專利名稱：一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因及其表達(dá)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella,E. tenella)蛋白磷酸酶基因及其表達(dá)方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是由頂復(fù)器門，艾美耳屬細(xì)胞內(nèi)原蟲寄生感染的，在養(yǎng)禽業(yè)中最常見、最有害、最致命、經(jīng)濟(jì)損傷最嚴(yán)重的一種原 蟲病。該病往往呈急性暴發(fā)，引起雞下痢、便血、貧血，以致大批死亡；慢性病例則導(dǎo)致雞群食欲減退、生長發(fā)育受阻、貧血、影響增重并降低飼料轉(zhuǎn)化率。該病以3月齡以內(nèi)的雞最易感，雛雞的發(fā)病率和死亡率均較高。病愈的雛雞生長受阻，增重緩慢，常常容易引起大腸桿菌等條件性致病菌而發(fā)病，使雞群出現(xiàn)產(chǎn)蛋能力降低、頑固性拉稀、免疫抑制，抗病力降低等癥狀。成年雞多為帶蟲者，盡管沒有明顯癥狀，但對生長性能和產(chǎn)蛋能力都產(chǎn)生了很大影響，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另外，球蟲以其生命周期短，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，傳播能力大等特點(diǎn)，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)的最頑固的病原體，防不勝防，給養(yǎng)禽業(yè)帶來的巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是第二代裂殖生殖階段，產(chǎn)生的大量的裂殖子重新入侵未感染的腸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸粘膜出現(xiàn)了扁平樣結(jié)構(gòu)，腸絨毛萎縮，大面積的壞死和糜爛塌陷，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使感染雞群排出血便，消化和吸收功能下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低，雞增重下降，誘發(fā)其他病原感染而死亡，嚴(yán)重的影響了養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。藥物防治仍然是目前防治球蟲病的主要手段，而針對耐藥性的產(chǎn)生，迫切需要抗球蟲新藥的研發(fā)，而新藥的研發(fā)需要尋找重要的作用靶標(biāo)，一般主要通過篩選來得到抑制齊U，或者通過設(shè)計抑制分子去探測靶蛋白的特性。然而藥物靶位的篩選是一個漫長的過程。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因。本發(fā)明的目的還在于提供一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因在制備抗雞球蟲病藥物物的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，具有編碼SEQ ID NO. I的氨基酸序列。所述的基因全長2562bp，含有完整的1647bp 0RF，編碼549個氨基酸，理論分子量為60822. 4Da,分子式為C2705H4235N739O803S27,等電點(diǎn)為5. 89,帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為71個，帶正電荷的氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為62個，總體偏酸性，抗原位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)有19個抗原位點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達(dá)方法，包括以下步驟以E. tenella為實(shí)驗蟲株,建立了藥物抗球蟲作用模型，以E. tenella第二代裂殖子為研究對象，構(gòu)建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差異表達(dá)cDNA消減文庫，借助cDNA微陣列技術(shù)篩選出一種地克珠利抗球蟲作用的關(guān)鍵分子，經(jīng)BlastP比對分析表明為E. tenella絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。
所述的表達(dá)方法具體包括以下步驟(一)E. tenella第二代裂殖子的制備(I)試驗?zāi)Ｐ偷慕?yōu)質(zhì)黃羽蛋公雛購自洛陽市光華種雞場，在河南科技大學(xué)試驗動物房進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔衛(wèi)生，且無任何病原體污染。實(shí)驗動物飼養(yǎng)至12日齡時，平均分為兩組，實(shí)驗14日齡，兩種均接種球蟲，分為感染對照組(接種球蟲，Omg/kg地克珠利飼料)和藥物處理組(接種球蟲，lmg/kg地克珠利飼料,從實(shí)驗96h到實(shí)驗120h)。建立地克珠利抗球蟲試驗動物模型；
(2)E. tenella第二代裂殖子的制備在感染后120h撲殺試驗雞，剪開盲腸壁，去除盲腸內(nèi)容物，用含雙抗冰冷的PBS洗去盲腸上殘余的內(nèi)容物；將洗凈的盲腸在培養(yǎng)皿中剪成約Icm3大小的碎塊，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入10倍體積的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不時的攪拌，使裂殖子充分游離出來；并經(jīng)四層滅菌紗布過濾，除去大的組織塊和雜質(zhì)；濾液經(jīng)3000r/min離心IOmin ;用PBS重懸沉淀，洗滌，3000r/min離心IOmin ;采用紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，4°C裂解lOmin，并不時的攪動，然后2500r/min離心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min離心IOmin ；用PBS將沉淀稀釋，加入Percoll分離液，配置成30% Percoll懸液；將含30%Percoll的裂殖子懸液緩慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破壞液面；3200r/min離心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液層到另一干凈的離心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min離心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min離心5min,沉淀即為獲得的第二代裂殖子；(二)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆(I)E. tenella第二代裂殖子總RNA的提取總RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol試劑提取操作說明進(jìn)行。