專利名稱::活動(dòng)性結(jié)核病的治療性接種的制作方法活動(dòng)性結(jié)核病的治療性接種本發(fā)明涉及衛(wèi)生保健領(lǐng)域。更特別地,本發(fā)明涉及用于患有活動(dòng)性肺結(jié)核病的對(duì)象的治療性接種的新方法。
背景技術(shù):
:結(jié)核病(TB)是一種由緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染導(dǎo)致的疾病。TB可以是潛伏的或活動(dòng)性的,后者是指細(xì)菌處于生長(zhǎng)中并且引起癥狀。所述細(xì)菌最常見于肺部,稱作肺TB,其是傳染性的。大約1/3的世界人口感染Mtb,其中5-10%的個(gè)體在其一生中將發(fā)展為活動(dòng)性TB。TB導(dǎo)致每年死亡數(shù)超過(guò)2百萬(wàn),90%以上的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。藥物易感性TB的目前治療典型包括由世界衛(wèi)生組織(WHO)建議的對(duì)于抗生素抗性菌株給予抗生素藥物組合(cocktail),持續(xù)6個(gè)月至一年或更長(zhǎng)時(shí)間。盡管在治療的第一個(gè)月內(nèi)大部分活躍復(fù)制的細(xì)菌被殺滅,但是在剩下的治療期間需要?dú)缇徛L(zhǎng)的持續(xù)存在的主要位于細(xì)胞內(nèi)部的Mtb菌,以防止疾病復(fù)發(fā)。早于WHO建議的6個(gè)月中斷治療將導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā),這是由于剩余的細(xì)菌繁殖所致,而嚴(yán)格堅(jiān)持6個(gè)月的治療在最佳情況下可獲得僅超過(guò)90%的治愈率。然而,這種長(zhǎng)期治療方案有一些缺點(diǎn)。事實(shí)上,在許多發(fā)展中國(guó)家的實(shí)際治愈率低于WHO設(shè)定的85%的目標(biāo)治愈率,有時(shí)低于50%。低治療成功率是由于不良的患者順從性,導(dǎo)致多藥物和極端藥物抗性TB(MDR-TB/XDR-TB)形式的復(fù)發(fā)。因此,遵循抗生素的全部劑量是非常重要的,每日由健康專業(yè)人員觀察藥物的攝取以保證患者順從性。已知這是直接觀察治療(D0T),這種治療產(chǎn)生高成本及物流負(fù)擔(dān)。盡管TB藥物治療自首次引進(jìn)以來(lái)在挽救許多生命方面取得成功,但是MDR和XDR-TB的出現(xiàn)凸顯了使用抗生素對(duì)抗細(xì)菌中的固有限制。因此,仍急迫需要改良的活動(dòng)性TB治療方案以控制目前全球性TB的流行。WO2004/062607描述了一種縮短TB治療持續(xù)時(shí)間的方式,包括使用弱酸或其前體治療TB。對(duì)抗TB的另一種獨(dú)立的途徑是通過(guò)接種。然而,這種方法通常針對(duì)于預(yù)防TB,通過(guò)在未患有活動(dòng)性TB(優(yōu)選當(dāng)接種時(shí)甚至未感染Mtb)的人體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,因此這種方法中的疫苗是預(yù)防性疫苗??ń槊?BCG),一種活的減毒牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)菌株,是目前唯一可利用的TB疫苗,在幾十年間已經(jīng)用于新生兒接種。然而,這種疫苗有其限制,近年來(lái)使用一些候選疫苗在產(chǎn)生更有效的TB疫苗中取得進(jìn)展。已經(jīng)處于臨床試驗(yàn)中的一種候選物基于表達(dá)Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的腺病毒血清型35(Havengaetal,2006;Radosevicetal,2007;W02006/053871)。已經(jīng)證實(shí)這種疫苗在未感染的人體內(nèi)是安全的,能誘導(dǎo)針對(duì)疫苗Mtb抗原的高T細(xì)胞應(yīng)答,使其成為預(yù)防性TB疫苗有希望的候選物。然而,在患有活動(dòng)性TB的患者中進(jìn)行目的為治療這些患者的接種則需要治療性TB疫苗。原則上,這種治療性TB疫苗可具有改善活動(dòng)性TB治療的潛力。治療肺結(jié)核的治療性TB疫苗的設(shè)想首先由RobertKoch在1890年創(chuàng)立,當(dāng)時(shí)他宣布通過(guò)結(jié)核菌素治療治愈了結(jié)核(見Burke,1993)。結(jié)核菌素由Mtb的提取物組成。然而,盡管所述治療在一些患者中治愈該疾病取得成功,但是一些患者呈現(xiàn)出癥狀惡化,這種現(xiàn)象被稱作Koch’s現(xiàn)象。Koch’s現(xiàn)象的發(fā)生是由于Thl-相關(guān)細(xì)胞因子全身釋放,導(dǎo)致TB損害壞死所致(Churchyardetal,2009),其可導(dǎo)致毀滅性的臨床癥狀,甚至導(dǎo)致死亡。因此,對(duì)于任何新的治療性TB疫苗候選物均需要證實(shí)的重要安全性考慮是在廣泛給予TB患者疫苗之后不存在Koch’s現(xiàn)象。這僅可在流行區(qū)域由精心設(shè)計(jì)的受控臨床試驗(yàn)解決。近來(lái),對(duì)重新恢復(fù)治療性TB接種的興趣再次得到關(guān)注,特別是用作TB化療的輔助劑,以期縮短治療。動(dòng)物研究表明編碼TB抗原如熱休克蛋白65(HSP-65)(Lowrieetal,1999)、Ag85A(Haetal,2005)及Ag85B(Zhuetal,2005)的DNA疫苗在Mtb感染的動(dòng)物中可降低細(xì)菌負(fù)荷(Haetal,2005;Zhuetal,2005),當(dāng)與化療聯(lián)合(Haetal,2005)或在化療完成之后(Lowrieetal,1999)使用時(shí)預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。當(dāng)在化療早期細(xì)菌負(fù)荷較低時(shí)給予治療性TB疫苗應(yīng)能使免疫系統(tǒng)靶向持留菌(persisters),使得可以預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。在臨床研究中,如在中國(guó)進(jìn)行的試驗(yàn)所表明,熱滅活的母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)制備物已經(jīng)示出在MDR-TB中作為輔助治療是有效的(Fanetal,2007)0這種治療依賴于母牛分枝桿菌免疫調(diào)節(jié)的非特異性性質(zhì)。處于臨床開發(fā)階段的另一疫苗是RUTI,其是含有Mtb細(xì)胞壁的脂質(zhì)體制備物,目的是用作TB化療的輔助劑(Churchyardetal,2009)。盡管有所進(jìn)展,但是對(duì)于這些疫苗仍需要證實(shí)的重要安全性考慮是在廣泛給TB感染的患者施用疫苗之后不存在Koch’s現(xiàn)象,這是僅可在流行區(qū)域由精心設(shè)計(jì)的受控臨床試驗(yàn)解決的重要方面。實(shí)際上,幾年前在這個(gè)領(lǐng)域的一家公司的會(huì)議上報(bào)告了治療性疫苗候選物的研發(fā)由于安全性原因而不得不終止。此外,盡管在小鼠中使用編碼hsp60或Ag85抗原的DNA疫苗治療TB的一些報(bào)道是成功的,但也有在免疫治療性小鼠模型中出現(xiàn)經(jīng)典Koch反應(yīng)的其它報(bào)道(Tayloretal,2003)。這突出了通過(guò)免疫治療性接種引起Koch’s現(xiàn)象的危險(xiǎn),因此特別需要對(duì)每個(gè)疫苗候選物進(jìn)行臨床研究以評(píng)定潛在的安全性問(wèn)題。US2004/0057963涉及抗?jié)摲黅B的治療性疫苗,其通過(guò)輸送多肽或編碼其的核酸實(shí)現(xiàn),所述多肽在分枝桿菌感染潛伏期期間被上調(diào)或表達(dá)。US2004/0057963教導(dǎo)一些抗原(如ESAT6)盡管作為預(yù)防性疫苗強(qiáng)效,但是作為治療性疫苗無(wú)效,但是相反其它抗原(如Rv2031c)可以是有效的治療性疫苗,但是作為預(yù)防性疫苗無(wú)效或僅具有可忽略的作用(見該文中實(shí)施例2)。因此,技術(shù)人員通過(guò)US2004/0057963被教導(dǎo)針對(duì)治療性TB疫苗和預(yù)防性TB疫苗要使用不同抗原。對(duì)患有活動(dòng)性TB患者進(jìn)行治療性接種的另一復(fù)雜因素是患有活動(dòng)性TB的個(gè)體實(shí)際上具有對(duì)來(lái)自Mtb抗原的刺激不應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞,這一點(diǎn)通過(guò)四聚體結(jié)合測(cè)定而觀測(cè)到(Weicholdetal,2007)。事實(shí)上,本發(fā)明中描述的臨床試驗(yàn)證實(shí)在這些試驗(yàn)中患有活動(dòng)性TB的患者對(duì)于至少一些主要Mtb抗原是“免疫抑制的”或者“耐受的”:盡管熟知例如Ag85A和Ag85B是Mtb最強(qiáng)的免疫原性蛋白質(zhì),所述對(duì)象對(duì)這些蛋白質(zhì)不應(yīng)答。因此,治療性疫苗候選物應(yīng)能打破這種Mtb-誘導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的耐受。