專利名稱:一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域,具體地說,是一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
我國每年新生15萬的先天性心臟病患兒。而先天性心臟病手術(shù)中需要大量血管或生物補(bǔ)片替代物。初步估算僅國內(nèi)醫(yī)療市場其前景每年約為上億元。而臨床常用的人工血管和冷凍保存同種血管無生長性且容易引起狹窄鈣化多須再次手術(shù)治療,給患者帶來莫大痛苦的同時(shí)造成大量醫(yī)療資源的浪費(fèi)。而且常用人工血管或生物補(bǔ)片多為進(jìn)口,價(jià)格極其昂貴。20世紀(jì)80年代以來,隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的發(fā)展,各種代血管移植材料被用于心血管疾病外科治療中。人們長期以來一直在尋找血管的最佳替代品,包括人工材料、生物材料以及復(fù)合材料等,但存在排斥、血栓、內(nèi)皮細(xì)胞增生、破裂、鈣化等缺點(diǎn),其治療效果仍受到很大限制。故人工代血管移植體仍不能完全取代人同種冷凍保存血管的地位和作用。中國專利文獻(xiàn)CN101327338A公開了一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細(xì)胞基質(zhì)及制備方法,取豬、兔、狗或牛的膀胱,經(jīng)消化液,低滲緩沖液、含表面活性劑的高滲緩沖液、含核酸酶的緩沖液和去離子水等處理后,再經(jīng)冷凍、凍干和滅菌后得到無菌的膀胱無細(xì)胞基質(zhì)。中國專利文獻(xiàn)CN101474426A公開了一種脫除血管組織內(nèi)細(xì)胞的血管基質(zhì)及其制備方法,提供了一種能夠脫除血管組織內(nèi)的細(xì)胞成分并最大程度保護(hù)脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性,包括脫細(xì)胞、去除去垢劑和進(jìn)行酶處理。中國專利文獻(xiàn)CN2860403Y公開了一種生物型人工血管,由經(jīng)固定劑交聯(lián)固定和去抗原處理過的動(dòng)物血管所形成的基材,以及鍵合在基材內(nèi)表面上的含有抗凝血組分的表面層組成。但是關(guān)于一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用目前還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)。本發(fā)明的再一的目的是,提供一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的另一的目的是,提供一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì), 所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括以下步驟(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用,然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩,PBS溶液振蕩沖洗;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括以下步驟(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用含EDTA O. 04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37 °C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3次,每次30 分鐘;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法,所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法如下(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率 κ/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用,然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩,PBS溶液振蕩沖洗;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。所述的制備方法包括以下步驟(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用含EDTA O. 04%的
O.25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS 溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3次,每次30分鐘;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)在制備生物血管中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、本發(fā)明以豬主動(dòng)脈作為研究對(duì)象,通過優(yōu)化制備條件,制得具有合適孔隙率、力學(xué)性能和免疫原性的凍干脫細(xì)胞血管,通過動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)證明立體構(gòu)建血管臨床血管移植的可行性,為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);