(2)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的擴(kuò)增以消減文庫中篩選測序后的序列為EST，以按照clonetech公司SMARTer RACEcDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行基因3，和5’的擴(kuò)增，5’ RACE 3’ primer :為 5’ -GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3，，3’ RACE 5’ primer 為 5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTITTGTG-3 ’，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 I %瓊脂糖凝膠電泳分析；(3)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及與測序米用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit回收基因5’和3，的擴(kuò)增產(chǎn)物，并與PMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定；經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序；(4)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因全長序列的拼接將測序獲得的3’ RACE和5’ RACE PCR產(chǎn)物序列，利用DNAstar軟件查找擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接為全長cDNA序列；(5)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的擴(kuò)增與測序以拼接全長基因序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5. 0軟件設(shè)計上下游引物，以cDNA為模板，全長擴(kuò)增引物為Sense primer :5 ' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3 '和 Antisenseprimer :5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增全長；反應(yīng)結(jié)束后采用 QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD 19-T Vector 連接，轉(zhuǎn)化 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定；經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，序列與原序列相同；(S)E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表達(dá)(I)EtPP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以cDNA為模板，根據(jù)測序獲得序列(圖3)及表達(dá)載體pET_28a多克隆位點(diǎn)，在目的序列ORF (圖4)兩端選擇EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，
弓丨物序列為Senseprimer 5 ' -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3 '和Antisense primer :5' -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3'，利用 PCR 擴(kuò)增 EtPP 基因，對PCR回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，純化回收后，T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a細(xì)胞，挑取單克隆，PCR及測序證明EtPP基因已正確插入HIS基因的下游，命名為pET-28a-EtPP ；(2) EtPP表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a_EtPP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細(xì)胞，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在37 °C培養(yǎng)至0D260大約0. 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度為0. 8mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)，在不同的培養(yǎng)時間收集菌體，超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在；(3) EtPP蛋白的純化BL21(DE3)表達(dá)的EtPP蛋白主要以包涵體的形式存在。取上述菌體，12000r/min，4°C離心15min后取沉淀，PBS洗滌并重懸菌體，冰浴超聲后，12000r/min，4°C離心后收集沉淀，即得純凈的包涵體。然后參照His Bind樹脂純化法純化包涵體蛋白，SDS-PAGE技術(shù)檢測分析。本發(fā)明采用目前新型、低毒、廣譜、高效的抗球蟲藥地克珠利，以E. tenella為實(shí)驗蟲株，建立了藥物抗球蟲作用模型，以E. tenella第二代裂殖子為研究對象，構(gòu)建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差異表達(dá)cDNA消減文庫，借助cDNA微陣列技術(shù)篩選出一種地克珠利抗球蟲作用的關(guān)鍵分子，經(jīng)BlastP比對分析表明為E. tenella絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列，并通過RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得EtPP的全長序列，并進(jìn)行了全長基因的表達(dá)和應(yīng)用探討。本發(fā)明利用RACE技術(shù)，首次擴(kuò)增到E. tenella的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)基因，該基因全長2562bp，含有完整的1647bp 0RF，編碼549個氨基酸，理論分子量為60822. 4Da,分子式為C2705H4235N739O803S27,等電點(diǎn)為5. 89,帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為71個，帶正電荷的氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為62個，總體偏酸性?？乖稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)有19個可能的抗原位點(diǎn)。本發(fā)明將該基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-EtPP，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌BL21(DE3)系統(tǒng)中的表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在，并采用His -Bind樹脂純化法獲得重組融合蛋白EtPP，為后續(xù)開展新藥靶位的篩選和確認(rèn)奠定了理論基礎(chǔ)，解決了球蟲耐藥性的客觀難題，具有廣闊的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益。