因此,本發(fā)明的目的是提供對(duì)患有活動(dòng)性TB的患者的治療性治療,所述治療在符合嚴(yán)格安全性標(biāo)準(zhǔn)的條件下應(yīng)是有效的,且優(yōu)選也應(yīng)能用于與藥物治療聯(lián)合應(yīng)用,并且優(yōu)選通過(guò)縮短藥物治療時(shí)間而改善藥物治療。發(fā)明概述本發(fā)明因此基于新的想法,即在治療和未治療個(gè)體中TB臨床存在的原因是Mtb桿菌能誘導(dǎo)對(duì)通常是免疫顯性Mtb抗原的耐受性。這種耐受性的誘導(dǎo)使免疫系統(tǒng)不能以抗原特異性方式正常工作,由此不能識(shí)別及殺滅化療劑幾乎不可及的細(xì)胞內(nèi)TB生物體。通過(guò)在腺病毒載體中呈遞這些抗原,所述腺病毒載體將編碼這些抗原的核酸插入特定靶細(xì)胞中,可以破壞耐受性并且可以誘導(dǎo)有效的抗原特異性應(yīng)答。此外,這些抗原特異性應(yīng)答是以不誘導(dǎo)與Koch’s現(xiàn)象相關(guān)的一般炎癥反應(yīng)的方式誘導(dǎo)的。本發(fā)明因此能破壞耐受性并誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答,而且不存在導(dǎo)致疾病進(jìn)展而非抑制的不利非特異性炎癥反應(yīng)。所述耐受例如在治療了活動(dòng)性TB的人體臨床試驗(yàn)中證實(shí),令人驚奇地發(fā)現(xiàn)其不具有對(duì)正常免疫顯性抗原Ag85A和Ag85B的細(xì)胞免疫應(yīng)答,表示在活動(dòng)性感染期間對(duì)這些抗原耐受。進(jìn)一步示出用含有編碼Ag85A和Ag85B的核酸的重組腺病毒載體免疫令人驚奇地在經(jīng)證實(shí)在TB感染期間缺少對(duì)這些免疫顯性抗原免疫應(yīng)答的這些個(gè)體中可破壞這種耐受并誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫。也令人驚奇地示出以這種方式誘導(dǎo)這種抗原特異性免疫應(yīng)答在經(jīng)歷對(duì)活動(dòng)性疾病進(jìn)行化療的這些個(gè)體中不引起Koch’s現(xiàn)象或者肺部或其它形式TB的臨床進(jìn)展的任何跡象。在這些患者中誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫性的類型主要是表達(dá)Y干擾素的⑶8T細(xì)胞,提示效應(yīng)記憶細(xì)胞能殺死感染細(xì)胞內(nèi)的TB。先前進(jìn)行的發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防性TB疫苗候選物的一個(gè)嘗試是基于腺病毒的TB疫苗,其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TB抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4為融合蛋白,稱作Ad35.TBS或Ad35.TB-S(Havengaetal,2006;Radosevicetal,2007;W02006/053871;所述疫苗在文獻(xiàn)中也被稱作AERAS-402),這個(gè)候選物正在非洲和美國(guó)進(jìn)行廣泛的I期和II期臨床試驗(yàn)。為了今后進(jìn)入更大的臨床試驗(yàn)而不需要為了實(shí)際原因而在招募者中進(jìn)行廣泛的TB檢測(cè),決定首先在Mtb感染的個(gè)體中檢測(cè)疫苗的安全性。因此,這個(gè)疫苗的臨床試驗(yàn)在南非進(jìn)行。所述疫苗在經(jīng)歷TB治療的人群中以及被治愈但先前感染TB的那些人中進(jìn)行II期試驗(yàn)測(cè)試。這項(xiàng)研究的令人驚奇的結(jié)果證實(shí)所述疫苗是安全的,這通過(guò)在Mtb暴露個(gè)體中明顯不存在Koch’s現(xiàn)象而證實(shí)。同樣關(guān)鍵地,所述疫苗能克服由細(xì)菌介導(dǎo)的Mtb抗原的免疫抑制問(wèn)題,這通過(guò)對(duì)所述疫苗抗原的免疫學(xué)應(yīng)答測(cè)出。這些臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)揭示了在治療方案中利用包含編碼Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的核酸的重組腺病毒載體的巨大潛力。所述疫苗也可以用作抗生素的輔助劑,例如縮短TB藥物治療時(shí)間,和/或降低縮短的TB藥物治療方案的復(fù)發(fā)率。因此,本發(fā)明第一方面提供了治療患有活動(dòng)性結(jié)核病(TB)的患者的方法,所述方法包括:給所述患者施用重組腺病毒載體,所述載體包含編碼結(jié)核分枝桿菌(Mtb)的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。本發(fā)明第二方面進(jìn)一步提供了在感染Mtb的對(duì)象體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)Mtb抗原免疫應(yīng)答的方法,所述方法包括給所述對(duì)象施用給所述患者施用重組腺病毒載體,所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸,以在所述對(duì)象體內(nèi)表達(dá)所述抗原及誘導(dǎo)對(duì)所述至少一種抗原的免疫應(yīng)答。第三方面,本發(fā)明提供了重組腺病毒載體,其包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸,以治療患有活動(dòng)性TB的患者。第四方面,本發(fā)明提供了重組腺病毒載體,其包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸,以在感染Mtb的對(duì)象體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)Mtb抗原的免疫應(yīng)答。第五方面,本發(fā)明提供了重組腺病毒載體在制備治療患有活動(dòng)性TB的患者的藥物中的應(yīng)用,所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。第六方面,本發(fā)明提供了重組腺病毒載體在制備在感染Mtb的對(duì)象體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)Mtb抗原免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用,所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。如下實(shí)施方案涉及上述本發(fā)明的每一方面,除了根據(jù)上下文明確所述實(shí)施方案只涉及某些方面的情況。在某些實(shí)施方案中,對(duì)所述患者或?qū)ο筮M(jìn)行藥物治療,例如通過(guò)給所述患者或?qū)ο笫┯媚軞鏜tb的一或多種抗生素藥物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,所述患者或?qū)ο笳谶M(jìn)行藥物治療或適合藥物治療。在某些實(shí)施方案中,對(duì)所述患者或?qū)ο筮M(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)藥物治療相比時(shí)間減少的藥物治療,例如抗生素藥物的施用方案與在不施用所述腺病毒的條件下給適合的患者或?qū)ο笫┯每股厮幬锏臉?biāo)準(zhǔn)方案相比更短。在某些實(shí)施方案中,對(duì)所述患者進(jìn)行的時(shí)間減少的藥物治療包括給所述患者施用治療性藥物如抗生素藥物的時(shí)間在大約I周至5個(gè)月之間,例如在2周至4個(gè)月之間。在某些實(shí)施方案中,給所述患者的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案包括每日施用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇的組合,時(shí)間為2個(gè)月,隨后每日或每周三次施用利福平和異煙肼及有或無(wú)乙胺丁醇,時(shí)間為4個(gè)月。在某些實(shí)施方案中,在開始藥物治療后在給定時(shí)間在一組患者中測(cè)量的Mtb的細(xì)菌負(fù)荷與在同一時(shí)間點(diǎn)在未施用所述腺病毒條件下測(cè)量的負(fù)荷相比較低。在某些實(shí)施方案中,在減少時(shí)間的治療性藥物治療之后在一群患者中測(cè)量的活動(dòng)性TB的復(fù)發(fā)率與未施用所述腺病毒的正常時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案相比相同或更低。在某些實(shí)施方案中,編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸編碼作為融合蛋白的這些抗原。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒是復(fù)制缺陷的人腺病毒血清型35。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒是復(fù)制缺陷的人腺病毒血清型26。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒載體以異源初免-加強(qiáng)(heterologousprime-boost)方案施用。