利用遺傳標志物和陣列預(yù)測糖尿病相關(guān)并發(fā)癥風險的方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：利用遺傳標志物和陣列預(yù)測糖尿病相關(guān)并發(fā)癥風險的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷或檢測個體中疾病、疾病狀況或病癥，特別是糖尿病腎并發(fā)癥，包括終末期腎病(ESRD)以及其他心血管疾病的個體遺傳易感性的方法、試劑盒和陣列。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病是糖尿病患者發(fā)病和致死的主要原因。隨著糖尿病在發(fā)展中國家和發(fā)達國家中日益流行，糖尿病目前是終末期腎病(ESRD)的主要致病原因。亞洲處于2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)的流行中123。最近大規(guī)模的流行病學調(diào)查估計，在中國有9420萬成年人受糖尿病侵襲，另外I億4820萬成人患有前驅(qū)糖尿病4。腎衰或ESRD是2型糖尿病患者致死的重要原因56。特別是亞洲人群似乎處于糖尿病腎病(DKD)的風險中。在MAP研究中，患有2型糖尿病和高血壓的亞洲人患者中，有40%存在微量白蛋白尿，20%存在大量白蛋白尿7。發(fā)展成ESRD可以通過積極降低多個目標而有效地減慢，包括血壓、血糖控制、脂質(zhì)參數(shù)以及調(diào)控腎素-血管緊張素系統(tǒng)的因子。然而，通常不可能預(yù)期哪個患有糖尿病的個體處于增加的發(fā)展成腎并發(fā)癥，特別是ESRD的風險中。蛋白激酶C (PKC) _β是參與細胞信號轉(zhuǎn)導的重要分子，已涉及到糖尿病微血管并發(fā)癥以及糖尿病心肌病的發(fā)展14151617。在糖尿病動物模型中，已發(fā)現(xiàn)PKC-β的藥理抑制在標準化血流動力學變化、細胞外基質(zhì)(ECM)積累、腎小球損傷的組織學特征以及減輕蛋白尿癥中是有效的18192°。缺乏 PKC-β的小鼠暴露于高血糖癥時免受腎小球肥大、氧化應(yīng)激和蛋白尿癥21。在隨機臨床試驗中，PKC-β的抑制劑降低了用ECEI或ARB最佳治療的糖尿病患者中腎小球濾過率和蛋白尿的損失22。這些數(shù)據(jù)支持了 PKC-β在DKD發(fā)病機制中的重要作用。PKC- β的兩種亞型——PKC- β I和PKC- β II都由染色體16短臂上的PKC- β I基因(PRKCB)編碼。在PRKCB的啟動子區(qū)攜帶2個單核苷酸多態(tài)性(SNP)的I型糖尿病患者(胰島素依賴型糖尿病)具有腎病的風險增加2324。簡述本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，PKC-β I (PRKCB)基因及相關(guān)調(diào)控區(qū)中的某些單核苷酸多態(tài)性(SNP)與以下疾病的發(fā)展相關(guān):糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。因而，SNP對于診斷個體疾病發(fā)展的遺傳傾向的方法和試劑盒，以及進一步對于治療或預(yù)防疾病的方法是有用的。因此，本文一方面提供了用于診斷個體選自以下的疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的方法:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓,缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意夕卜，所述方法包括分析至少一種多核苷酸來檢測選自以下的遺傳多態(tài)性:PKC-13 1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它們的任意組合，其中至少一種所述遺傳多態(tài)性的存在指示個體患有所述疾病、病癥或疾病狀況，處于患所述疾病、病癥或疾病狀況的風險中，或疑似患有所述疾病、病癥或疾病狀況。本文另一方面提供了用于診斷個體選自以下疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的試劑盒或陣列:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病,如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外，所述試劑盒或陣列包括用于檢測從個體獲得的含有至少一種多核苷酸的樣品的遺傳多態(tài)性的試劑。本文另一方面提供了用于治療或預(yù)防具有本發(fā)明所檢測的至少一種遺傳多態(tài)性的個體中選自以下疾病、疾病狀況或病癥的方法:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病,高血壓,缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外，所述方法包括給予所述個體抵消所述個體中任何一種所述多態(tài)性的效應(yīng)的化合物，其中所述疾病、疾病狀況或病癥選自:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。在以下提供的詳述和附圖中將進一步顯而易見本發(fā)明適用的范圍。但是應(yīng)當理解的是，以下詳述和實施例 ，雖然表明了本發(fā)明的實施方案，但是僅以示例說明的方式給出，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)以下詳述顯而易見本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化或修飾。本申請引用的所有出版物、專利、專利申請和其它參考文獻都通過引用以其整體并入本文，如同每一單獨的出版物、專利、專利申請和其它參考文獻都被具體且單獨地指明通過引用并入一樣。附圖簡述

圖1.根據(jù)風險型等位基因數(shù)目的新發(fā)ESRD的累積概率，用常規(guī)風險因子[性別、年齡、糖尿病持續(xù)時間、收縮壓和舒張壓、HbAlc、總膽固醇、甘油三酯的自然對數(shù)、eGFR、AER的自然對數(shù)、視網(wǎng)膜病(有/無)和藥物應(yīng)用(是/否)]的平均值進行了調(diào)整。選擇三個(顯性模型rs3760106，隱性模型rs7404928和加性模型rs4787733)顯著且獨立的(r2〈0.8)SNP來計算ESRD風險型等位基因的數(shù)目。風險型等位基因類別的攜帶者的總數(shù)目在括號內(nèi)指明。每次隨訪時間點處于由基因型分等級的風險中的個體數(shù)目在下面的水平軸上指明。定義本文所使用的術(shù)語“患者”和“個體”并不限于人類，而是除了人類以外還意圖包括所有脊椎動物。在本文公開的一些實施方案中，術(shù)語“患者”和“個體”是指世界上的任何人群或任何種族，如亞洲人血統(tǒng)，包括中國人血統(tǒng)或出身。在其他實施方案中，患者是2型糖尿病患者，如中國人血統(tǒng)的2型糖尿病患者。