圖I為EtPP基因Y PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為Y PCR產(chǎn)物；圖2為EtPP基因:V PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為Y PCR產(chǎn)物；圖3為EtPP基因全長序列；圖4為EtPP基因ORF PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖5為SDS-PAGE檢測重組質(zhì)粒pET_28a_EtPP在E. coli BL21 (DE3)細(xì)胞中的表達(dá)；其中，M，低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC，陰性對照(沒有進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá))；(lh，2h，4h，6h,8h,9h),不同時間誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；Su,上清；Pe,沉淀；圖6為SDS-PAGE檢測EtPP融合蛋白純化產(chǎn)物；M，低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2，蛋白純化產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。本發(fā)明的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達(dá)方法如下一、E. tenella第二代裂殖子的制備(I)試驗?zāi)Ｐ偷慕?yōu)質(zhì)黃羽蛋公雛購自洛陽市光華種雞場，在河南科技大學(xué)試驗動物房進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔衛(wèi)生，且無任何病原體污染。實(shí)驗動物飼養(yǎng)至12日齡時，平均分為兩組，實(shí)驗14日齡，兩種均接種球蟲，分為感染對照組(接種球蟲，Omg/kg地克珠利飼料)和藥物處理組(接種球蟲，lmg/kg地克珠利飼料,從實(shí)驗96h到實(shí)驗120h)。建立地克珠利抗球蟲試驗動物模型。(2)E. tenella第二代裂殖子的制備在感染后120h撲殺試驗雞，剪開盲腸壁，去除盲腸內(nèi)容物，用含雙抗冰冷的PBS洗去盲腸上殘余的內(nèi)容物；將洗凈的盲腸在培養(yǎng)皿中剪成約Icm3大小的碎塊，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入10倍體積的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不時的攪拌，使裂殖子充分游離出來；并經(jīng)四層滅菌紗布過濾，除去大的組織塊和雜質(zhì)；濾液經(jīng)3000r/min離心IOmin ;用PBS重懸沉淀，洗滌，3000r/min離心IOmin ;采用紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，4°C裂解lOmin，并不時的攪動，然后2500r/min離心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min離心IOmin ；用PBS將沉淀稀釋，加入Percoll分離液，配置成30% Percoll懸液；將含30%Percoll的裂殖子懸液緩慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破壞液面；3200r/min離心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液層到另一干凈的離心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min離心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min離心5min,沉淀即為獲得的第二代裂殖子。二、E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆(I)E. tenella第二代裂殖子總RNA的提取總RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol試劑提取操作說明進(jìn)行。(2)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的擴(kuò)增
以消減文庫中篩選測序后的序列為EST，以按照clonetech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書進(jìn)行基因 3’ 和 5’ 的擴(kuò)增，5，RACE 3，primer 為 5，-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG -3，，3，RACE 5，primer 為5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，擴(kuò)增進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳分析。(3)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及與測序米用QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 回收基因 5’(圖 I)和 3’(圖2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。(4)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因全長序列的拼接
將測序獲得的3’ RACE和5’ RACE PCR產(chǎn)物序列，利用DNAstar軟件查找擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接為全長cDNA序列(圖3)。(5)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的擴(kuò)增與測序以拼接全長基因序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5. 0軟件設(shè)計上下游引物，以cDNA為模板，全長擴(kuò)增引物為Sense primer :5 ' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3 '和 Antisenseprimer :5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增全長。反應(yīng)結(jié)束后采用 QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD 19-T Vector 連接，轉(zhuǎn)化 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，序列與原序列相同。三、E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表達(dá)(I)EtPP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以cDNA為模板，根據(jù)測序獲得序列(圖3)及表達(dá)載體pET_28a多克隆位點(diǎn)，在目的序列ORF (圖4)兩端選擇EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，引物序列為Sense primer 5/ -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3'和Antisense primer :5' -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3/，利用PCR擴(kuò)增EtPP基因，對PCR回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，純化回收后，T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a細(xì)胞，挑取單克隆，PCR及測序證明EtPP基因已正確插入HIS基因的下游，命名為pET-28a-EtPP。