在某些實(shí)施方案中,所述異源初免-加強(qiáng)方案包括施用人腺病毒血清型35和人腺病毒血清型26的載體。在某些實(shí)施方案中,患者所患TB是肺TB。在某些實(shí)施方案中,所述患者或?qū)ο蟾腥径嗨幬锟剐訫tb(MDR-TB)或者極端藥物抗性Mtb(XDR-TB)。在某些實(shí)施方案中,給所述患者或?qū)ο笫┯贸^(guò)一次的包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體。在某些實(shí)施方案中,所述重組腺病毒載體的施用在所述患者或?qū)ο篌w內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)由所述腺病毒內(nèi)所述核酸編碼的至少一種抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中,所述⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答是多功能T細(xì)胞應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中,所述重組腺病毒載體的施用在所述患者或?qū)ο篌w內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)由所述腺病毒內(nèi)所述核酸編碼的至少一種抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中,感染Mtb的對(duì)象具有潛伏性TB。附圖簡(jiǎn)述圖1:與安慰劑對(duì)照相比,在接受3X1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85A混合肽刺激時(shí),釋放IFNy或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細(xì)胞百分比隨時(shí)間增加。圖2:與安慰劑對(duì)照相比,在接受3X1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85B混合肽刺激時(shí),釋放IFNy或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細(xì)胞百分比隨時(shí)間增加。圖3:與安慰劑對(duì)照相比,在接受3Χ1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用TB10.4混合肽刺激時(shí),釋放IFNY或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細(xì)胞百分比隨時(shí)間增加。圖4:與安慰劑對(duì)照相比,在接受3X10l0病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85B混合肽刺激時(shí),釋放IFNYHTNF-α的多功能CD8淋巴細(xì)胞百分比隨時(shí)間增加。圖5:證實(shí)Ad35.TB-S縮短化療時(shí)間作用的動(dòng)物研究方案,詳細(xì)示出接種時(shí)機(jī)和免疫學(xué)研究。圖6:證實(shí)通過(guò)用Ad35.TB-S及隨后Ad26.TB-S進(jìn)行異源初免-加強(qiáng)縮短化療時(shí)間作用的動(dòng)物研究方案,詳細(xì)示出接種時(shí)機(jī)和免疫學(xué)研究。發(fā)明詳述如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知,TB可以是潛伏性或活動(dòng)性的,可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法檢測(cè)和識(shí)別,如X光照相術(shù)、細(xì)菌或免疫學(xué)方法或這些方法的組合(見例如Mitchison,2005)0舉例的是痰液樣品的抗酸桿菌(AFB)涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物、結(jié)核菌素皮膚測(cè)試及干擾素-Y釋放測(cè)定。例如,AFB或分枝桿菌培養(yǎng)物也可用于確定治療作用。潛伏性TB是指Mtb菌存在于對(duì)象體內(nèi),但是機(jī)體的防御機(jī)制使其未變成活動(dòng)性TB。這意味著這種對(duì)象此時(shí)不具有任何癥狀并且通常疾病不傳播至其它對(duì)象。潛伏性TB在某階段可成為活動(dòng)性TB?;顒?dòng)性TB是指Mtb菌在生長(zhǎng)中并導(dǎo)致癥狀。感染通常發(fā)生在肺,稱之為肺TB。如果肺感染活動(dòng)性TB,該疾病易于播散至其它對(duì)象。TB也可以播散至機(jī)體其它部分,稱之為肺外TB。肺外TB可包括播散性結(jié)核、淋巴結(jié)核、胸膜結(jié)核、泌尿生殖器結(jié)核、骨和關(guān)節(jié)結(jié)核及中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核。本發(fā)明原則上適于改良任何活動(dòng)性TB的治療。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的活動(dòng)性TB是肺TB。HIV感染增加患TB的可能性,因此在某些實(shí)施方案中所述TB患者也可伴隨HIV感染。在其它實(shí)施方案中,所述TB患者不伴隨HIV感染?;顒?dòng)性TB的癥狀可包括:超過(guò)2周的咳嗽,來(lái)自肺的稠厚、渾濁及有時(shí)血性粘液(稱作痰液),疲倦及體重減輕,夜間盜汗及發(fā)熱,心跳加快,頸部腫脹(當(dāng)頸部淋巴結(jié)受累時(shí)),呼吸淺短及胸痛(罕見)。肺TB通常通過(guò)取痰液樣品檢測(cè)其中是否存在Mtb菌而進(jìn)行診斷。有時(shí)可進(jìn)行胸部X光照相以幫助發(fā)現(xiàn)肺TB。肺外TB可通過(guò)使用對(duì)感染的組織進(jìn)行組織活檢或液體抽吸或者收集排泄物進(jìn)行AFB涂片、培養(yǎng)及組織學(xué)檢測(cè)而發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的患者是人。在其它實(shí)施方案中,所述患者可以是能被Mtb感染及在某些方面具有活動(dòng)性TB的哺乳動(dòng)物,例如家畜,或者嚙齒類動(dòng)物如作為TB模型的小鼠。根據(jù)本發(fā)明,腺病毒用作治療性疫苗。用于治療性或預(yù)防性疫苗的腺病毒為本領(lǐng)域熟知,可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法產(chǎn)生。腺病毒載體可以通過(guò)使用作為載體DNA來(lái)源的腺病毒或嵌合腺病毒的任何種、株、亞型或種、株或亞型的混合物產(chǎn)生(見例如WO96/26281,WO00/03029)。本發(fā)明的腺病毒優(yōu)選是人腺病毒。其可以是任何血清型。經(jīng)鑒別的特別有用的人腺病毒載體是基于血清型11、26、34、35、48、49和50,如WO00/7007UW002/40665和WO2004/037294所述。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腺病毒24(Ad24)是特別令人感興趣的,因?yàn)槠涫境鍪呛币娧逍?W02004/083418)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中,用于本發(fā)明的腺病毒因此是選自如下的人腺病毒血清型:Adll、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。這種選擇人腺病毒作為疫苗載體的優(yōu)勢(shì)是人不常被這些野生型腺病毒感染,從而針對(duì)這些血清型的中和抗體在人群中一般不太普遍存在。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的血清型是Ad35和Ad26。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,腺病毒是猿猴、犬或牛腺病毒,因?yàn)檫@些病毒在被施用重組病毒的(人)宿主中也不遭遇先前存在的免疫性。猿猴腺病毒用于人基因治療或疫苗中的適用性為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。除此之外,發(fā)現(xiàn)犬和牛腺病毒在體外感染人細(xì)胞,因此也可適合人體使用。特別優(yōu)選的猿猴腺病毒是分離自黑猩猩的那些。例如包括C68(也稱作Pan9,US6,083,716)和Pan5、6和7(冊(cè)03/046124);也見WO03/000851。使用被認(rèn)為是安全的并且可以懸浮生長(zhǎng)至極高體積的細(xì)胞,使用不含有任何動(dòng)物或人衍生成分的培養(yǎng)基,可以產(chǎn)生非常高效價(jià)的重組腺病毒。也已知重組腺病毒可引起針對(duì)由腺病毒基因組中異源核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的顯著的免疫應(yīng)答。在腺病毒基因組中,編碼轉(zhuǎn)基因-在此為Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原-的核酸與表達(dá)控制序列可操縱地連接。這可例如通過(guò)將編碼所述轉(zhuǎn)基因的核酸置于啟動(dòng)子控制下而實(shí)施??梢蕴砑悠渌{(diào)節(jié)序列。