本文所使用的術(shù)語“遺傳傾向(genetic predisposition) “遺傳易感性(genetic susceptibility) ”以及“易感性”均指單獨的個體患有特定疾病、病癥或疾病狀況，處于患特定疾病、病癥或疾病狀況的風險中，或疑似患有特定疾病、病癥或疾病狀況的可能性。例如，易感性或傾向增加的個體比平均個體患病的可能性高，而傾向降低的個體比平均個體患病的可能性低。本文所使用的術(shù)語“基因”意指足以編碼具有期望功能的轉(zhuǎn)錄本或蛋白的任何量的核酸材料。因而，其包括但不限于基因組DNA、cDNA、RNA以及經(jīng)基因改造成在需要的條件下實現(xiàn)期望的表達水平的核酸。因此，其包括融合基因(編碼融合蛋白)、完整的基因組基因以及融合至異源啟動子、操縱子、增強子和/或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的DNA序列。該術(shù)語指含有基因的整個轉(zhuǎn)錄區(qū)和全部調(diào)控區(qū)的整體?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)包括基因的全部外顯子和內(nèi)含子序列，包括選擇性剪切的外顯子和內(nèi)含子，因而除了基因的多肽編碼區(qū)之外，基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)還包含轉(zhuǎn)錄的RNA中存在的調(diào)控區(qū)及5’和3’非翻譯區(qū)。本文所使用的術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性”、“SNP”和“遺傳多態(tài)性”是當基因組序列中諸如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)的核苷酸變成另一核苷酸時出現(xiàn)的DNA序列變異或遺傳變體。SNP是DNA序列中的偶然變異；全人類中絕大部分DNA序列是相同的，如本發(fā)明蛋白激酶Ci3 I基因的登錄號RefSeq NM_002738。SNP或其他變體還可能存在于不含基因的基因組區(qū)域中。它們代表負責人類遺傳變異性的基因組熱點。術(shù)語SNP可以與術(shù)語“遺傳變體”或“變體”交換使用，其存在于種群中至少一個個體的特定遺傳基因座且區(qū)別于絕大部分DNA序列中相應(yīng)的參考類型。本文所使用的術(shù)語“單體型”指通常一起遺傳的遺傳變體或標志物(“等位基因”)的任意組合。單體型可包含兩個或多個等位基因，并且包含單體型的基因組區(qū)的長度可在少數(shù)幾百個堿基至多達好幾百個千堿基之間變化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的，相同的單體型可以通過確定限定來自不同的核酸鏈的等位基因的單體型進行不同的描述。例如，由本發(fā)明的SNP標志物限定的單體型TTA與由另一條鏈確定等位基因的單體型TAA相同。本文所描述的單體型差異存在于具有增加的患前述疾病或并發(fā)癥中的一種或多種風險的患者中。因此，這些單體型具有對腎病及其并發(fā)癥的風險評估、診斷和預(yù)后的診斷價值。檢測單體型可以通過本領(lǐng)域內(nèi)用于檢測多態(tài)性位點的核苷酸的已知方法來完成。除非上下文明確指明并非如此，本申請使用的單數(shù)形式“一個(a) ”、“一種(an) ”和“所述(the)”包括復數(shù)引用。特別是使用不定冠詞時，除非上下文要求并非如此，說明書應(yīng)被理解為考慮復數(shù)以及單數(shù)。本文所使用的術(shù)語“約”或“大約”結(jié)合數(shù)字使用時，指所提到的數(shù)字的1、5或10%之內(nèi)的任何數(shù)字。在整篇說明書中提到“一個實施方案”或“實施方案”或“在另一實施方案中”或“一些實施方案”或“在某些實施方案中”，意指結(jié)合實施方案所描述的具體指示對象的特征、結(jié)構(gòu)或特性包括于至少一個實施方案中。因而，整篇說明書中不同地方出現(xiàn)的短語“在一個實施方案中”或“在實施方案中”或“在另一實施方案中”或“在一些實施方案中”未必全部指同一實施方案。此外，特定的特征、結(jié)構(gòu)或特性可以在一個或多個實施方案中以任意適合的方式結(jié)合。實施方案詳述本文一方面提供了用于診斷個體中選自以下疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的方法:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ；由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。用于診斷個體中所述疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的方法包括分析至少一種多核苷酸來檢測選自以下的遺傳多態(tài)性:ΡΚΟβ I基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它們的任意組合，其中至少一種所述遺傳多態(tài)性的存在指示個體患有所述疾·病、病癥或疾病狀況，處于患所述疾病、病癥或疾病狀況的風險中，或疑似患有所述疾病、病癥或疾病狀況。在一實施方案中，所述方法還包括從個體獲得含有至少一種多核苷酸的樣品的步驟。在另一實施方案中，如果所述樣品已被收集且是在個體之外，則可在體外實施所述方法。在一些實施方案中，所述方法包括分析至少一種多核苷酸來檢測選自以下的的至少一種遺傳多態(tài)性:ΡΚΟβ I基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，以及rs4787733的A等位基因。在一個實施方案中，所述方法包括檢測由3種變體或SNP組成的單體型，所述3種變體或 SNP 如 rs3760106,rs7404928 和 rs4787733 的變體(即 TTA) ；rs2575390, rs7404928和rs4787733的變體(即GTA)。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測由3種變體或SNP組成的單體型，所述3種變體或SNP由rs3760106和rs2575390的變體以及rs7404928或rs4787733的另一變體組成。在本文公開的另一實施方案中，所述方法包括檢測由4種變體或SNP組成的單體型，所述 4 種變體或 SNP 分別是 rs3760106，rs2575390, rs7404928 和 rs4787733。本文另一方面提供了用于診斷個體中選自以下疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的試劑盒或陣列:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外，所述試劑盒或陣列包含用于檢測由所述個體獲得的含有至少一種多核苷酸的樣品的遺傳多態(tài)性。本文公開的又一方面提供了用于治療或預(yù)防具有本發(fā)明檢測的至少一種遺傳多態(tài)性的個體選自以下疾病、疾病狀況或病癥的方法:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病，特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病,高血壓,缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。