(2) EtPP表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a_EtPP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細(xì)胞，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在37 °C培養(yǎng)至0D260大約0. 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度為0. 8mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)，在不同的培養(yǎng)時間收集菌體，超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，如圖5。(3) EtPP蛋白的純化BL21(DE3)表達(dá)的EtPP蛋白主要以包涵體的形式存在。取上述菌體，12000r/min，4°C離心15min后取沉淀，PBS洗滌并重懸菌體，冰浴超聲后，12000r/min，4°C離心后收集沉淀，即得純凈的包涵體。然后參照His Bind樹脂純化法純化包涵體蛋白，SDS-PAGE檢測分析如圖6。本實(shí)施例的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達(dá)方法的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO. I 所示序列表SEQUENCE LISTING〈110〉河南科技大學(xué)〈120〉一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因及其表達(dá)方法和應(yīng)用<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>558 〈213〉柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因〈400〉IMAEGSDSAAISCNSAESLKREEGQIIKDSAMAVDGGGSCAAKEAGNVVPCSEKDVS 57ASAAVLERAEALKNEGNVLFKQHQYAEAVAKYSAAIDLVDEAPVDPRETQLHVFLC I14NRAFAHLRMENFGSAIIDAERALKLNPKFSKGYYRRGTGYFCLGNLKAAQRDFERV I7ICQLRGGKDADAQSRLNECKKQLRAQAFAAAIRTKQTIPASKQVLAEGLEKLFPVPA 228DYAGPVYKKGKVDEEFLQALRTWLQNPENRLHPQYAYAMAVDFIEILEPLPSLVDL 285EIPADKEITICGDVHGQFYDLLNIFTINGMPSEENPYLFNGDIVDRGSFSVEVLLM 342MVACKLAYPNHMHITRGNHETSEMNAMYGFKGEMLNKYDERLYQIFSEAFRLLPLA 399FVVNKKAFVVHGGLSRQENVTLDEIRKIDRNREPGSDVLITDLLWSDPSPLPGLTP 456SKRGVACQFGPDITEKFLKTNNLSFVIRSHEMKEAGYEVEHGGKLITVFSAPNYCD 5I3EMGNKGAFIRLKGSEMVPKFHQFTAVPHPPGPAMQYANPMLSFI558
權(quán)利要求
1.一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，其特征在于具有編碼SEQ ID NO. I的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，其特征在于所述的基因全長2562bp，含有完整的1647bp ORF,編碼549個氨基酸，理論分子量為60822. 4Da，分子式為C27tl5H4235N739O8tl3S27，等電點(diǎn)為5. 89，帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為71個，帶正電荷的氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為62個，總體偏酸性?？乖稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)有19個可能的抗原位點(diǎn)。
3.一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達(dá)方法，其特征在于包括以下步驟以E. tenella為實(shí)驗蟲株，建立了藥物抗球蟲作用模型，以E. tenella第二代裂殖子為研究對象，構(gòu)建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差異表達(dá)cDNA消減文庫，借助cDNA微陣列技術(shù)篩選出一種地克珠利抗球蟲作用的關(guān)鍵分子，經(jīng)BlastP比對分析表明為E. tenella絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達(dá)方法，其特征在于所述的表達(dá)方法具體包括以下步驟 (一)E.tenella第二代裂殖子的制備 (1)試驗?zāi)Ｐ偷慕? 優(yōu)質(zhì)黃羽蛋公雛，實(shí)驗動物飼養(yǎng)至12日齡時，平均分為兩組，實(shí)驗14日齡，兩種均接種球蟲，分為感染對照組(接種球蟲，Omg/kg地克珠利飼料)和藥物處理組(接種球蟲，Img/kg地克珠利飼料，從實(shí)驗96h到實(shí)驗120h)，建立地克珠利抗球蟲試驗動物模型； (2)E.tenella第二代裂殖子的制備 在感染后120h撲殺試驗雞，剪開盲腸壁，去除盲腸內(nèi)容物，用含雙抗冰冷的PBS洗去盲腸上殘余的內(nèi)容物；將洗凈的盲腸在培養(yǎng)皿中剪成約Icm3大小的碎塊，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入10倍體積的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不時的攪拌，使裂殖子充分游離出來；并經(jīng)四層滅菌紗布過濾,除去大的組織塊和雜質(zhì)；濾液經(jīng)3000r/min離心IOmin ;用PBS重懸沉淀，洗滌，3000r/min離心IOmin ;采用紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，4°C裂解lOmin，并不時的攪動，然后2500r/min離心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min離心IOmin ； 用PBS將沉淀稀釋，加入Percoll分離液，配置成30 % Percoll懸液；將含30%Percoll的裂殖子懸液緩慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破壞液面；3200r/min離心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液層到另一干凈的離心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min離心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min離心5min,沉淀即為獲得的第二代裂殖子； (二)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆 (1)E.tenella第二代裂殖子總RNA的提取 總RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol試劑提取操作說明進(jìn)行； (2)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3，的擴(kuò)增 以消減文庫中篩選測序后的序列為EST，以按照clonetech公司SMARTer RACEcDNAAmplification Kit說明書進(jìn)行基因3，和5’的擴(kuò)增， · 1·5，RACE 3，primer :為 5，-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3，， ·3’ RACE 5’ primer 為 5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析； (3)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及與測序 采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit回收基因5’和3’的擴(kuò)增產(chǎn)物，并與PMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定； (4)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因全長序列的拼接 將測序獲得的3’ RACE和5’ RACE PCR產(chǎn)物序列，利用DNAstar軟件查找擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接為全長cDNA序列； (5)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的擴(kuò)增與測序 以拼接全長基因序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5. O軟件設(shè)計上下游引物，以cDNA為模板，全長擴(kuò)增引物為Sense primer :5' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3'和 Antisense primer 5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增全長；反應(yīng)結(jié)束后采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD19_T Vector 連接，轉(zhuǎn)化 DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定； (S)E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表達(dá) (1)EtPP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以cDNA為模板，根據(jù)測序獲得序列及表達(dá)載體pET-28a多克隆位點(diǎn)，在目的序列ORF兩端選擇EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)， 引物序列為Sense primer :5 ' -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3 '和 Antisenseprimer 5/ -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3'，利用 PCR 擴(kuò)增 EtPP 基因，對 PCR 回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，純化回收后，T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，挑取單克隆，PCR及測序證明EtPP基因已正確插入HIS基因的下游，命名為pET-28a-EtPP ； (2)EtPP表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá) 將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EtPP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細(xì)胞，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在37°C培養(yǎng)至0D260大約O. 4 O. 6時，加入IPTG至終濃度為O. 8mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)，在不同的培養(yǎng)時間收集菌體，超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在； (3)EtPP蛋白的純化 BL21(DE3)表達(dá)的EtPP蛋白主要以包涵體的形式存在。取上述菌體，12000r/min，4°C離心15min后取沉淀，PBS洗滌并重懸菌體，冰浴超聲后，12000r/min，4°C離心后收集沉淀，即得純凈的包涵體；然后參照His · Bind樹脂純化法純化包涵體蛋白，SDS-PAGE進(jìn)行檢測分析。
5.一種利用柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因制備抗雞球蟲病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因及其表達(dá)方法和應(yīng)用。其中，柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，具有編碼SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本發(fā)明利用RACE技術(shù)，首次擴(kuò)增到E.tenella的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)基因，該基因全長2562bp，含有完整的1647bp ORF，編碼549個氨基酸，理論分子量為60822.4Da，分子式為C2705H4235N739O803S27，等電點(diǎn)為5.89，帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為71個，帶正電荷的氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為62個，總體偏酸性?？乖稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)有19個可能的抗原位點(diǎn)。本發(fā)明將該基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-EtPP，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌BL21(DE3)系統(tǒng)中的表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在，并采用His·Bind樹脂純化法獲得重組融合蛋白EtPP，為后續(xù)開展新藥靶位的篩選和確認(rèn)奠定了理論基礎(chǔ)，解決了球蟲耐藥性的客觀難題，具有廣闊的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A61K48/00GK102676554SQ20121001085
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者劉梅, 周變?nèi)A, 孔濤, 王國永, 王宏偉, 趙振升, 郝雪琴 申請人:河南科技大學(xué)