為此一種方便常規(guī)的方式是將所述轉(zhuǎn)基因克隆進(jìn)表達(dá)盒中,其可以許多形式來(lái)自市售的一些表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)盒通常含有能使得所述核酸表達(dá)的序列,如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)等。一些啟動(dòng)子可用于所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá),這些啟動(dòng)子可包括病毒啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子等等。在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)的合適啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例是CMV啟動(dòng)子(US5,385,839),哺乳動(dòng)物EFl-α啟動(dòng)子,哺乳動(dòng)物遍在蛋白C啟動(dòng)子,或者SV40啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中,驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子是CMV立即早期啟動(dòng)子,例如包含來(lái)自CMV立即早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的-735至+95位。聚腺苷酸化信號(hào),如牛生長(zhǎng)激素PolyA信號(hào)(US5,122,458),可以存在于所述轉(zhuǎn)基因之后。施用本發(fā)明的腺病毒將使得Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原在施用所述腺病毒的患者細(xì)胞中表達(dá)。這將導(dǎo)致在患者中對(duì)于至少一種抗原的免疫應(yīng)答。因此,本發(fā)明提供了這樣的方法和應(yīng)用,其中編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸在患者中表達(dá)。在某些方面,本發(fā)明提供了這樣的方法和應(yīng)用,由此針對(duì)Ag85A、Ag85B和TB10.4的至少一種、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選所有三種抗原的免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)。優(yōu)選地,所述腺病毒載體在病毒復(fù)制必要的腺病毒基因組的El區(qū)如Ela區(qū)和/或Elb區(qū)的至少一個(gè)必需基因功能是缺陷的。在某些實(shí)施方案中,所述載體在El區(qū)的至少一個(gè)必需基因功能及至少部分非必需的E3區(qū)是缺陷的。所述腺病毒載體可以是“多重缺陷的”,是指所述腺病毒載體在腺病毒基因的兩或更多個(gè)區(qū)域的每一個(gè)中的一或多個(gè)必需基因功能是缺陷的。例如,前述El缺陷的或者El、E3缺陷的腺病毒載體可進(jìn)一步在E4區(qū)域的至少一個(gè)必需基因和/或E2區(qū)域(如E2A區(qū)域和/或E2B區(qū)域)的至少一個(gè)必需基因是缺陷的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知,在腺病毒基因組的必需區(qū)域缺失的情況中,由這些區(qū)域編碼的功能需要反式提供,優(yōu)選由生產(chǎn)細(xì)胞提供,即當(dāng)腺病毒缺失部分或全部El、E2和/或E4區(qū)域時(shí),這些區(qū)域必須要存在于生產(chǎn)細(xì)胞中,例如整合進(jìn)基因組中,或者是所謂的輔助腺病毒或輔助質(zhì)粒形式。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的腺病毒缺失至少一部分El區(qū),例如ElA和/或ElB編碼序列,并且進(jìn)一步包含編碼Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的異源核酸。腺病毒載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域熟知,包括使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù),如在例如Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)、Watsonetal.,RecombinantDNAj2ded.,ScientificAmericanBooks(1992)及Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)以及本文提及的其它參考文獻(xiàn)中所述的那些技術(shù)。腺病毒載體、其構(gòu)建方法及其增殖方法為本領(lǐng)域熟知,在例如美國(guó)專利5,559,099,5,837,511,5,846,782,5,851,806,5,994,106,5,994,128,5,965,541、5,981,225,6,040,174,6,020,191和6,113,913以及ThomasShenk,"AdenoviridaeandtheirReplication",M.S.Horwitz,"Adenoviruses",67和68章,Virology,B.N.Fieldsetal.,eds.,3ded.,RavenPress,Ltd.,NewYork(1996)及本文提及的其它參考文獻(xiàn)中描述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述腺病毒是復(fù)制缺陷的,例如因?yàn)槠浜谢蚪MEl區(qū)中的缺失。如果所述腺病毒是來(lái)自除了人腺病毒亞群C之外的亞群(例如Ad35來(lái)自亞群B或者Ad26來(lái)自亞群D),優(yōu)選將該腺病毒的E4-orf6編碼序列用人亞群C的腺病毒如Ad5的E4-orf6置換。這樣使得這種腺病毒在熟知的表達(dá)Ad5的El基因的互補(bǔ)細(xì)胞系如293細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞等中增殖(見例如Havengaetal,2006;W003/104467,以其全文援引加入本文)。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒是人腺病毒血清型35,在其中已經(jīng)克隆進(jìn)編碼所述抗原的核酸的El區(qū)中有缺失,并且具有Ad5的E4orf6區(qū)。在其它實(shí)施方案中,所述腺病毒是人腺病毒血清型26,在其中已經(jīng)克隆進(jìn)編碼所述抗原的核酸的El區(qū)域中有缺失,并且具有Ad5的E4orf6區(qū)。如果所述腺病毒是屬于人亞群B,如Ad35、Ad34或Adl1,優(yōu)選其保留腺病毒中ElB55K開放讀框的3’末端,例如pIX開放讀框直接上游的166bp或者包含其的片段,如PlX起始密碼子直接上游的243bp片段,在5’末端由Bsu36I限制位點(diǎn)標(biāo)記,因?yàn)橛捎趐IX基因的啟動(dòng)子在這個(gè)區(qū)域內(nèi)部分存在而增加了腺病毒的穩(wěn)定性(見例如Havengaetal,2006;W02004/001032,援引加入本文)。本發(fā)明中使用的腺病毒包含Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原。這種腺病毒及其產(chǎn)生方式在先前的Havengaetal,2006,Radosevicetal,2007,WO2006/053871中描述,所述文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的腺病毒包含編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原作為融合蛋白的核酸。在某些實(shí)施方案中,所述核酸以5’至3’順序編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原作為融合蛋白的全部開放讀框。在其它實(shí)施方案中,所述腺病毒包含Ag85A、Ag85B和/或TB10.4抗原的編碼序列的片段,該片段包含這些Mtb蛋白的抗原性部分或表位。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒包含編碼由US2009/0123438Al所述SEQIDN0:7的1-676位氨基酸提供的融合蛋白的核酸,所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在某些實(shí)施方案中,編碼所述抗原的核酸序列已經(jīng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在人中表達(dá)。在某些實(shí)施方案中,所述腺病毒包含包含US2009/0123438A1所述SEQIDNO:4的13-2043位核苷酸的核酸序列,所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。本發(fā)明中使用的腺病毒因此作為TB的預(yù)防性疫苗而已知,本發(fā)明首次揭示了其在患有活動(dòng)性TB的患者中用作治療性疫苗。