治療或預(yù)防本文所公開的疾病、疾病狀況或病癥的方法包括給予個體抵消個體中任何一種所述多態(tài)性的效應(yīng)的化合物，其中所述疾病、疾病狀況或病癥選自:糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或I型糖尿病的腎病,特別是由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ;由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病,如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。在本發(fā)明的治療方法的實施方案中，所述化合物包括用于抑制至少一種所述SNP的因子，其選自抑制性RNA、抗體、反義核酸、以及用于降低血壓、血糖控制、脂質(zhì)參數(shù)的因子或藥物，以及用于調(diào)控腎素-血管緊張素系統(tǒng)的因子或藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，能夠治療以上提及的疾病，減輕以上提及的疾病癥狀，或抑制DKD或ESRD進展的任何因子都可以用于給予個體。雖然用數(shù)字表示的SNP染色體位置可能會隨著注解目前人類基因組結(jié)構(gòu)而變化，但是SNP識別信息如可變的等位基因和指定SNP的側(cè)翼核苷酸序列將保持不變。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認識到，對存在于個體核酸的本文所列的一種或多種SNP中的核苷酸的分析，可以利用現(xiàn)有技術(shù)中分配至本文公開列舉的SNP的rs ID的序列信息，通過能夠確定存在于多態(tài)性位點中的核苷酸的任何方法或技術(shù)來進行。本領(lǐng)域顯而易見的是，多態(tài)性中存在的核苷酸可以由任一核酸鏈或雙鏈來確定。本文公開的診斷試劑盒(如試劑盒)或陣列包含試劑或材料，以及任選地，用于評估一種或多種SNP以進行糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的風險評估、診斷或預(yù)后并優(yōu)化治療建議的方案或說明書。對試劑盒有用的試劑和材料包括但不限于，本文所描述的PCR引物，雜交探針和引物(如標記的探針或引物)，等位基因特異性寡核苷酸，用于SNP標志物基因分型的試齊U，用于檢測標記分子的試劑，限制酶(如用于RFLP分析)，DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA連接酶，標志物酶，能夠與改變或未改變(天然)的多肽相結(jié)合的抗體，用于擴增來自一種或多種SNP的核酸片段的工具，用于分析一種或多種糖尿病并發(fā)癥或ESRD相關(guān)的SNP的核酸序列的工具，或者用于分析由包含這種SNP的基因編碼的多肽的一個或多個氨基酸殘基序列的工具等。在一個實施方案中，診斷對糖尿病相關(guān)并發(fā)癥或ESRD易感性的試劑盒包含用于檢測存在于一種或多種SNP標志物中的核苷酸的引物和試劑,所述一種或多種SNP標志物選自個體核酸 PKC-β I 基因中的 rs3760106, rs2575390, rs7404928 和 rs4787733。與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥診斷患有糖尿病(尤其是2型糖尿病)的人群中，多于90%具有許多潛在的并發(fā)癥。受糖尿病侵襲的人群中，一半死于由該疾病引發(fā)的并發(fā)癥。通過本發(fā)明的方法，試劑盒或陣列涉及，診斷或檢測的并發(fā)癥包括但不限于:1.心血管疾病心血管疾病是糖尿病相關(guān)死亡的主導原因。由于患有糖尿病的人群中卒中或心肌梗死的風險提高超過2倍，患有糖尿病的人群中的大部分死亡由被認為是主要的大血管并發(fā)癥的心臟病或卒中導致。具有降低的估算腎小球濾過率(eGFR)的糖尿病(尤其是2型糖尿病)患者或個體將處于患心血管疾病，甚至是心衰的高風險中。

2.糖尿病腎病腎臟停止運作時出現(xiàn)終末期腎病(ESRD)，這最終導致需要移植或定期透析，這兩項都是極其昂貴的方法。糖尿病占由于腎臟的微血管損傷而引起的ESRD病例的大約50%。3.糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病還是人失明的主要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變被認為是微血管并發(fā)癥的一種類型。4.糖尿病神經(jīng)病變估計多于50%的患有糖尿病的人群還可能遭受神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引起足或手感覺受損或疼痛，減慢胃消化食物，腕管綜合征及其他神經(jīng)問題。糖尿病神經(jīng)病變的重癥通常與外周血管大血管和微血管疾病相結(jié)合，患者可能必須進行下肢截肢。懷孕，昏迷和對機會性感染疾病的急性易感性的并發(fā)癥同樣是昂貴的糖尿病相關(guān)疾病。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所涉及的并發(fā)癥選自諸如ESRD的糖尿病腎并發(fā)癥和心血管疾病。樣品的制備PKC- β I基因中可能影響疾病易感性的遺傳變體或SNP的存在通過從這種變體的單個個體篩選至少一種核酸序列來確定。核酸序列可以是DNA或RNA。為了測定基因組DNA，可以使用含有基因組DNA的幾乎任何生物樣品(如不純的紅細胞)。例如，但并非限制，基因組DNA可以方便地獲自血液、精液、唾液、淚液、尿液、排泄物、汗液、口腔細胞、皮膚或毛發(fā)。為了利用cDNA或mRNA測定，靶核酸必須獲自表達該靶序列的細胞或組織。一種優(yōu)選的DNA來源和含量是3至30ml的抗凝全血，因為由這種樣品中的白細胞可以提取足夠的DNA來進行本文考慮的多次重復分析。本文描述的許多方法需要擴增來自靶樣品的DNA。這可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來完成，但是優(yōu)選通過 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。進行PCR的條件優(yōu)化必須由各反應(yīng)來確定，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過多試驗即可完成。通常，進行PCR的方法可見于 Ausbel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 3.sup.rded.，Wiley, 1995; and Innis et al., eds., PCR Protocols, Academic Press, 1990 中。其它擴增方法包括連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)(參見Wu and Wallace, Genomics,4:560-569, 1989;Landegren et al.，Science, 241:1077-1080，1988)，轉(zhuǎn)錄擴增(Kwohet al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:1173-1177, 1989),自主序列復制(Guatelli etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 87:1874-1878，1990)，以及基于核酸的序列擴增(NASBA)。