨應(yīng)全部存活，采食、飲水、生長發(fā)育等均正常；隨機(jī)剖殺鴨，心、肝、脾等內(nèi)臟應(yīng)未見異常。于二免后不同時間(PI 7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天、77天、84天、91天)連同對照鴨采血，測定中和抗體效價。結(jié)果表明，種鴨在第二次免疫后7天就有一定的抗體，二免后14天抗體效價上升明顯，于二免后28-49天時達(dá)到25°，直到91天時抗體水平為2425。雛鴨(免疫種鴨子代)被動保護(hù)取二免后種鴨在60天內(nèi)所產(chǎn)的種蛋，挑選同一時間孵化出殼的一日齡含NDRV母源抗體的番鴨20羽為母源抗體組(A組)；同時設(shè)非免疫種鴨子代(無NDRV母源抗體)的I日齡番鴨20羽為非母源抗體組(B組);將A組和B組雛鴨經(jīng)腿肌注射NDRV強(qiáng)毒05ml/羽，觀察21天。并在攻毒后第7天，隨機(jī)剖殺5羽，觀察各器官病變情況。結(jié)果A組雛番鴨注射強(qiáng)毒后全部存活，吃料、飲水、精神等方面正常，隨機(jī)剖殺5羽番鴨的肝、脾等臟器均正常，未見出血壞死等變化。而B組雛番鴨注射強(qiáng)毒后，吃料、飲水減少，精神沉郁，整個觀察期對照鴨體重比母源抗體組輕且差異明顯，隨機(jī)剖殺5羽鴨肝、脾均觀察到嚴(yán)重的出血壞死斑。結(jié)果表明種鴨經(jīng)兩次免疫NDRV滅活苗后，其子代雛鴨能有效抵抗NDRV強(qiáng)毒感染。雛鴨(免疫種鴨子代)母源抗體消長規(guī)律取種番鴨二免后60天內(nèi)所產(chǎn)種蛋，孵化出殼后采血測定雛番鴨NDRV母源抗體消長情況。I日齡雛番鴨NDRV母源抗體較高，中和抗體效價達(dá)23 ;之后逐漸下降，在15日齡時還有一定的母源抗體，中和抗體效價為215，在21日齡時母源抗體基本消失。臨床應(yīng)用效果評價在NDRV流行疫區(qū)挑選3個種鴨養(yǎng)殖場進(jìn)行該方法的防制試驗。種鴨在開產(chǎn)前兩次免疫NDRV滅活苗，所孵化的小鴨跟蹤觀察30天，試驗種鴨及雛鴨都沒有出現(xiàn)NDRV感染。而周邊未采取以上措施養(yǎng)鴨場不同程度出現(xiàn)雛鴨因發(fā)生該病而死亡。進(jìn)一步證明該方法安全、有效，可用于臨床上預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病(鴨出血壞死性肝炎)。
權(quán)利要求
1.新型鴨呼腸孤病毒病疫苗及應(yīng)用，其特征在于，首先應(yīng)用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚增殖病毒，收獲含毒尿囊液；或接種番鴨胚成纖維細(xì)胞單層，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%時收獲細(xì)胞毒；將上述病毒適當(dāng)濃縮并經(jīng)甲醛滅活后，按適當(dāng)比例與白油佐劑混勻，制成新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗；然后將所述的新型鴨呼腸孤病毒病疫苗應(yīng)用于預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病，具體如下取滅活疫苗免疫種鴨一次，I. Oml/羽；4周后加強(qiáng)免疫一次，I. Oml/羽；所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2011年7月29日，保藏編號CCTCCNO :V201127。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型鴨呼腸孤病毒病疫苗的制備及應(yīng)用，首先應(yīng)用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚增殖病毒，收獲含毒尿囊液；或接種番鴨胚成纖維細(xì)胞單層，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75％以上時收獲細(xì)胞毒；將上述病毒適當(dāng)濃縮并經(jīng)甲醛滅活后，按適當(dāng)比例與白油佐劑混勻，制成新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗；然后將該新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗應(yīng)用于預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病取滅活疫苗免疫種鴨一次，1.0ml/羽；4周后加強(qiáng)免疫一次，1.0ml/羽。
文檔編號A61P31/14GK102631674SQ20121005583
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者朱小麗, 李兆龍, 林鋒強(qiáng), 王劭, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯, 黃梅清 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所