這種應(yīng)用是不能預(yù)料的且是令人驚奇的,因?yàn)榭雌饋?lái)存在由Mtb產(chǎn)生的宿主細(xì)胞免疫性針對(duì)Mtb抗原的誘導(dǎo)的耐受性(Weicholdetal,2007),在下文描述的臨床試驗(yàn)中針對(duì)Ag85A和Ag85B抗原進(jìn)一步示出,令人驚奇地發(fā)現(xiàn)耐受性被本發(fā)明的疫苗破壞。不能被預(yù)料的另一原因是可用作預(yù)防性TB抗原的抗原作為治療性TB抗原不見得是有效的(見例如Andersenetal,US2004/0057963),強(qiáng)調(diào)了對(duì)這些疫苗的免疫應(yīng)答的不可預(yù)測(cè)性。腺病毒可以在本領(lǐng)域熟知的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中制備、收獲和純化,例如援引加入本文的WO2010/060719描述了獲得及純化大量重組腺病毒如用于本發(fā)明中的那些腺病毒的合適方法。產(chǎn)生和純化腺病毒的進(jìn)一步方法在例如WO98/22588、WO00/32754、WO04/020971、US5,837,520、US6,261,823、WO2005/080556和WO2006/108707中描述,所述文獻(xiàn)援引加入本文。為了施用給人,本發(fā)明可采應(yīng)用藥物組合物,其包含所述腺病毒及藥物可接受的載體或賦形劑。在本文中,術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的”是指所述載體或賦形劑在所用劑量和濃度下在施用的對(duì)象中不導(dǎo)致不希望的或有害的作用。這種藥物可接受的載體和賦形劑為本領(lǐng)域熟知(見Remington’sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishingCompany[1990]!PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandL.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis[2000];及HandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdedition,A.Kibbe,Ed.,PharmaceuticalPress[2000])。純化的腺病毒優(yōu)選作為無(wú)菌溶液配制和施用。無(wú)菌溶液是通過(guò)滅菌過(guò)濾或者本領(lǐng)域已知的其它方法制備的。然后可將所述溶液凍干或填充進(jìn)藥物劑量容器中。所述溶液的pH通常在pH3.0-9.5范圍,例如pH5.0-7.5。所述腺病毒或其免疫原性部分典型是在具有合適的藥物可接受的緩沖液的溶液中,所述腺病毒溶液也可以含有鹽。在某些實(shí)施方案中,存在去污劑。在某些實(shí)施方案中,所述疫苗可以配制成可注射制備物。這些配制物含有有效量的腺病毒,是無(wú)菌液體溶液、液體懸浮液或者凍干形式,以及任選含有穩(wěn)定劑或者賦形劑。所述疫苗也可以氣霧化以用于鼻內(nèi)施用(見例如WO2009/117134)。例如,所述腺病毒可以貯存在這樣的緩沖液中,其也用于腺病毒世界標(biāo)準(zhǔn)(AdenovirusWorldStandard,Hogansonetal,Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002,p.43-48):20mMTrispH8,25mMNaCl,2.5%甘油。適于施用給人的另一可用配制物緩沖液是20mMTris,2mMMgCl2,25mMNaCl,蔗糖10%w/v,聚山梨醇酯-800.02%w/vo顯然,可以使用許多其它緩沖液,適于純化的(腺)病毒制備物貯存和藥物施用的一些配制物實(shí)例可例如見于歐洲專利0853660、美國(guó)專利6,225,289及國(guó)際專利申請(qǐng)TO99/41416、TO99/12568、TO00/29024、TO01/66137、WO03/049763、WO03/078592、WO03/061708所述。在某些實(shí)施方案中,所述疫苗進(jìn)一步包含佐劑。佐劑為本領(lǐng)域已知,用以進(jìn)一步增加對(duì)于應(yīng)用的抗原性決定簇的免疫應(yīng)答,包含腺病毒和佐劑的藥物組合物例如在WO2007/110409中揭示,所述文獻(xiàn)援引加入本文。舉例的合適的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁和/或磷酸鋁;油-乳狀液組合物(或者水包油組合物),包括鯊烯-水乳狀液,如MF59(見例如WO90/14837);皂苷配制物,例如QS21及免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)(見例如US5,057,540;W090/03184,WO96/11711,WO2004/004762,WO2005/002620);細(xì)菌或微生物衍生物,例如單磷酰脂質(zhì)A(MPL),3-0-去酰基化MPL(3dMPL),含有CpG-基序的寡核苷酸,ADP-核糖基化細(xì)菌毒素或其突變體,如大腸桿菌不耐熱腸毒素LT,霍亂毒素CT,百日咳毒素PT,或者破傷風(fēng)類毒素TT。佐劑的進(jìn)一步實(shí)例在WO2007/110409中給出。在其它實(shí)施方案中,本發(fā)明使用的疫苗不包含進(jìn)一步的佐劑。在本發(fā)明的方法或應(yīng)用中,如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知,在一個(gè)施用期間提供給患者的腺病毒的劑量可以變化,通常在IXIO7病毒顆粒(vp)至IXIO12Vp之間,優(yōu)選在IXIO8Vp至IXIO1Vp之間,例如在3XIO8至5XIO10vp之間,例如在IO9至3XIOicVp之間。本發(fā)明疫苗的施用可以使用標(biāo)準(zhǔn)施用途徑進(jìn)行。非限制性的實(shí)施方案包括胃腸外施用,如通過(guò)注射,例如進(jìn)血流中、皮內(nèi)、肌肉等,或者粘膜施用,如鼻內(nèi)、口腔等。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述疫苗通過(guò)肌肉注射進(jìn)三角肌中施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知施用本發(fā)明疫苗的各種可能性,以誘導(dǎo)對(duì)于所述疫苗中至少一種抗原的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中,患有活動(dòng)性TB的患者通過(guò)施用本發(fā)明的腺病毒治療,稱之為免疫治療或治療性接種。本文使用的治療是治療性處理,即目的在于改善患者的狀況,優(yōu)選完全解決TB。本發(fā)明的治療包括免疫治療性接種,即目的在于誘導(dǎo)針對(duì)Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原中至少一種的免疫原性應(yīng)答,優(yōu)選針對(duì)其中至少兩種抗原,更優(yōu)選針對(duì)所有三種抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述治療降低患者中Mtb感染水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述治療使得患者的活動(dòng)性TB治愈,更優(yōu)選所述治療最終導(dǎo)致患者中不存在Mtb感染。相反,現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)將疫苗施用給未感染Mtb和/或未患有活動(dòng)性TB的患者而使用相似疫苗目的在于防止或預(yù)防TB。在這種群體中的免疫應(yīng)答和潛在作用可以是極為不同的,且不能預(yù)測(cè)在Mtb-感染的患者中免疫治療的作用,尤其是在患有活動(dòng)性TB的患者中。因此在某些方面中,本發(fā)明提供了在感染Mtb的對(duì)象體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)Mtb抗原的免疫應(yīng)答的方法,所述方法包括給所述對(duì)象施用重組腺病毒載體,所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸,以在所述對(duì)象體內(nèi)表達(dá)所述抗原及誘導(dǎo)對(duì)于至少一種抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的一方面是提供治療患有活動(dòng)性TB的患者的這種方法。在本發(fā)明的某些方面中,所述對(duì)象或患者通過(guò)給其施用能殺滅或至少顯著抑制Mtb生長(zhǎng)的一或多種藥物而進(jìn)一步治療。因此,本發(fā)明還包括免疫治療與藥物治療組合,目的在于防止對(duì)象發(fā)生活動(dòng)性TB或者治愈活動(dòng)性TB患者,優(yōu)選去除所述對(duì)象或患者的任何Mtb感染。在感染Mtb及具有潛伏性或活動(dòng)性TB的患者組中用本發(fā)明的疫苗進(jìn)行的臨床試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的免疫治療性接種不導(dǎo)致Koch’s現(xiàn)象。Koch’s現(xiàn)象被認(rèn)為是由于Thl應(yīng)答增強(qiáng)導(dǎo)致Thl-相關(guān)細(xì)胞因子釋放觸發(fā)含有Mtb的損害壞死而發(fā)生的(Churchyardet.al,2009)。由RobertKoch用結(jié)核菌素治療的許多TB患者受累于全身性反應(yīng),如譫妄、昏迷或絞痛(Burke,1993)。