后面兩種擴增方法涉及基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)，其分別以大約30或100比I的比率產(chǎn)生作為擴增產(chǎn)物的單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)。多態(tài)性檢測多態(tài)性檢測涉及為了診斷或流行病學的目的，確定個體中存在哪種形式的多態(tài)性。檢測技術(shù)包括基于PCR的技術(shù)或涉及在MassARRAY平臺(Sequenom，SanDiego, California)上通過MALD1-T0F質(zhì)譜分析來檢測引物延伸的多重產(chǎn)物的方法。已開發(fā)了幾種方法來檢測已知的SNP。這些測定中的許多已由Landegren等(GenomeRes.,8:769-776, 1998)綜述，在此僅進行簡要的回顧。一種測定被稱為陣列雜交測定，其實例是多重等位基因特異性的診斷測定(MASDA)(美國專利號 5，834，181; Shuber et al.，Hum.Molec.Genet.,6:337-347，1997)。對影響限制性位點的SNP的高通量篩選可以通過微量滴定陣列對角線凝膠電泳(MADGE)來實現(xiàn)(Day and Humphries, Anal.Biochem., 222:389-395, 1994)。其它的SNP測定取決于聚合酶和連接酶的錯配特征。這允許利用特異設(shè)計的寡核苷酸，通過被稱為PCR擴增特異性等位基因(PASA) (Sommer et al., Mayo Clin.Proc., 64:1361-13721989; Sarker et al., Anal.Biochem.1990)，等位基因特異性擴增(ASA)，等位基因特異性PCR以及擴增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS) (Newton et al.，Nuc.AcidsRes., 1989; Nichols et al., Genomics, 1989; Wu et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989)的多種方法，使用PCR快速檢測DNA中的單個堿基變化。通過DNA連接酶連接能與靶DNA序列雜交的兩段寡核苷酸對接近連接位點，特別是3’末端的錯配非常靈敏。已在寡核苷酸連接測定(OLA; Landegren etal.，Science, 241:1077-1080，1988)和連接酶鏈式反應(yīng)(LCR; Barany, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 88:189-193，1991)中利用這種靈敏性。SNP檢測的被稱為微測序的另一方法中，使用由聚合酶以靶標依賴的方式在緊接單一引物的下游(3’)添加特異性核苷酸來確定存在哪種等位基因(美國專利號5，846，710)。以上討論的檢測SNP的方法僅是示例性的，并不意圖窮舉。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠預(yù)見在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)的其它檢測SNP的方法。SNP 在本發(fā)明中，選擇PRKCB基因(登錄號:NM_002738)來確定個體中疾病、疾病狀況或病癥的易感性，特別是本文所述的疾病、病癥或疾病狀況的易感性。在一實施方案中，包含 rs3760106，rs2575390，rs7404928 和 rs4787733 中的至少一種的標簽 SNP 負責個體中所述疾病、病癥或疾病狀況的易感性。本文所述的方法，試劑盒和陣列涉及檢測 rs3760106, rs2575390, rs7404928 和 rs4787733 的遺傳基因座的 SNP。在一個實施方案中，本文所述的方法，試劑盒和陣列涉及檢測包含rs3760106，rs2575390, rs4787733和rs7404928中的至少一種，至少兩種或至少三種的遺傳基因座的SNP。SNP與對疾病、疾病狀況或病癥的遺傳傾向相關(guān)，所述疾病、疾病狀況或病癥包括但不限于非胰島素依賴型糖尿病，胰島素依賴型糖尿病，由非胰島素依賴型糖尿病引起的終末期腎病，由非胰島素依賴型糖尿病引起的高血壓，由非胰島素依賴型糖尿病的高血壓引起的終末期腎病，由非胰島素依賴型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，以及由胰島素依賴型糖尿病引起的終末期腎病。雖然本文公開的方法或試劑盒可以用于從患有或不患有糖尿病的個體獲得的樣品，但是優(yōu)選用于患有2型糖尿病的個體。個體可以是任何種族群，如亞洲人，包括中國血統(tǒng)。對年齡和性別進行調(diào)整之后，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)具有遺傳易感性的風險隨著風險基因型或SNP的數(shù)目增加而逐步且顯著地增加。與具有O或I種風險基因型的那些患者相t匕，具有3或4種風險基因型或SNP的患者對DKD或ESRD的風險增加1.5-2.0倍。具體地，由3種變體(如rs3760106，rs7404928和rs4787733)組成的單體型的應(yīng)用，表明與具有O或I種風險基因型的那些個體相比，攜帶賦予風險的單體型(如rs3760106，rs7404928和rs4787733的TTA)的個體與終末期腎病的風險增加大約1.5至2.0倍或更高(對于rs3760106，rs7404928和rs4787733的TTA，大約1.89倍)相關(guān)，而3種各自變體的保護型(如rs3760106，rs7404928和rs4787733的CCG)等位基因的攜帶者免于發(fā)展成糖尿病腎并發(fā)癥。發(fā)展成終末期腎病的風險隨著PRKCB基因中風險型等位基因數(shù)目的增加而增力口。例如，與具有O或I種風險型等位基因的患者相比，具有4種風險型等位基因(即rs3760106, rs2575390, rs4787733和rs7404928)的患者對終末期腎病的調(diào)整風險高于6倍(95%CI，2.00-18.31)。與攜帶O或I種風險型等位基因的個體相比，攜帶4種風險型等位基因的個體中終末期腎病的發(fā)生率增加。例如，終末期腎病的發(fā)生率為:具有O或I種風險型等位基因的個體中 ，每年4.4/1000人(95%CI，0.5-8.2)，相比攜帶4種風險型等位基因(即 rs3760106, rs2575390, rs4787733 和 rs7404928)的個體中，每年 20.0/1000 人(95%CI, 8.8-31.1)。應(yīng)當理解的是，可將以上提及的一種或多種基因型用于開發(fā)與其它已知的用于預(yù)測糖尿病并發(fā)癥風險的臨床、生化和遺傳學聯(lián)合使用的陣列，所述糖尿病并發(fā)癥包括中國血統(tǒng)或世界其他種族的糖尿病患者的腎病和ESRD，并且通過包括集中監(jiān)測、藥物和非藥物治療的多層面方法，這些基因型或其等同的陣列可用于鑒定糖尿病和/或糖尿病ESRD風險個體的風險改變。本發(fā)明將通過以下實施例作進一步的描述。
