專(zhuān)利名稱(chēng)：一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及重組表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來(lái)自駱駝蓬中的脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP，以及制備獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的方法及其在抑菌和抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物體在受到病原菌的侵害時(shí)，首先產(chǎn)生的防御機(jī)制便是抗菌蛋白，其作用范圍較廣，包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌、原蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)及含有外套膜的病毒，而且也有研究報(bào)告指出抗菌蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)?？咕鞍讖V泛存在于自然界許多生物體中，是一道天然的防御系統(tǒng)，其中，病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)、防御素(defensins)、核糖體失活蛋白(ribosome. inactivating proteins,RIPs)和脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer protein, LTP)等都起著非常重要的作用。脂轉(zhuǎn)移蛋白是一類(lèi)分子量相對(duì)較小的堿性蛋白質(zhì)，在植物、動(dòng)物、酵母、真菌和一些細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)。在動(dòng)物中有特異脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)和非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，在植物中因其脂轉(zhuǎn)移活性具有廣泛性和不確定性，植物中至今只發(fā)現(xiàn)有nsLTP。植物中nsLTP能夠轉(zhuǎn)移磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，并能夠促進(jìn)微體和線(xiàn)粒體之間的磷脂交換?，F(xiàn)在已從多種植物中分離得到nsLIPs，如玉米、水稻、大麥、谷子、洋蔥、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、蘿卜、桃和擬南芥等。在植物中非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白都是可溶性蛋白，可以達(dá)到可溶蛋白總量的4%。 由于植物nsLIPs具有很強(qiáng)的抗真菌和細(xì)菌的活性，所以被列為植物防御蛋白系列。然而目前一些研究還發(fā)現(xiàn)植物nsLTPs還具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。近年來(lái)，從傳統(tǒng)中草藥中繼續(xù)挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的蛋白質(zhì)或多肽，已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。駱駝蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)駱駝蓬屬(Peganum) 多年生藥用草本植物，已列入維吾爾藥衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)。多分布于干旱草地、鹽堿化荒漠地帶。駱駝蓬富含多種生物堿，具有抗癌、消炎、抗病毒等多種藥理及殺蟲(chóng)抑菌活性，這些生物活性引起了人們對(duì)野生駱駝蓬資源的關(guān)注。本發(fā)明首次從駱駝蓬幼葉中克隆出脂轉(zhuǎn)移蛋白基因并構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行重組表達(dá)，該重組表達(dá)蛋白具有抑菌和抗腫瘤活性的作用，未見(jiàn)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明為科學(xué)認(rèn)識(shí)駱駝蓬中活性蛋白的功能提供依據(jù)，對(duì)脂轉(zhuǎn)移蛋白以及其他類(lèi)型抗菌蛋白的研究不僅具有重要的理論意義，在抗微生物感染和抗腫瘤藥物的治療方面也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，并提供重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法，證明該重組表達(dá)蛋白的用途，以擴(kuò)大藥用植物駱駝蓬的應(yīng)用范圍。本發(fā)明所述駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO. 1中所示的堿基序列， 全長(zhǎng)為348bp，其編碼一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，具有序列表SEQ ID N0. 2中所示的由115個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列，其中含有8個(gè)半胱氨酸殘基，分別在序列表SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列中第29、39、54、55、75、77、100和114的位置上。本發(fā)明提供了一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因在大腸桿菌中高效重組表達(dá)的方法和應(yīng)用，包括如下步驟(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，取幼葉放入無(wú)RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成cDNA ；O) PCR擴(kuò)增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國(guó)際檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以步驟⑴合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出348bp的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到T 載體pCR2. 1上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增獲得WiLTP基因核酸序列，經(jīng)雙酶切將WiLTP亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET30a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-PhLTP ；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ε. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡(jiǎn)稱(chēng) E. coli BL21/pET30a-PhLTP ；(4)重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP的高效表達(dá)及純化以L(fǎng)B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌E. coli BL21/pET-30a-PhLTP經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達(dá)蛋白，其中培養(yǎng)溫度是觀(guān)°0，pH 7.0;離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細(xì)胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過(guò)金屬鎳螯合柱層析方法純化，獲得純度達(dá)97%以上的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明得到了可溶性、高效表達(dá)的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP。(5)重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的功能活性和應(yīng)用上述步驟(4)得到的純化的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP具有抑菌和抑制腫瘤活性，在病原微生物感染和在腫瘤的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明得到的一種重組表達(dá)的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白PhLTP具有明顯的抑菌活性，對(duì)三種病原細(xì)菌，如肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大腸埃希菌(Escherichia coliAtc25922)，類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)均具有抑制效果，且隨樣品濃度升高抑制效果增強(qiáng)。當(dāng)重組蛋白濃度在0. 3mg/mL時(shí)，對(duì)三種菌的抑菌圈直徑范圍在16. 0-18. Omm，所述重組蛋白可以用于制備抗微生物感染藥物制劑。本發(fā)明所得到的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白還具有明顯的抗癌活性，在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有高抑制作用，但對(duì)正常細(xì)胞毒性較小。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用MTT法測(cè)定重組脂轉(zhuǎn)移蛋白對(duì)常見(jiàn)癌細(xì)胞如人宮頸癌細(xì)胞HeLa、食管癌細(xì)胞Eca-109和鼠黑色素瘤細(xì)胞B16具有顯著的抑制生長(zhǎng)作用，其中對(duì)B16細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，作用24h時(shí)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)僅為12. 5 μ g/mL，而對(duì)正常細(xì)胞Vero抑制作用較弱。這些實(shí)驗(yàn)表明重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白PhLTP在抗病原細(xì)菌感染的生物制劑及在腫瘤疾病的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)于重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP的制備和活性等未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)提供了駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法，具體步驟如下(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，稱(chēng)取0. Ig駱駝蓬葉片放入無(wú)RNA酶的研缽中液氮研磨成粉末，將粉末倒入含有Iml Trizol的EP管中，劇烈振蕩以裂解細(xì)胞，加0. 2ml氯仿，震蕩 I5秒，在室溫下(15°C 30°C )放置2 ;3min后，l2000g(2°C 8°C )離心Ιδπ η。取上層水相置于新EP管中，加0. 5ml異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置lOmin，12000gQ°C 8V )離心lOmin，棄上清，加Iml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，7500g 8°C )離心5min，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥后，用foiase-free water溶解RNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A^0/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，按照 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(全式金公司)操作方法進(jìn)行第一鏈cDNA的合成；Q)PCR擴(kuò)增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國(guó)際檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以步驟⑴合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出 348bp 的 DNA 片段；所述一對(duì)簡(jiǎn)并引物為Pl :5’ -ATGGCWRSCMTSAAGSTTGYWT-3，，P2 5，-TCACYTSACSKTRGMGCAGTTGGTG-3，；PCR 體系為1 μ L 駱駝蓬葉 cDNA, 1 μ L 10 μ M 弓丨物 Pl, 1 μ L 10μΜ3|*Ρ2，2μ dNTPs Mixture (2. 5mM), 2 μ L IOXEx Taq Buffer,0. 5μ L ExTaq DNAPolymerase (5U/μ L)以及 12. 5 μ L Sterilized dH20，總反應(yīng)體系為 20 μ L ；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用熱啟動(dòng)，具體條件是94°C IOmin ；94°C Imin, 59°C 30sec,72°C 45sec，循環(huán)數(shù)30 -JTC IOmin ；PCR片段純化后，克隆到pCR2. 1載體上，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用Pl和P2引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒PCR2. I-PhLTP插入片段的大小正確，表明WiLTP基因陽(yáng)性克隆重組子已獲得。將含有完整外源片段的陽(yáng)性克隆菌株送北京華大基因中心測(cè)序， 進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得了正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物(引入酶切位點(diǎn))，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得WiLTP基因核酸序列，所述一對(duì)特異性引物為P3 5' -GGAATTCGCCATAGCATGCGGTACGGTG-3‘(下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)EcoR I), P4 5' -CCGCTCGAGTCACTTCACCGTAGAGCAGTT-3 ‘(下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn) Xho I) ;PCR 反應(yīng)體系為1 μ g PCR2. I-PhLTP 質(zhì)粒，1 μ L 10 μ M 弓丨物 Ρ3，1 μ L 10 μ M 弓丨物 Ρ4，2 μ L dNTPs Mixture (2. 