在一些情況中,死亡出現(xiàn)在晚期空洞性肺部疾病患者中(Burke,1993)?;顒?dòng)性TB通常用藥物治療。TB藥物治療的目的是通過(guò)滅菌及防止治療后疾病復(fù)發(fā)而降低Mtb負(fù)荷。最大量的藥物用于治療的初始階段,以在細(xì)菌群體處于最大時(shí)期時(shí)防止抗性菌株出現(xiàn)(MitchisonDA,2005)。藥物抗性危險(xiǎn)隨著時(shí)間隨著所述桿菌負(fù)荷的降低而降低。因此,剩余的TB治療期與治療初始階段相比使用較少的藥物組合(MitchisonDA,2005)。本文所述藥物治療包括給患者施用一或多種抗生素,通常是這些抗生素的組合。這些抗生素能殺滅或至少顯著抑制Mtb生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知及可利用一些這樣的抗生素,其能對(duì)于每個(gè)患者作出最佳選擇。通常治療方案進(jìn)行6個(gè)月,每日施用抗生素。如果在6個(gè)月后測(cè)試仍示出活動(dòng)性TB感染,則將所述治療繼續(xù)進(jìn)行2或3個(gè)月。DOT可用于幫助患者遵循所有指導(dǎo)及跟上復(fù)雜及長(zhǎng)期的治療。推薦使用一種以上的藥物以預(yù)防MDR-TB。可用于治療活動(dòng)性TB的藥物治療中的抗生素包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。治療中可用的其他抗生素包括對(duì)氨基水楊酸,鏈霉素,氨硫脲,氟喹諾酮類,PA824,R207910,利福布汀(rifabutin),利福噴汀(rifapentine),阿米卡星(amikacin),卷曲霉素(capreomycin),環(huán)絲氨酸,乙硫異煙肼,左氧氟沙星(levof1xacin),莫西沙星(moxifloxacin)。每種抗生素的施用劑量通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,通常為至少與提供殺菌活性的最小有效劑量同樣高(見例如Mitchison,2005)。標(biāo)準(zhǔn)治療是以每日給予四種藥物開始,進(jìn)行2個(gè)月。治療的前兩個(gè)月稱作初始階段,每日服用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。在某些方案中,使用鏈霉素代替乙胺丁醇,特別是對(duì)于不能服用乙胺丁醇的那些人,但是通常優(yōu)選乙胺丁醇,以避免HIV傳播。接下來(lái)的階段稱作持續(xù)階段,所述治療減為利福平和異煙肼,每日或每周三次。在某些情況中,在此階段也加入乙胺丁醇。這個(gè)階段在標(biāo)準(zhǔn)方案中進(jìn)行4個(gè)月。在一些情況中,這個(gè)階段延長(zhǎng)至9個(gè)月或如果需要?jiǎng)t更長(zhǎng)。在此期間使用的藥物數(shù)目依賴于敏感性測(cè)試結(jié)果而定。另一標(biāo)準(zhǔn)方案包括8個(gè)月治療方案,其中2個(gè)月初時(shí)階段使用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和鏈霉素,接下來(lái)6個(gè)月繼續(xù)使用氨硫脲和異煙肼;這個(gè)方案有時(shí)乙胺丁醇被取代為氨硫脲以及鏈霉素。如果所述治療由于藥物抗性而未起作用,當(dāng)檢測(cè)示出導(dǎo)致TB的細(xì)菌仍是活性的時(shí),如果需要,可嘗試不同的藥物組合。如果治療未成功可發(fā)生復(fù)發(fā),這種復(fù)發(fā)通常發(fā)生在治療后6-12個(gè)月內(nèi)。復(fù)發(fā)后的治療基于疾病的嚴(yán)重性及在第一次治療期間使用的藥物。因此,標(biāo)準(zhǔn)治療對(duì)于不同患者可不同,但是仍是本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)治療,本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且常規(guī)地根據(jù)情況決定在個(gè)體病例中需要哪種治療。這些技術(shù)人員可遵循WHO關(guān)于TB標(biāo)準(zhǔn)藥物治療的建議。治療活動(dòng)性TB的一些方案參見援引加入本文的Mitchison,2005。所述標(biāo)準(zhǔn)藥物治療可因此通過(guò)本發(fā)明的方法而顯著縮短。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的治療性接種可使藥物治療冗余(redundant),但通常本發(fā)明的藥物治療持續(xù)至少一周、至少兩周、至少三周。在某些實(shí)施方案中,與標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案相比,藥物的施用可縮短至少一個(gè)月,至少兩個(gè)月或更多。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案包括每日施用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇的組合,給予2個(gè)月,隨后每日或每周三次施用利福平和異煙肼及有或無(wú)乙胺丁醇,給予4個(gè)月,所述標(biāo)準(zhǔn)藥物治療可以縮短為總長(zhǎng)少于5個(gè)月、4個(gè)月或更少、3個(gè)月或更少、2個(gè)月或更少、6周或更少、5周或更少、4周或更少。這可以通過(guò)縮短持續(xù)階段或初始階段或者這二者的時(shí)間而實(shí)現(xiàn)。也可以施用與正常相比更少量的藥物,更少的不同藥物的組合,或者更低的頻率。明顯地,這是活動(dòng)性TB治療中的突破,因?yàn)槠滹@著縮短了患者需要服用治療性藥物的時(shí)間,這將導(dǎo)致較低的成本及重要的是降低物流負(fù)擔(dān)及治療的復(fù)雜性。原則上,所述藥物治療與其它疾病的標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療更相似。使用本發(fā)明的方法,與活動(dòng)性TB的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療相比,需要DOT的時(shí)間更有限,在優(yōu)選的實(shí)施方案中,根本不再需要DOT。不受理論的限制,假設(shè)本發(fā)明的方法破壞患者的耐受性,由此在大多數(shù)Mtb細(xì)菌已經(jīng)通過(guò)治療性藥物方案殺滅之后,免疫系統(tǒng)能除去剩余的細(xì)菌,與在抗生素治療后免疫系統(tǒng)通常對(duì)于其它細(xì)菌的作用一樣。當(dāng)在一群患者中測(cè)量時(shí),當(dāng)在例如用藥物方案治療之后6-24個(gè)月測(cè)量時(shí),這導(dǎo)致活動(dòng)性TB的復(fù)發(fā)率顯著降低。標(biāo)準(zhǔn)方法的復(fù)發(fā)率在大約0-2%之間。如果標(biāo)準(zhǔn)藥物方案縮短為4個(gè)月,在24個(gè)月復(fù)發(fā)比例在8-11.8%之間(治療肺結(jié)核中6個(gè)月和4個(gè)月的化療方案臨床試驗(yàn),1981)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明包括施用本發(fā)明的治療性疫苗聯(lián)合治療性藥物施用,給予時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)藥物施用時(shí)間相比顯著減少,獲得與沒(méi)有治療性接種的相同藥物治療觀測(cè)到的復(fù)發(fā)率相比顯著降低的復(fù)發(fā)率。優(yōu)選地,本發(fā)明的縮短的藥物治療方案的復(fù)發(fā)率與6個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案的復(fù)發(fā)率相同或更低。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明的免疫治療性接種組合藥物治療使得在指定時(shí)間與沒(méi)有免疫治療性接種的相同藥物治療方案治療后相同負(fù)荷相比其細(xì)菌負(fù)荷降低。復(fù)發(fā)率可例如作為細(xì)菌學(xué)復(fù)發(fā)率進(jìn)行測(cè)量,在特定時(shí)間如在開始或結(jié)束藥物治療后24個(gè)月或5年通過(guò)陽(yáng)性痰培養(yǎng)測(cè)量。本發(fā)明的治療性疫苗的施用原則上可以在治療性藥物方案之前進(jìn)行,但是由于降低的細(xì)菌負(fù)荷而優(yōu)選在治療性藥物方案期間或之后進(jìn)行,所述治療性藥物方案在這種情況中是指通常施用抗生素的幾個(gè)月的時(shí)間。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述疫苗是在開始藥物治療后0-4個(gè)月內(nèi)施用,例如在開始藥物治療后大約I周,或者大約2、3、4、5、6周,或者大約2個(gè)月,或者大約3個(gè)月,或者大約4個(gè)月。在其它實(shí)施方案中,所述疫苗在開始藥物治療后4個(gè)月以上的時(shí)間施用,例如在開始藥物治療后5、6、7、8、9個(gè)月以上的時(shí)間,甚至可以在藥物治療已經(jīng)停止后施用,例如在開始藥物治療后I年或更長(zhǎng)時(shí)間,例如以防止活動(dòng)性TB復(fù)發(fā)。在其它實(shí)施方案中,所述疫苗也可以在指定時(shí)間點(diǎn)給感染后但未診斷具有潛伏期TB的對(duì)象施用。