2、本發(fā)明的制備方法成本極其低廉,無疑會(huì)節(jié)省數(shù)億元的寶貴的醫(yī)療資源;
3、為組織工程主動(dòng)脈血管的臨床應(yīng)用及脫細(xì)胞血管的優(yōu)化研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指
針。
附圖I是血管預(yù)凍時(shí)溫度變化曲線。
附圖2是不同降溫速率下血管孔隙率分析。
附圖3是不同降溫速率下血管灰度值分析。
附圖4是不同預(yù)凍速率下血管α值變化曲線。
附圖5是豬主動(dòng)脈血管凍干前后免疫原性的變化。
附圖6是凍干復(fù)水血管的幼豬在體移植實(shí)驗(yàn)。
附圖7是凍干預(yù)處理提高豬主動(dòng)脈血管脫細(xì)胞效果。
附圖8是凍干預(yù)處理的脫細(xì)胞豬主動(dòng)脈血管電鏡檢測照片。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。
實(shí)施例II.血管預(yù)凍最低溫度的實(shí)驗(yàn)測量
血管冷凍干燥保存工藝的探索是進(jìn)行制備研究亟待解決的關(guān)鍵問題。本發(fā)明采用升降式微機(jī)控制程序降溫儀對(duì)血管以固定速率降溫,主要是為了考察不同的預(yù)凍速率對(duì)血管凍干保存品質(zhì)的影響,旨在探索得到一個(gè)適合血管凍干保存的工藝控制參數(shù)和流程。
目的是為了測量血管在凍干機(jī)中預(yù)凍時(shí)所能達(dá)到的最低溫度,測量得到的這個(gè)溫度就是在使用微機(jī)控制程序降溫儀給血管預(yù)凍時(shí)設(shè)置的最終溫度。由實(shí)驗(yàn)可知干燥過程中血管的溫度最低為-42. 9°C,見圖1,圖I是血管預(yù)凍時(shí)溫度變化曲線。2.不同預(yù)凍速率下血管孔隙率、灰度變化圖。見圖2和圖3,圖2、圖3分別為不同預(yù)凍速率下整個(gè)凍干過程的孔隙率、灰度變化圖。預(yù)凍速率為O. 5K/min, lK/min, 2K/min的血管凍干前后孔隙率的變化率分別為11. 9%, 16.6%, 29. 7 % ;平均灰度值的變化率分別為2. 27 %,3. 64 %,6. 36 %。降溫速率越大,變化得越明顯。3.不同預(yù)凍速率對(duì)血管力學(xué)性能的影響。血管力學(xué)性能的測定。動(dòng)脈血管使用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其進(jìn)行拉伸試驗(yàn),取寬度為7mm的方塊進(jìn)行穿刺試驗(yàn)。試驗(yàn)中質(zhì)構(gòu)儀負(fù)載采用500N的力,以lmm/min的速度對(duì)樣品進(jìn)行穿刺和拉伸。并將真空冷凍干燥后的血管在生理鹽水中浸泡2小時(shí),充分復(fù)水浙干后,取相同條件的動(dòng)脈血管進(jìn)行拉伸試驗(yàn)和穿刺試驗(yàn)。對(duì)比分析不同的預(yù)凍速率冷凍干燥前后血管力學(xué)性能的變化。見圖4,圖4是不同預(yù)凍速率下血管的α值變化曲線。預(yù)凍速率為lK/min時(shí)穿刺應(yīng)力值和周向拉伸應(yīng)力值增加幅度分別為20. 10%和32. 03%,軸向拉伸應(yīng)力減小幅度最小, 為-19. 84%。分析后認(rèn)為預(yù)凍速率為lK/min時(shí)具有最佳孔隙、孔隙率及力學(xué)性能表現(xiàn)。結(jié)果表明通過控制冷凍干燥時(shí)的降溫速率,可以控制血管內(nèi)部的孔隙大小和孔隙率,同時(shí)也能保持血管的較好的力學(xué)性能。4.豬主動(dòng)脈血管凍干前后免疫原性的變化。見圖5,圖5是豬主動(dòng)脈血管凍干前后免疫原性的變化。間接免疫熒光法分別檢測凍干血管與新鮮血管中MHC I、II類抗原表達(dá)的變化。其中A :新鮮豬主動(dòng)脈,凍干處理前大體觀;B :免疫熒光法檢測新鮮血管MHC I類抗原情況;C :免疫熒光法檢測新鮮血管MHC
II類抗原情況;D :新鮮豬主動(dòng)脈,凍干處理后大體觀;E :免疫熒光法檢測凍干血管中MHC I類抗原情況;F :免疫熒光法檢測凍干血管中MHC II類抗原情況。結(jié)果顯示血管凍干后
MHC- I、II類抗原水平明顯下降。5.主動(dòng)脈移植手術(shù)和移植后定期血管介入造影觀察血管生長情況
氣靜復(fù)合麻醉下,將凍干脫細(xì)胞處理的血管植入幼豬降主動(dòng)脈處。沿左側(cè)第四肋間進(jìn)胸,結(jié)扎1-2根肋間動(dòng)脈,阻斷降主動(dòng)脈近心端與遠(yuǎn)心端,切除一段降主動(dòng)脈,植入2cm左右的凍干輻射復(fù)水動(dòng)脈血管,連續(xù)縫合兩個(gè)吻合口,排氣,開放主動(dòng)脈阻斷鉗。止血,沖洗胸腔,鼓肺,關(guān)胸。手術(shù)的成功是后期研究的關(guān)鍵。移植手術(shù)后定期多次進(jìn)行血管介入造影觀察血管生長情況。為了驗(yàn)證凍干處理后的血管的力學(xué)強(qiáng)度是否能夠滿足應(yīng)用要求,我們將凍干的血管移植到豬體內(nèi),替代部分主動(dòng)脈,結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬可以長期存活,表明凍干處理并不影響血管的應(yīng)用。證實(shí)凍干處理后的血管雖然力學(xué)性能有所降低但能承受長期生活考驗(yàn),幼豬均長期存活7個(gè)月以上。雖然凍干處理后血管免疫原性有所下降但仍有鈣化趨勢,還要結(jié)合脫細(xì)胞化處理進(jìn)一步降低其免疫原性。見圖6,圖6是凍干復(fù)水血管的幼豬在體移植實(shí)驗(yàn)。其中A :冷凍干燥的豬主動(dòng)脈經(jīng)過重新復(fù)水處理;B :凍干處理的血管移植修復(fù)缺損;C :凍干處理后的血管移植后豬存活良好;D :三個(gè)月時(shí),行導(dǎo)管檢測,移植處依然保持暢通(箭頭所指為移植血管處)。6.血管經(jīng)凍干預(yù)處理后用低濃度去垢劑復(fù)水同時(shí)進(jìn)行脫細(xì)胞化