5mM), 2 μ L IOXEx Taq Buffer,0. 5μ L Ex Taq DNA Polymerase (5U/μ L)以及12. 5 μ LSterilized dH20,總反應(yīng)體系為20 μ L ；輕輕混勻后按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)， 具體條件是 94°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，循環(huán)數(shù) 30 ；72°C 7min ；PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取IOOyL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，將目的DNA片段切出。純化步驟參考上海生工公司DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)；將PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行EcoR I與 Xho I雙酶切，采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對(duì)雙酶切的WiLTP和pET30a
進(jìn)行回收，然后進(jìn)行連接反應(yīng)；在一微量離心管中依次加入下列試劑無(wú)菌水6 “L IOx連接緩沖液
pET30a 載體(53ng/pL)7 μι
PCR 產(chǎn)物(PhLTP)40 μ
Τ4 DNA連接酶1 μ ^
Total Volume60 μ充分混勻上述連接成分，短暫離心后，16°C水浴過(guò)夜。參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第三版)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，將過(guò)夜長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆挑取到 6mL的LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12-1他。菌液PCR方法鑒定重組質(zhì)粒正確。按照堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用雙酶切進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。得到的具有工程菌為 E.coliBL21/pET30a-PhLTP。(4)重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP的高效表達(dá)及純化將鑒定正確的含有駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的重組質(zhì)粒的培養(yǎng)物分別按1 100轉(zhuǎn)接到含卡那霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0. 3mM，在誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。親和層析誘導(dǎo)表達(dá)后，4°C，8000g離心lOmin，收集菌體；用預(yù)冷的PBS重懸菌體，8000g離心lOmin，收集菌體；用適量的PBS再次重懸菌體，冰浴30min，4°C超聲破菌，超聲波超聲破菌的條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C，12000g離心20min，收集上清，上清經(jīng)金屬螯合柱Ni-NTA親和純化，獲得較純的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，透析除去咪唑，Bradford法測(cè)濃度后，過(guò)濾除菌。將純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定正確，真空冷凍干燥后于-20°C保存?zhèn)溆谩ＳH和層析的條件如下結(jié)合緩沖液20mM磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. 02M咪唑，pH7. 4 ；洗脫緩沖液:20mM磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. IM咪唑，pH7. 4(棄去)20mM 磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. 2M 咪唑，ρΗ7· 4 (收集)本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明首次從新疆傳統(tǒng)維吾爾族藥材駱駝蓬中克隆得到駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，獲得該基因348bp的開(kāi)放閱讀框，將該基因成功構(gòu)建到表達(dá)載體pET30a表達(dá)載體上并于原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)。(2)本發(fā)明利用表達(dá)載體自身的特點(diǎn)，采用超聲波破碎法和金屬鎳螯合柱層析相結(jié)合的方法，獲得純度為97%以上，有活性的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，達(dá)到電泳純，大大簡(jiǎn)化了一般蛋白質(zhì)分離純化的繁瑣步驟。(3)本發(fā)明重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白對(duì)幾種常見(jiàn)的致病菌有明顯的抑制作用，同時(shí)還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，不僅擴(kuò)大了駱駝蓬的應(yīng)用范圍，而且為駱駝蓬應(yīng)用于防治有害細(xì)菌和腫瘤的治療提供技術(shù)支持。
圖1是pET30a_PhLTP重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖2是pET30a_PhLTP重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖，圖中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2000 ；1為EcoR I與Β ο I雙酶切鑒定；