在某些實(shí)施方案中,疫苗施用一次以上,即使用初免-加強(qiáng)方案施用治療性疫苗。在其中施用疫苗一次以上的情況中,關(guān)于上述治療性藥物施用的疫苗施用時(shí)間是指疫苗的第一劑。在其中施用疫苗一次以上的某些實(shí)施方案中,疫苗的第二劑可以在施用第一劑疫苗之后一周或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后兩周或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后三周或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后六周或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后兩個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后三個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間施用,在施用第一劑疫苗之后四個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間施用等,直至在施用第一劑疫苗幾年后施用。在某些實(shí)施方案中,疫苗的第二劑是在施用第一劑疫苗之后42天施用。在施用一劑以上疫苗的實(shí)施方案中,所述疫苗彼此可以是異源的,例如使用不同的腺病毒血清型初免和加強(qiáng)接種(見例如WO04/037294),例如用人Ad35初免及用人Ad26加強(qiáng),用人Ad26初免及用人Ad35加強(qiáng)等。這被稱作異源初免加強(qiáng)方案。然后不同腺病毒血清型的載體優(yōu)選是本發(fā)明的每個(gè)載體,即包含編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。也可以使用不同載體進(jìn)行初免或加強(qiáng),例如用本發(fā)明的腺病毒初免及用例如編碼相同或其它TB抗原的DNA或MVA加強(qiáng),反之亦然。而且,在Mtb抗原中所述初免和加強(qiáng)疫苗可以不同,例如初免或加強(qiáng)疫苗可省略來(lái)自本發(fā)明腺病毒的Ag85A、Ag85B或TB10.4抗原的一或多個(gè)。在其它實(shí)施方案中,所述疫苗可以是彼此同源的,即施用相同的疫苗作為初免和加強(qiáng)免疫。也可以施用疫苗兩次以上,例如3次、4次等,由此第一次初免施用隨后是一次以上的加強(qiáng)施用。此外,本發(fā)明的治療性疫苗甚至可以在用BCG或重組形式BCG初免之后使用,所述BCG可用于在患者生命早期進(jìn)行接種。在其它實(shí)施方案中,本發(fā)明的疫苗僅施用一次。已經(jīng)觀測(cè)到將本發(fā)明的疫苗施用給患有活動(dòng)性TB的患者產(chǎn)生對(duì)由所述疫苗編碼的Mtb抗原的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。因此在某些方面,提供了本發(fā)明的方法和應(yīng)用,其中重組腺病毒載體的施用在患者中誘導(dǎo)了針對(duì)由所述腺病毒載體編碼的至少一種抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,意味著所述患者具有⑶8淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,例如IL-2、IFN-Y或TNF-α。在某些實(shí)施方案中,所述⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答在第二次施用重組腺病毒載體后被加強(qiáng)。在某些實(shí)施方案中,所述CD8+T細(xì)胞應(yīng)答是多功能的,是指T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一種以上的細(xì)胞因子。這種多功能T淋巴細(xì)胞可增加本發(fā)明治療的效力。也已經(jīng)觀測(cè)到施用本發(fā)明的疫苗產(chǎn)生針對(duì)由所述疫苗編碼的Mtb抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,特別是在用第二劑腺病毒加強(qiáng)后。因此在某些方面中,提供了本發(fā)明的方法和應(yīng)用,其中重組腺病毒的施用在患者中誘導(dǎo)了針對(duì)由所述腺病毒載體編碼的至少一種抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,意味著該患者具有CD4淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,如IL-2、IFN-y或TNF-α。在某些實(shí)施方案中,所述⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答在第二次施用重組腺病毒載體后被加強(qiáng)。測(cè)量抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答如CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知及是常規(guī)的,包括例如ELISP0T,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS),及多重細(xì)胞因子測(cè)定(見例如Havengaetal,2006;Radosevicetal,2007;Lemckertetal,2005;0,Connor,2004)。多藥物抗性TB(MDR-TB)被定義為對(duì)利福平和異煙肼具有抗性(WHO定義)。極端藥物抗性TB(XDR-TB)被定義為除了MDR-TB之外對(duì)任何氟喹諾酮及三種注射用二線藥物(卷曲霉素,卡那霉素和阿米卡星)中的至少一種具有抗性。治療MDR-TB/XDR-TB的策略根據(jù)藥物易感性測(cè)試的結(jié)果而不同,應(yīng)含有已確定或幾乎確定臨床效力的至少4種藥物。所述治療包括6-10個(gè)月的注射藥物階段,隨后口服藥物治療,治療總持續(xù)時(shí)間為18-24個(gè)月(WHO)。本發(fā)明的免疫治療性接種防止治療后TB復(fù)發(fā),特別是由(多)藥物抗性形式Mtb所致TB復(fù)發(fā)。所述接種適于治療活動(dòng)性TB和/或降低由MDR-TB或XDR-TB所致復(fù)發(fā)頻率,以及治療潛伏性TB。本發(fā)明還提供了這樣的優(yōu)勢(shì),即可以用包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體、特別是用如本文所述rAd35載體進(jìn)行TB接種,不用對(duì)(活動(dòng)性)TB的存在進(jìn)行層化或檢測(cè),因?yàn)槿缭诓煌呐R床試驗(yàn)中評(píng)估的,在給活動(dòng)性TB患者或者潛伏性TB患者施用所述疫苗時(shí)均無(wú)Koch’s現(xiàn)象。因此,本發(fā)明還提供了通過(guò)給對(duì)象施用包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體而在暴露后預(yù)防TB的方法。這種對(duì)象已經(jīng)暴露但仍不具有TB的臨床跡象,或者具有未診斷的TB,或者已經(jīng)具有TB臨床跡象及因此具有活動(dòng)性TB。在某些實(shí)施方案中,所述對(duì)象可具有潛伏性TB。施用本發(fā)明的疫苗可延緩或防止該疾病的發(fā)生或進(jìn)展。對(duì)于潛伏性TB,本發(fā)明的免疫治療性接種也可組合藥物治療。舉例的治療潛伏性TB的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案包括施用異煙肼9個(gè)月,或者施用利福平4個(gè)月。同樣,這些標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案根據(jù)本發(fā)明可縮短,例如縮短至少一個(gè)月、至少兩個(gè)月、至少三個(gè)月等。本發(fā)明在如下實(shí)施例中進(jìn)一步闡述。所述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。其只用于說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:在人對(duì)象中用基于Ad35的TB疫苗(Ad35.TB_S)進(jìn)行臨床試驗(yàn)在先前或目前具有結(jié)核病的個(gè)體中進(jìn)行了針對(duì)人對(duì)象的隨機(jī)雙盲安慰劑-對(duì)照臨床試驗(yàn)以評(píng)估Ad35.TB-S的安全性和免疫原性(Havengaetal,2006;Radosevicetal,2007;W02006/053871)。進(jìn)行這項(xiàng)試驗(yàn)是為了保證所述疫苗在先前未認(rèn)定的或具有活動(dòng)性結(jié)核病的對(duì)象中不激發(fā)嚴(yán)重不利反應(yīng),如Koch’s現(xiàn)象。通過(guò)確保所述疫苗在臨床證實(shí)患有結(jié)核病的患者中的安全性,在今后的研究中所述疫苗然后可廣泛施用給更大群體而不需要在對(duì)象中進(jìn)行廣泛TB檢測(cè)。所述研究被設(shè)計(jì)為劑量增加研究,其中疫苗劑量在連續(xù)患者組中增加?;颊呦嗬^招募,接受最低劑量疫苗的患者首先招募并檢測(cè)。相反,接受最聞劑量疫苗的患者在已經(jīng)確定較低劑量疫苗的安全性譜之后最后招募。對(duì)招募者基于開始TB治療的時(shí)間進(jìn)行分層?!