凍干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液(含EDTA O. 04%)在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12 小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3次,每次30 分鐘。凍干處理增加血管孔隙,提高血管通透性的同時(shí),也更有利于脫細(xì)胞溶液進(jìn)入到管壁內(nèi)發(fā)揮脫細(xì)胞作用,與未經(jīng)過凍存村里的血管相比,凍存后的血管脫細(xì)胞效率大大提高,脫細(xì)胞效果非常理想,即使管壁內(nèi)部的細(xì)胞成份也完全能夠脫除干凈。請(qǐng)參照附圖7, 附圖7是凍干預(yù)處理提高豬主動(dòng)脈血管脫細(xì)胞效果。其中A :未經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈脫細(xì)胞前HE染色;B :經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈脫細(xì)胞前HE染色;C :未經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈經(jīng)過脫細(xì)胞后HE染色,動(dòng)脈管壁內(nèi)部依然殘留有部分細(xì)胞;D :經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈經(jīng)過脫細(xì)胞后HE染色,動(dòng)脈管壁內(nèi)部未見細(xì)胞殘留;E :未經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈經(jīng)過脫細(xì)胞后 Hoechst染色,動(dòng)脈管壁內(nèi)部依然殘留有部分細(xì)胞;F :經(jīng)凍干處理的豬主動(dòng)脈經(jīng)過脫細(xì)胞后Hoechst染色,動(dòng)脈管壁內(nèi)部未見細(xì)胞殘留;G :DNA定量檢測表明血管經(jīng)過凍干處理后再脫細(xì)胞,殘留DNA含量明顯減少。7.新鮮血管、凍干血管與凍干脫細(xì)胞化后血管電鏡照片
見圖8,圖8是凍干預(yù)處理的脫細(xì)胞豬主動(dòng)脈血管電鏡檢測照片。其中A :新鮮血管透射電鏡顯示大量細(xì)胞存在;B :經(jīng)過凍干后,透射電鏡顯示依然有細(xì)胞存在,但是已經(jīng)死亡; C :凍干血管經(jīng)過O. 25%胰蛋白酶處理12小時(shí)后,透射電鏡顯示血管內(nèi)部已無細(xì)胞存在;D 新鮮血管掃描電鏡顯示大量細(xì)胞存在;E:經(jīng)過凍干后,掃描電鏡顯示依然有細(xì)胞存在,但是已經(jīng)死亡;F :凍干血管經(jīng)過O. 25%胰蛋白酶處理12小時(shí)候后,掃描電鏡顯示血管內(nèi)部已無細(xì)胞存在。電鏡檢測結(jié)果顯示,經(jīng)過凍干后,透射電鏡顯示依然有細(xì)胞存在,但是已經(jīng)死亡; 而凍干血管經(jīng)過O. 25%胰蛋白酶處理12小時(shí)后,透射電鏡和掃描電鏡都顯示血管內(nèi)部已無細(xì)胞存在。實(shí)施例2豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法
1.凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42.9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;
2.脫細(xì)胞化采用低濃度去垢劑復(fù)水基質(zhì)同時(shí)行脫細(xì)胞處理,凍干血管用O.25%胰蛋白酶PBS溶液(含EDTA O. 04%)在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3次,每次30分鐘;
3.采用步驟I的條件再次真空凍干該基質(zhì),常溫保存。本發(fā)明以豬主動(dòng)脈作為研究對(duì)象,以立體構(gòu)建血管臨床移植為遠(yuǎn)期目標(biāo)而對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行真空冷凍干燥脫細(xì)胞再凍干并細(xì)胞懸液序貫復(fù)水處理。通過真空凍干脫細(xì)胞方法處理豬主動(dòng)脈血管,旨在從傳熱傳質(zhì)、低溫生物、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等多種研究領(lǐng)域探討脫細(xì)胞動(dòng)脈基質(zhì)制備、保存及移植后修復(fù)機(jī)制。通過優(yōu)化制備條件,制得具有合適孔隙率及力學(xué)性能的凍干血管,聯(lián)合酶、化學(xué)除垢劑進(jìn)一步降低血管的免疫原性,在實(shí)驗(yàn)中研究血管凍干脫細(xì)胞過程的相關(guān)機(jī)理及立體構(gòu)建的操作流程,通過動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)研究立體構(gòu)建血管將來臨床血管移植的可行性,為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法成本極其低廉,無疑會(huì)節(jié)省數(shù)億元的寶貴的醫(yī)療資源。