圖3是SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，圖中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2為誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3為超聲波破碎細(xì)胞后的上清；4為純化后的融合蛋白；圖4是重組表達(dá)蛋白體外抑菌活性檢測(cè)圖，圖中，(A)肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae) ； (B)大腸埃希菌(Escherichia coli Atc25922) ； (C)類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌 (Pseudomonas pseudoalcaligenes)。重組蛋白 PhLTP 樣品溶于 0. 02M PBS 緩沖液(pH7. 4) 中，用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，以滅菌的PBS作為對(duì)照。置37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h。在圖中(1)為對(duì)照含 0.02M PBS (pH 7.4) ； (2)為含 0. 0375mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (3)為含 0. 075mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (4)為含 0. 15mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (5)為含 0. 3mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7.4)。結(jié)果表明該重組蛋白對(duì)3種病原細(xì)菌菌均有生長(zhǎng)抑制作用；圖5是重組蛋白PhLTP對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制的MTT檢測(cè)圖。取不同濃度的 PhLTPd. 25,2. 5,12. 5、25、50、62. 5,125 和 250 μ g/mL)分別檢測(cè)其對(duì) HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)，B16 (鼠黑色素瘤細(xì)胞)，ECa-109 (人食管癌細(xì)胞)和Vero (非洲綠猴腎細(xì)胞)的增殖抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WiLTP對(duì)HeLa，B16和ECa-109細(xì)胞均有抑制生長(zhǎng)作用，其中對(duì)B16細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，其作用24h的IC5tl值約為12. 5 μ g/mL。但其對(duì)正常細(xì)胞Vero 抑制作用較弱。
具體實(shí)施例方式下面采用具體實(shí)施例的方式解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于實(shí)施例。實(shí)施例1 一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的克隆1.材料植物材料駱駝蓬種子采自烏魯木齊市紅雁池水庫(kù)。將種子放入帶有濕紗布的平皿中，待長(zhǎng)出葉片后備用。菌株大腸桿菌(Escherichia coli) jToplO (購(gòu)自 invitrogen 公司)。質(zhì)粒載體pCR2. 1載體購(gòu)自hvitrogen。主要試劑Trizol、DNA Marker,Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技、T4DNA連接酶、 限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)TaKaRa，DNA片段回收試劑盒購(gòu)自上海生工。培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 5g/L，NaOH 0. 334g/ L，調(diào)pH至7. 0，高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2. 4g/L瓊脂粉，高壓滅菌。1. 2 方法1.2. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)登錄在國(guó)際檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，引物序列如下Pl :5’ -ATGGCWRSCMTSAAGSTTGYWT-3‘P2 :5’ -TCACYTSACSKTRGMGCAGTTGGTG-3’1. 2. 2駱駝蓬總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)(采用Trizol法提取)駱駝蓬總RNA的提取(采用Trizol法提取)將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，稱(chēng)取0. Ig駱駝蓬葉片放入無(wú)RNA酶的研缽中液氮研磨成粉末，將粉末倒入含有Iml Trizol的EP管中，劇烈振蕩以裂解細(xì)胞，加0. 2ml氯仿，震蕩15秒，在室溫下(15°C 30°C )放置2 ^iin 后，12000g 8°C )離心15min。取上層水相置于新EP管中，加0. 5ml異丙醇，在室溫下 (15°C 30°C )放置10min，12000gQ°C 8°C )離心lOmin，棄上清，加Iml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，7500gQ°C 8°C )離心5min，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥后，用foiase-free water 溶解 RNA。駱駝蓬總RNA的質(zhì)量檢測(cè)將提取的總RNA在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，18S和 28SrRNA在真核生物中占總RNA的90%以上，因此呈特征條帶。18S和^S rRNA特征譜帶清晰，無(wú)拖尾，亮度比接近1 2，說(shuō)明RNA是完整的，沒(méi)有被降解。再用紫外分光光度法檢測(cè)，分別在波長(zhǎng)260nm和280nm處測(cè)RNA樣品OD值，OD260/OD280約2. O較好，進(jìn)而確定是否需要重新提取RNA。1. 2. 3RNA 的反轉(zhuǎn)錄取高質(zhì)量的RNA，按照全式金公司 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix操作方法進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。在EP管中配制下列模板RNA/引物混合液 50ng-5y g^RNA, 1 μ 1 Anchored Oligo (dT) 18 (0· 5 μ g/μ 1)弓|_，10 μ 1 2XTS Reaction Mix反應(yīng)混合液，Ιμ TransScript RT/RI Enzyme Mix反轉(zhuǎn)錄酶混合液，加無(wú)foiase的水至總體積為20μ 1，42°C保溫lh，70°C保溫IOmin后，迅速在冰上急冷^iin以上，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。1.2.4PCR 擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系為1 μ g駱駝蓬葉cDNA，IyL 10 μ MP1，1 μ L 10 μ ΜΡ2，2 μ LdNTPs Mixture (2. 5mM) , 2 μ L IOXEx Taq Buffer, 0. 5μ L Ex Taq DNAPolymerase (5U/ μ L)以及 12. 5 μ L Sterilized dH20,總反應(yīng)體系為 20 μ L。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用熱啟動(dòng)，具體條件是94°C IOmin ；94°C lmin, 59°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán)數(shù)30 ； 72°C IOmin0反應(yīng)在PCR熱循環(huán)儀(Promega公司，北京)上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后，用Sanft^p柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟按照該公司的柱式DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)進(jìn)行純化。