實施例方法研究參與者我們的研究群體由來自香港糖尿病登記處(Hong Kong DiabetesRegistry, HKDR)于1995至1998年登記的1338名不相關(guān)的2型糖尿病患者組成。所有個體具有居住在香港的中國南方漢族血統(tǒng)。將典型的I型糖尿病患者(定義為急性表現(xiàn)出糖尿病酮酸癥，重度酮尿癥(>3+)，或診斷I年內(nèi)持續(xù)需要胰島素)排除在外。此外，將具有不完整的臨床信息(N=4)，隨訪期少于3年(N=145)，基線需要透析(N=I)，或登記時患有ESRD (N=16)[定義為估算腎小球濾過率(eGFR)小于15ml/分鐘/1.73m2]的患者排除在夕卜。已描述了研究設(shè)計、確定、研究個體的入選標準和基因分型627。對于本研究，包括總共1172名不相關(guān)的2型糖尿病患者(平均(土SD)年齡56.0± 11.9歲，41.3%男性，疾病持續(xù)
8.5±6.7 年)。驗證群體由來自香港糖尿病登記處招募的其他個體組成。以與原始群體相同的方式將包括在重復群體中的個體招募至登記處，但是招募從1998年開始。將登記時患有慢性腎病的患者排除在驗證群體之外。為了橫向研究PRKCB基因型與腎功能定量測定結(jié)果之間的相關(guān)性，我們從上海糖尿病研究所(Shanghai Diabetes Institute)的住院患者數(shù)據(jù)庫招募了 1，892名不相關(guān)的中國人2型糖尿病患者28。本研究經(jīng)過香港中文大學臨床研究道德委員會和上海交通大學道德委員會批準。獲得所有參與者的書面知情同意書。臨床研究和結(jié)果禁食過夜之后的早晨，對所有研究參與者進行檢查。對包括體重和身高，腰圍和血壓的人體測量參數(shù)進行了測量。采集空腹血樣測量血糖、HbA1。和血脂概況(總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，HDL和LDL膽固醇)。高血壓定義為血壓彡130/85mmHg或使用抗高血壓藥物[不包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素受體阻斷劑(ARB)]，或者使用ACEI或ARB。使用定時的尿液收集物(4或24小時)來測定尿白蛋白排泄率(AER)。利用通過以下進一步為中國人調(diào)整的腎臟病飲食修正(MDRD)開發(fā)的簡短公式來評估腎小球濾過率(eGFR):eGFR= 186X [SceX0.01 Γ1154Χ [年齡]_0.203 χ
X [1.233如果是中國人]，其中Sra是以μ mol/Ι表示的血清肌酐，1.233是為中國人群調(diào)整的系數(shù)29。同時記錄所有研究個體的藥物使用，包括口服降血糖劑和胰島素治療?？垢哐獕核幬锇ㄖ该饔糜诟哐獕旱乃蟹N類的藥物，除了 ACEI/ARB。降血脂藥物包括他汀類和貝特類藥物。于2005年7月30日，根據(jù)醫(yī)院管理局中央計算機系統(tǒng)(Hospital AuthorityCentral Computer)的數(shù)據(jù)庫(其記錄了所有公共醫(yī)院的住院信息)審查所有臨床終點，包括入院和死亡。這些數(shù)據(jù)庫，包括香港死亡登記，通過唯一的識別號碼一香港身份證號(這是對全部香港居民的強制要求并供所有政府部門和主要組織使用)來匹配。按照國際疾病分類第9版修訂代碼，ESRD被定義為I)由糖尿病伴有腎臟損害(代碼250.4)，慢性腎衰竭(代碼585)或不明確的腎衰竭(代碼586)引起的死亡，或2)非致命性慢性腎衰竭(代碼585)或不明確的腎衰竭(代碼586)，或3)透析(I⑶-9程序代碼:39.95)或腹膜透析(ICD-9 程序代碼:54.98)，或 4)隨訪 eGFR〈15ml/ 分鐘 /1.73m2。在驗證群體中，我們 將慢性腎病(CKD)定義為I)由糖尿病伴有腎臟損害(Code250.4)，慢性腎衰竭(代碼585)或不明確的腎衰竭(代碼586)引起的死亡(僅原則上診斷)，或2)非致命性慢性腎衰竭(代碼585)或不明確的腎衰竭(代碼586)，或3)透析(ICD-9程序代碼:39.95)或腹膜透析(ICD-9程序代碼:54.98)，或4)隨訪eGFR〈60ml/分鐘/1.73m2。對于驗證群體，以前面所述用于原始群體相同的方法，于2008年12月31日，根據(jù)醫(yī)院管理局中央計算機系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，審查所有臨床終點，包括入院和死亡。基因分型基于特異針對漢族(CHB)人群的III期HapMap數(shù)據(jù)庫(HapMap發(fā)布27 [2009年2月],NCBI Build36;dbSNP b126)，我們從跨越PRKCB(登錄號:NM_002738)上游和下游 2kb的 388kb 區(qū)域(染色體 16:23，752，823-24，141，063bp)選擇了 18 個 SNP。這些 SNP 中，利用Haploview (v4.1)程序中的Tagger算法選擇r2〈0.8且最小等位基因頻率(MAF)彡0.05的 12 個標簽 SNP (rs7404928, rs3785394, rs3785391, rsl20908, rs4788423, rs4787733, rs198198，rs380932, rs429342, rsl015408, rs3785380, rs3785378)。根據(jù)“常見疾病-常見變體假說”，假定常見疾病具有常見的病因變體(具有最小等位基因頻率(MAF) ^ 0.05的變體)，因而我們集中于研究本研究中的常見遺傳變體的效應(yīng)。此外，具有r2彡0.8的SNP由于它們的信息80%重疊而被認為是多余的，因此僅選擇它們中的一個將更合算。此外，我們選擇了具有來自前期研究的暗示性的相關(guān)證據(jù)的6個SNP(rs3760106，rs2575390, rs3900007，rs3900008, rs432998和rs3729904)2324，所以利用基因組DNA，于2009年對所有研究個體的總共18個SNP進行了基因分型。在麥吉爾大學(McGill University)和魁北克基因組創(chuàng)新研究中心(GenomeQuebec Innovation Centre),利用引物延伸多重產(chǎn)物并通過Sequenom MassARRAY平臺(San Diego, CA, USA)的MALD1-T0F質(zhì)譜檢測進行了基因分型。所有SNP符合代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡定律(P>0.05)，如由PLINK精確檢驗所評估31?？偟幕蛐蜋z出率(call rate)是99.3%?；蚍中途_度通過在14個重復盲樣中顯示>99.6%的總一致率來驗證。利用 MassARRAY iPLEX 系統(tǒng)(MassARRAY Compact Analyzer, Sequenom, SanDiego, CA, USA)對來自上海的樣品進行基因分型。生物信息學分析和功能注釋為注釋PRKCB內(nèi)被基因分型的基因座的可能潛在的功能，通過以下可利用的生物信息學工具，對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進化保守序列，CpG島和反式調(diào)控元件的數(shù)據(jù)進行評估。從dbSNP130對這些SNP的基因組位置(Ensembl Build40, NBCI v36, hgl8)進行作圖，并在加州大學圣克魯茲分校(University of California Santa Cruz)人類基因組瀏覽器上進行追蹤。在UCSC基因組瀏覽器上選擇CpG島，Uff組蛋白修飾區(qū)32和PRKCB編碼區(qū)的數(shù)據(jù)。