凍干脫細(xì)胞豬主動(dòng)脈血管基質(zhì)制備流程和該基質(zhì)體外立體構(gòu)建生物血管流程的制定,可為組織工程主動(dòng)脈血管的臨床應(yīng)用及脫細(xì)胞血管的優(yōu)化研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指針。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明方法的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充,這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì),其特征在于,所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括以下步驟(I)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率 κ/min,最終溫度-42. 9°C 對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用,然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩,PBS溶液振蕩沖洗;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì),其特征在于,所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括以下步驟(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min, 最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用含EDTAO.04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3次,每次30分鐘;(3)采用步驟(I) 的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。
3.—種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法,其特征在于,所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法如下(1)凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用O. 25%胰蛋白酶 PBS溶液作用,然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩,PBS溶液振蕩沖洗;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述的制備方法包括以下步驟(1) 凍干預(yù)處理采用預(yù)凍速率lK/min,最終溫度-42. 9°C對(duì)豬主動(dòng)脈血管進(jìn)行凍干預(yù)處理;(2)脫細(xì)胞化凍干血管用含EDTA O. 04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中作用12小時(shí),然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室溫下振蕩4小時(shí),PBS溶液振蕩沖洗3 次,每次30分鐘;(3)采用步驟(I)的條件再次真空凍干所述的基質(zhì),常溫保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2任一所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)在制備生物血管中的應(yīng)用。
全文摘要
一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì),所述的豬主動(dòng)脈真空凍干脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括采用最佳預(yù)凍速率真空凍干豬主動(dòng)脈血管得到最佳孔隙,用低濃度去垢劑復(fù)水基質(zhì)同時(shí)行脫細(xì)胞處理,再次真空凍干該基質(zhì)常溫保存。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于以豬主動(dòng)脈作為研究對(duì)象,通過優(yōu)化制備條件,制得具有合適孔隙率、力學(xué)性能和免疫原性的凍干脫細(xì)胞血管,通過動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)證明立體構(gòu)建血管臨床血管移植的可行性,為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);制備方法成本極其低廉,無疑會(huì)節(jié)省數(shù)億元的寶貴的醫(yī)療資源;為組織工程主動(dòng)脈血管的臨床應(yīng)用及脫細(xì)胞血管的優(yōu)化研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指針。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102600508SQ201210031969
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者劉萌芳, 劉錦紛, 孫錕, 張海波, 徐志偉, 曹清, 殷猛, 殷秋明, 范新東, 董凌燕, 鄭景浩, 陶樂仁 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心