1. 2. 5大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備大腸桿菌感受態(tài)的制備，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第三版)。1. 2. 6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pCR2. 1載體的連接與轉(zhuǎn)化鏈接反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO. 1中所示的堿基序列，全長(zhǎng)為348bp，其編碼一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，具有序列表SEQ ID NO. 2中所示的由 115個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列，其中含有8個(gè)半胱氨酸殘基，分別在序列表SEQID NO. 2中所示的氨基酸序列中的第四、3954、55、75、77、100和114的位置上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的獲得方法和應(yīng)用，包括如下步驟(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，取幼葉放入無(wú)RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成cDNA ；PCR擴(kuò)增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國(guó)際檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以步驟(1)合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出348bp的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到 PCR2. 1載體上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得了正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增獲得WiLTP基因核酸序列，經(jīng)雙酶切將WiLTP亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET30a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-PhLTP;轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡(jiǎn)稱(chēng) E.coli BL21/pET30a-PhLTP ；(4)重組質(zhì)粒pET30a-PhLTP的高效表達(dá)及純化以L(fǎng)B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌 E. coli BL21/pET-30a-PhLTP經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達(dá)蛋白，其中培養(yǎng)溫度是^°C，pH 7. O ；離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細(xì)胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過(guò)金屬鎳螯合柱層析方法純化，獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明得到了可溶性、高效表達(dá)的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP。(5)重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的功能活性和應(yīng)用上述步驟(4)得到的純化的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP具有抑菌和抑制腫瘤活性， 在病原微生物感染和在腫瘤的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。
3.權(quán)利要求1 2任一一項(xiàng)所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，其特征是所述重組蛋白具有抑菌作用，在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征是所述細(xì)菌是肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大腸埃希菌(Escherichia coli Atc25922)，類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)等3禾中病原細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1 2任一一項(xiàng)所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，其特征是所述重組蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，在制備治療腫瘤藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的腫瘤為宮頸癌、食管癌和黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)，以及制備獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的方法及其在抑菌和抗腫瘤方面的應(yīng)用。所述的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因具有序列表SEQ ID NO.1中所示的堿基序列，其編碼由序列表SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列中由115個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明經(jīng)基因克隆，構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒，獲得重組菌，并利用此工程菌表達(dá)和分離純化生產(chǎn)出具有生物活性的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白。本系統(tǒng)具有可溶性表達(dá)水平高、純化工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其生物學(xué)功能，證實(shí)該重組蛋白具有明顯的抑菌作用，對(duì)多種惡性腫瘤具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，可在制備抗微生物感染和治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102533787SQ20121004286
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉東亮, 呂慧, 孫素榮, 張富春, 李婷婷 申請(qǐng)人:新疆大學(xué)