通過CisRED數(shù)據(jù)庫鑒定啟動子區(qū)的保守序列33。由PReMOD預(yù)測基因中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件34。統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)酌情以百分比，平均值土SD或中值(四分位距)來表示。由于偏態(tài)分布，甘油三酯和AER被轉(zhuǎn)換為自然對數(shù)。通過卡方檢驗(針對分類變量)和非配對學生t-檢驗或Wilcoxon秩和檢驗(針對連續(xù)變量)進行組間比較。加性、顯性和隱性遺傳模型的PRKCB多態(tài)性與ESRD之間的關(guān)系通過調(diào)整基線常規(guī)風險因子的Cox比例風險回歸模型來檢驗，所述常規(guī)風險因子包括性別、年齡、糖尿病持續(xù)時間、收縮壓和舒張壓、HbA1。、總膽固醇、甘油三酯和AER的自然對數(shù)、eGFR、視網(wǎng)膜病(有/無)和藥物應(yīng)用(是/否)。加性模型假定偶見等位基因施加累加效應(yīng)，所以具有0、1或2個風險型等位基因的攜帶者分別會無效應(yīng)、有一些效應(yīng)及具有最大的病因效應(yīng)。顯性模型假定具有偶見等位基因(純合子和雜合子)的所有攜帶者會有病因效應(yīng)，而隱性模型假定只有具有兩個偶見等位基因(純合子)的攜帶者會有病因效應(yīng)。顯示具有95%置信區(qū)間(Cl)的風險比(HR )。我們利用排列法而不是錯誤發(fā)現(xiàn)率法對加性、顯性和隱性遺傳模型的SNP的多重比較進行了校正。選擇從這三個模型獲得的最大檢驗統(tǒng)計量(MAX統(tǒng)計量)35。由于在零假設(shè)下MAX統(tǒng)計量的分布是未知的，對所有18個SNP進行基因分型的10，000次排列之后，通過MAX統(tǒng)計量的經(jīng)驗分布來評估實驗性顯著性。利用Haploview,計算所有樣品的配對連鎖不平衡量。利用Haploview中執(zhí)行的單體型特異性檢驗來比較患有新發(fā)終末期腎病的患者和未患有新發(fā)終末期腎病的患者之間的單體型頻率。對具有各種單體型的ESRD的風險相關(guān)性而計算具有95%置信區(qū)間(Cl)的風險比(HR)。為評估配對SNP之間對結(jié)果變量的相互作用效應(yīng)，應(yīng)用Cox比例風險回歸模型，包括具有協(xié)變量的SNP的主要效應(yīng)和相互作用效應(yīng)。ESRD風險的三種PRKCB多態(tài)性(顯性模型rs3760106，隱性模型rs7404928及加性模型rs4787733)的聯(lián)合效應(yīng)通過基線調(diào)整常規(guī)風險因子的Kaplan-Meier曲線來顯示，其中評估了根據(jù)風險型等位基因數(shù)目的新發(fā)事件的累積概率。趨勢的顯著性利用攜帶的風險型等位基因的類別作為自變量，通過Cox回歸來檢驗。除非指明并非如此，利用SAS V.9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA)或 Windowsv.15的SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA)進行所有的統(tǒng)計學分析。雙尾P值〈0.05被認為是統(tǒng)計上顯著的。我們利用遺傳力計算器評估了后面的研究力36。假定顯性模型具有0.07的最小等位基因頻率，我們的樣本大小具有95%的能力來檢測α水平0.05處ESRD的最低HR2.25。結(jié)果遺傳變體的鑒定我們對1172名2型糖尿病患者跨越PRKCB基因的18個SNP進行基因分型，包括啟動子區(qū)的4個SNP，編碼外顯子的2個SNP和非編碼內(nèi)含子區(qū)的6個SNP (表2)。SNP的基因結(jié)構(gòu)和位置示于圖1中。在我們的群體中，除了 4對SNP(rs3760106和rs2575390;rs3900007和 rs3900008; rs3785394 和 rs3785391; rs3785380 和 rs3785378)，所有 SNP 處于中度連鎖不平衡，具有r2〈0.8。與HapMap CHB群體相比，在我們的群體中，后面兩對SNP顯示更強的 LD (對于 rs3785394 和 rs3785391，本研究中 r2=0.81，HapMap CHB 數(shù)據(jù)中 r2=0.78 ;對于rs3785380 和 rs3785378，本研究中 r2=0.94，HapMap CHB 數(shù)據(jù)中 r2=0.78)。研究參與者的臨床特征研究期間，90名患者發(fā)展成了 ESRD。對ESRD的平均隨訪期是7.9± 1.9年?；加行掳l(fā)ESRD的患者年紀更大且具有更高的HbAie, TC, TG水平，LDL-C，收縮壓和舒張壓，AER，高血壓比率以及視網(wǎng)膜病，并且與未患新發(fā)ESRD的患者相比，基線更有可能用胰島素、ACEI和降脂藥物治療。此外，患有新發(fā)ESRD的患者有更低的eGFR(表I)。PRKCB變體與ESRD之間的相關(guān)性rs3760106的T-等位基因和rs2575390的G-等位基因的最小頻率(r2=0.99)在患有(12.2%)與未患(7%)伴隨性ESRD的患者之間明顯不同。

在常規(guī)風險因子調(diào)整之后的Cox回歸模型中，4個SNP與ESRD顯著相關(guān)(Ρ〈0.05)(表2)。rs3760106的T等位基因和緊密連鎖的SNPrs2575390 (r2=0.98)的G等位基因與ESRD的風險增加強烈相關(guān)(顯性模型中對于rs3760106，HR(95%C.1.)=2.25(1.31 -3.87), P=0.0034 ；顯性模型中對于 rs2575390，HR(95%C.1.) =2.26 (1.31 - 3.88)，P=0.0033)。我們還觀察到ESRD與rs7404928的常見TT基因型(隱性模型中，HR(95%C.1.)=1.59(1.01 - 2.52), P=0.0471)和 rs4787733 的主要 A-等位基因(加性模型中，HR (95%C.1.)=1.78(1.03 - 3.09)，P=0.0399)的較小的相關(guān)性。rs3760106 (P=0.0299)和rs2575390 (P=0.0298)的2個SNP在多重比較校正之后仍然顯著。與單一SNP 相關(guān)性相比，3 個顯著且獨立的 SNP(r2〈0.8) (rs3760106, rs7404928和rS4787733)的單體型分析顯示相似的效應(yīng)值(表3)。僅由賦予風險(TTA)和保護型(CCG)等位基因構(gòu)建的單體型對ESRD分別賦予增加(HR (95%C.1.)=1.89(1.12-
3.21), P=0.0159)和降低(HR(95%C.1.)=0.38(0.13 - 1.16)，P=0.0758)的趨勢。PRKCB變體的累加效應(yīng)和ESRD的發(fā)展我們還檢測了 PRKCB多態(tài)性對ESRD可能的雙向上位性，但是未能觀測到相互作用的任何證據(jù)(數(shù)據(jù)未示出)。然而，在三個(顯性模型rs3760106，隱性模型rs7404928以及加性模型rs4787733)顯著且獨立的(r2〈0.8) SNP的聯(lián)合效應(yīng)分析中，隨著風險型等位基因(對于ESRD，P=0.0007)數(shù)目的增加，ESRD風險顯著增加(圖1和表4)。與具有一個或沒有風險型等位基因的患者相比，具有四個風險型等位基因的患者對ESRD的調(diào)整風險是
6.044 (95%C.1.2.00 - 18.31)。除了存在PRKCB風險變體之外，鑒定ESRD發(fā)展的其他獨立的風險因子是HbAlc提高，eGFR降低，對數(shù)轉(zhuǎn)換的AER提高以及存在視網(wǎng)膜病(表4)。在我們的基線處沒有ESRD的個體群體中，在最多9年的隨訪期間，90名個體(7.7%)出現(xiàn)新的ESRD事件，形成9.7/1，OOO人-年(95%CI=7.7-11.7)的年發(fā)生率。與攜帶4個風險型等位基因的個體(群體中的6.9%)的發(fā)生率是20.0/1, 000 (95%CI=8.8-31.1)相比，攜帶O或I個風險型等位基因的個體(群體中的12.3%)的發(fā)生率是4.4/1，000人-年(95%CI=0.5 - 8.2)。PRKCB中變體的驗證和糖尿病腎病的發(fā)展為了驗證PRKCB多態(tài)性與糖尿病腎病之間的相關(guān)性，我們檢測了來自香港糖尿病登記處的其他個體中PRKCB變體的影響。驗證群體中的所有個體在原始發(fā)現(xiàn)群體之后招募。驗證群體中患者的基線特征總結(jié)在表I中。與原始群體相比，驗證群體中患者年齡更大，具有明顯更短的糖尿病和隨訪持續(xù)時間，并且由ACE抑制劑治療的患者明顯更多。因此，在該群體中，與原始群體相比，在隨訪期間發(fā)展成ESRD的患者比例更低(總共3677名個體中的253名個體，6.9%)。為了檢測該群體中PRKCB變體對DKD發(fā)展的影響，我們從該群體中選擇了具有早發(fā)性疾病的患者(定義為發(fā)病年齡〈45歲，其在基線處沒有慢性腎病)，并且鑒別出在隨訪期間向慢性腎病發(fā)展的患者。該患者群體中基因分型的特征總結(jié)在表I中。在隨訪期間，總共1049名患者中的151名(14.3%)發(fā)展成CKD。發(fā)現(xiàn)在該群體中，rs3760106變體的T等位基因和rs2575390變體的G等位基因與CKD的發(fā)展顯著相關(guān)，分別具有 1.68(95%CI1.1-2.57)和 1.62(95%CI1.07-2.47)的 HR(表 2)。雖然 rs7404928和rs4787733變體與慢性腎病的相關(guān)性未達到統(tǒng)計顯著性，但是利用與原始發(fā)現(xiàn)群體相同的遺傳模型，處于風險中的變體在同一方向增加發(fā)展成腎功能障礙的風險。PRKCB變體與eGFR之間的關(guān)系為了更好地理解PRKCB遺傳變體與腎功能障礙發(fā)展之間的關(guān)系，我們在獨立的橫向群體(在上海招募的2 型糖尿病中國患者)中，進一步檢測了 PRKCB中的遺傳變體與基線腎功能之間的關(guān)系(表3)。調(diào)整年齡、性別和BMI之后，我們未發(fā)現(xiàn)PRKCB變體與基線eGFR(p=0.66-0.82)或 CKD (定義為 eGFR〈60ml/ 分鐘 /1.73m2，η=195) (ρ=0.27-0.53)之間的相關(guān)性。這類似于基于來自我們基因分型患者的基線eGFR的所有橫向數(shù)據(jù)的分析的分析。PRKCB中涉及的遺傳變體的功能注釋我們對所鑒別的遺傳變體的功能意義進行了廣泛的生物信息學分析。已知這些變體中的一種——rs3760106位于轉(zhuǎn)錄因子Spl的潛在結(jié)合位點，這提示DNA與結(jié)合蛋白之間可能的相互作用23。進一步的生物信息學分析(總結(jié)在表4中)表明，rs3760106、rs2575390和rs3900007全部位于PRKCB啟動子的保守序列之內(nèi)，而rs2575390和rs3900007位于組蛋白修飾位點(H3K27me3)之內(nèi)并由此可改變基因的轉(zhuǎn)錄活性。rs7404928和rs4787733變體同樣位于推測具有功能意義的DNA區(qū)之內(nèi)，所述DNA區(qū)可改變調(diào)控因子的結(jié)合并由此導致基因轉(zhuǎn)錄改變(表4)。討論在本文隨訪8年的2型糖尿病患者中，我們發(fā)現(xiàn)PRKCB基因的遺傳變體不依賴于其它已知的風險因子而預(yù)測伴隨性ESRD的發(fā)展，在賦予風險等位基因中具有聯(lián)合效應(yīng)。盡管在基線處對視網(wǎng)膜病、蛋白尿癥、腎功能、風險因子控制及使用包括ACEI的藥物進行校正，然而仍存在這些相關(guān)性。我們的研究優(yōu)勢包括相對長的隨訪持續(xù)時間，臨床參數(shù)和藥物應(yīng)用的詳細記錄，以及利用ESRD作為估量DKD的結(jié)果。因而我們一致的結(jié)果表明，PRKCB基因中的遺傳變異對于2型糖尿病患者(如中國患者)發(fā)展成DKD的風險是重要的決定因素。我們對PRKCB變體數(shù)目的增加在預(yù)測糖尿病腎病中的累加效應(yīng)的新發(fā)現(xiàn)是出乎預(yù)料的，尤其是考慮到變體中的幾個處于非編碼區(qū)中。如通過我們的生物信息學所預(yù)測的，這可反映出這些變體對其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合效應(yīng)或其他后生效應(yīng)。在本文中，我們的結(jié)果表明，PRKCB多態(tài)性與ESRD的風險相關(guān)性不依賴于糖血癥控制，這提示可能涉及其他非血糖途徑?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)表明腎病與PRKCB的風險相關(guān)性可由相互作用的途徑介導，包括但不限于高血糖癥，以及增加的氧化應(yīng)激導致腎小管損傷和間質(zhì)纖維化。我們的研究設(shè)計檢測了 PRKCB變體與腎功能障礙發(fā)展之間的相關(guān)性。此外，考慮到我們對高血糖癥與蛋白激酶C-β活化之間的相互作用的生物學理解，可以預(yù)期PRKCB變體對于患有糖尿病的個體的影響是特異性的?？紤]到PKC-β在DKD和其他糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機理中的重要作用，開發(fā)了
PKC-β的選擇性抑制劑-魯伯斯塔(Ruboxistaurin, RBX)。該藥在幾種動物模型中標
準化了與糖尿病相關(guān)的血流動力學變化、ECM積累以及腎小球損傷的組織學特征18192°。在2期臨床試驗中，包括用ARB或ACEI最佳治療的123名患有DKD的2型糖尿病患者，用RBX治療進一步降低了尿液TGF-β水平，減少了腎小球濾過率損失的比率以及減少蛋白尿2257。參與RBX臨床試驗的糖尿病周圍神經(jīng)病變患者中的腎病標志物的初步分析還表明，研究期間改進了腎參數(shù)5859?？紤]到諸如DKD的復雜疾病的表型和遺傳異質(zhì)性，檢測PRKCB基因型與對PBX的臨床反應(yīng)之間的相互作用是有意義的，如最近在具有ACE插入/缺失多態(tài)性的個體中對ARB的臨床反應(yīng)的病例中所證明的6°?？傊?，我們發(fā)現(xiàn)PRKCB基因的遺傳變體不依賴于混雜因素而預(yù)測伴隨性ESRD，所述混雜因素特別是蛋白尿癥 、糖血癥、視網(wǎng)膜病及其他風險因子控制。參考文獻1.Ramachandran A, Ma RCj Snehalatha C.Diabetes in Asia.Lancet.Jan302010;375(9712):408-418.
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表1.中國2型糖尿病患者中根據(jù)向ESRD發(fā)展分等級的基線臨床特征和生化概況
權(quán)利要求
1.用于診斷個體中疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的方法，包括分析至少一種多核苷酸來檢測選自以下的至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP) =PKC- β I基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它們的組合， 其中所述單核苷酸多態(tài)性的存在指示所述個體患有所述疾病、病癥或疾病狀況，處于患所述疾病、病癥或疾病狀況的風險中，或疑似患有所述疾病、病癥或疾病狀況， 其中所述疾病、病癥或疾病狀況包括糖尿病腎并發(fā)癥，其選自由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ；2型糖尿病或I型糖尿病的腎?。挥?型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病,如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括檢測由3種變體或SNP組成的單體型，所述 3 種變體或 SNP 包括 rs3760106, rs7404928 和 rs4787733 的變體；rs2575390,rs7404928 和 rs4787733 的變體;或 rs3760106 和 rs2575390 的變體，加上 rs7404928 或rs4787733之一的變體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括檢測由4種變體或SNP組成的單體型，所述 4 種變體或 SNP 分別是 rs3760106，rs2575390, rs7404928 和 rs4787733 的變體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括從所述個體獲得樣品的步驟。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品選自血液、精液、唾液、淚液、尿液、排泄物、汗液、口腔細胞、皮膚、毛發(fā)或含有所述個體的核苷酸的其它組織。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述個體患有2型糖尿病。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述疾病、病癥或疾病狀況是ESRD。
8.用于診斷個體中疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的試劑盒或陣列，其包含用于檢測從所述個體獲得的含有至少一種多核苷酸的樣品的至少一種單核苷酸多態(tài)性的試劑， 其中所述單核苷酸多態(tài)性選自:PKC-13 I基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它們的組合 其中所述疾病、病癥或疾病狀況包括糖尿病腎并發(fā)癥，其選自由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ；2型糖尿病或I型糖尿病的腎??；由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病,如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒或陣列，其中所述試劑盒或陣列包含用于檢測由3種變體或SNP組成的單體型的試劑，所述3種變體或SNP包括rs3760106，rs7404928和rs4787733 的變體；rs2575390，rs7404928 和 rs4787733 的變體；*rs3760106 和 rs2575390的變體，加上rs7404928或rs4787733之一的變體。
10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒或陣列，其中所述試劑盒或陣列包含用于檢測由4種變體或SNP組成的單體型的試劑，所述4種變體或SNP分別是rs3760106，rs2575390，rs7404928 和 rs4787733 的變體。
11.如權(quán)利要求8所述的試劑盒或陣列，其中所述樣品選自血液、精液、唾液、淚液、尿液、排泄物、汗液、口腔細胞、皮膚、毛發(fā)或含有所述個體的核苷酸的其它組織。
12.如權(quán)利要求8至11中任一項所述的試劑盒或陣列，其中所述個體患有2型糖尿病。
13.治療或預(yù)防具有選自以下至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的個體中疾病、疾病狀況或病癥的方法:ΡΚΟβ I基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它們的組合，所述方法包括給予所述個體抵消所述個體中任何一種所述多態(tài)性的效應(yīng)的化合物， 其中所述疾病、疾病狀況或病癥包括糖尿病腎并發(fā)癥，其選自由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由I型糖尿病引起的ESRD ；2型糖尿病或I型糖尿病的腎??；由2型糖尿病或I型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或I型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外，并且其中所述化合物包括能夠抑制至少一種所述SNP的因子，且所述因子選自抑制性RNA、抗體、反義核酸、以及用于降低血壓、血糖控制、脂質(zhì)參數(shù)的因子或藥物，以及用于調(diào)控腎素-血管緊張素系統(tǒng)的因子或藥物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法 ，其中所述疾病、病癥或疾病狀況是ESRD。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于診斷個體中選自以下疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的方法糖尿病腎并發(fā)癥，包括2型糖尿病或1型糖尿病的腎病，由2型糖尿病引起的終末期腎病(ESRD)，由2型糖尿病高血壓引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的動脈粥樣硬化性周圍血管病，高血壓，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的腦血管意外。所述方法包括分析至少一種多核苷酸來檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述單核苷酸多態(tài)性的存在指示個體患有所述疾病、病癥或疾病狀況，處于患所述疾病、病癥或疾病狀況的風險中，或疑似患有所述疾病、病癥或疾病狀況。還公開了用于診斷所述疾病、病癥或疾病狀況的遺傳傾向的陣列或試劑盒。
文檔編號A61P9/10GK103154272SQ201180049234
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者馬青云, 蘇詠儀, 伍楚賢, 陳重娥 申請人:香港中文大學