爸委熤小睂哟沃械膶?duì)象由在研究第O天之前患有活動(dòng)性TB及目前經(jīng)歷1-4個(gè)月治療的個(gè)體組成?!爸委熀蟆睂哟沃械膶?duì)象在研究第O天之前已經(jīng)開始TB治療至少12個(gè)月。對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行分層,因?yàn)椴磺宄加谢顒?dòng)性TB或者治愈的TB的個(gè)體在接種含有TB抗原后是否處于發(fā)生Koch’s現(xiàn)象的較高危險(xiǎn)。來(lái)自“治療中”和“治療后”層次的對(duì)象在研究第O天均通過(guò)肌肉(IM)接種一次Iml的3x108(1組)和3xl09(2組)病毒顆粒(vp)。3組的對(duì)象在研究第O天和研究第42天接種兩劑3XIOltVp。安慰劑對(duì)照接種無(wú)菌緩沖溶液,其與用于配制疫苗的緩沖液相同(20mMTris,2mMMgCl2,25mMNaCl,鹿糖10%w/v,聚山梨醇酯-800.02%w/v)。在研究結(jié)束時(shí),來(lái)自“治療中”和“治療后”組的各31名患者接受Ad35.TBS。因此,在這項(xiàng)研究中共62名TB感染的患者接受Ad35.TB-S疫苗,對(duì)這些患者跟蹤6個(gè)月以上。為了評(píng)估疫苗在患者中的`安全性,研究人員進(jìn)行連續(xù)注射部位檢測(cè)、肺功能測(cè)試、胸片(CT掃描)、血清血液學(xué)、化學(xué)及監(jiān)測(cè)收集征求(solicited)和未征求(unsolicited)的不良事件。在“治療中”與“治療后”層次中在第一劑注射后經(jīng)常觀測(cè)到輕度至中度注射部位反應(yīng)。但是,在肺功能檢測(cè)中未征求的不利事件和差異的頻率在劑量組之間或各層次之間是不明顯的。重要地,在所有檢測(cè)的疫苗劑量,Ad35.TB-S均不引起與Koch’s現(xiàn)象相似的任何免疫病理學(xué),這表明所述疫苗在用于具有肺TB病史的成人中是安全的。所述疫苗的免疫原性通過(guò)用含有TB抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的肽集合刺激冷藏保存的在特定時(shí)間點(diǎn)收集的周圍血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行評(píng)估。隨后進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)以鑒別在用上述TB抗原刺激時(shí)CD4和CD8淋巴細(xì)胞是否產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2、IFN-Y或/和TNF-α?!爸委熤小睂哟蔚拿庖咴匝芯拷Y(jié)果在圖1_4中示出。圖1-4示出在來(lái)自第3組的“治療中”層次的對(duì)象的ICS研究結(jié)果,給所述對(duì)象在研究第O天和42天施用3XIOicVp的疫苗。ICS測(cè)量了在用含有抗原85A(圖1)、85B(圖2和4)及TB10.4(圖3)的混合肽刺激時(shí)釋放IFNy或TNFα或IL-2的⑶8淋巴細(xì)胞的百分比。在第O天與84天之間的特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量(圖1-4)。在所有劑量均發(fā)現(xiàn)應(yīng)答,且呈現(xiàn)出劑量依賴性,及證實(shí)加強(qiáng)作用。對(duì)于所有測(cè)試的三個(gè)抗原,接種組與安慰劑組相比檢測(cè)到較高百分比的⑶8淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子應(yīng)答(圖1-4)。使用Ag85B,這些增加的應(yīng)答特別明顯(圖2)。在較后的時(shí)間點(diǎn),一些接種的對(duì)象產(chǎn)生1%以上的Ag85B-特異性⑶8細(xì)胞,在一些情況中高到3%(圖2)。分泌一種以上細(xì)胞因子的多功能T淋巴細(xì)胞在針對(duì)TB疾病的天然宿主免疫性中被認(rèn)為是重要的T細(xì)胞亞集。令人感興趣的是用Ad35.TB-S接種導(dǎo)致表達(dá)IFNyHTNFα的多功能⑶8Τ淋巴細(xì)胞百分比增加(圖4)。描述在用Ag85B刺激時(shí)存在表達(dá)IFNYJ^TNFa的⑶8細(xì)胞的ICS測(cè)定結(jié)果可見于圖4,其中當(dāng)與安慰劑對(duì)照組相比時(shí),在第O天和第42天接種后Ag85B-特異性多功能⑶8細(xì)胞的百分比明顯增加。特別相關(guān)的是觀測(cè)到來(lái)自安慰劑組的源自Mtb感染但未接受Ad35.TB-S接種的個(gè)體的CD8淋巴細(xì)胞對(duì)于抗原85A、85B或TB10.4的刺激應(yīng)答較低(圖1_4),指明針對(duì)這些Mtb抗原的明確的淋巴細(xì)胞耐受性??傊@些免疫學(xué)研究的結(jié)果強(qiáng)烈表明所述疫苗在Mtb-感染的個(gè)體中是免疫原性的,所述個(gè)體通常不能激發(fā)針對(duì)Mtb抗原的免疫應(yīng)答。這可通過(guò)對(duì)比安慰劑組中對(duì)象與接種Ad35.TB-S的對(duì)象的免疫應(yīng)答而明顯觀測(cè)到(圖1-4)。這個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果提示所述疫苗具有破壞由Mtb感染誘導(dǎo)的針對(duì)宿主誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的耐受性的固有能力,而不導(dǎo)致表現(xiàn)為Koch’s現(xiàn)象的免疫病理學(xué)損害。這是新的重組TB疫苗在具有肺TB病史的個(gè)體中進(jìn)行的首次試驗(yàn),示出良好的安全性記錄,具有誘導(dǎo)破壞耐受性的免疫應(yīng)答的能力。一個(gè)獨(dú)立的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)相同疫苗在潛伏性TB對(duì)象中的安全性和免疫原性(數(shù)據(jù)未示出),證實(shí)所述疫苗也可安全(不誘導(dǎo)Koch’s現(xiàn)象)用于這種對(duì)象中,以誘導(dǎo)針對(duì)所述疫苗中至少一種、優(yōu)選多種抗原的免疫原性應(yīng)答。實(shí)施例2:Ad35.TB-S疫苗對(duì)小鼠中結(jié)核病藥物治療的縮短治療時(shí)間作用的觀點(diǎn)研究的證實(shí)在此,描述了顯示Ad35.TB-S的縮短TB化療時(shí)間的作用的方法。所述方法利用建立的進(jìn)行TB藥物化療的小鼠模型,對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)以適合用Ad35.TB-S疫苗的實(shí)驗(yàn)。在前2個(gè)月用異煙肼、利福平和吡嗪酰胺治療人,隨后在剩余的4個(gè)月用利福平和異煙肼治療導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)率為l-2%(Neurmberger,2008;Foxet.al,1999)。在小鼠中,相似的治療導(dǎo)致0-10%的復(fù)發(fā)率(Neurmberger,2008)。在近來(lái)的研究中,用這個(gè)6個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)方案治療的BALB/C小鼠呈現(xiàn)出0%復(fù)發(fā)比例,當(dāng)治療縮短至4個(gè)月時(shí)增加至90%(Williamset.al,2009)。在這項(xiàng)研究中,復(fù)發(fā)被定乂為在治療完成3個(gè)月后在將完整肺勾衆(zhòng)鋪板后分離出I個(gè)或更大的CFU(Williamset.al,2009)?;赪illiamset.al的方法,設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)當(dāng)治療縮短至最多4個(gè)月時(shí),包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體(在此為Ad35.TB-S)降低復(fù)發(fā)可能性的能力(圖5)。將BALB/C小鼠通過(guò)噴霧途徑用Mtb菌株H37Rv感染2周,之后分成5個(gè)不同組。第一組作為陽(yáng)性對(duì)照(PC),其中動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)月WHO治療方案治療,已知復(fù)發(fā)率為大約0%。第二組由用4個(gè)月WHO治療方案治療的小鼠組成,作為陰性對(duì)照組(NC-WHO),已知當(dāng)時(shí)復(fù)發(fā)率為大約90%。第三組包含用TB感染但未治療的動(dòng)物,作為Mtb感染對(duì)照(NC-1)。第四組由用4個(gè)月WHO方案治療及在所述治療方案的第I和2個(gè)月用Ad35空白載體接種的動(dòng)物組成(NC-V)。NC-V組作為陰性對(duì)照以監(jiān)測(cè)任何與接種相關(guān)的不利作用。為了檢測(cè)Ad35.TB-S接種對(duì)防止復(fù)發(fā)的作用,將一組動(dòng)物用4個(gè)月的WHO方案治療及在治療開始后I和2個(gè)月用Ad35.TB-S接種(T-V)?;谙葘?dǎo)研究中的免疫原性確定這項(xiàng)研究中疫苗和空白載體對(duì)照的1010病毒顆粒的劑量是最佳的。如果用Ad35.TB-S接種在TB化療4個(gè)月后導(dǎo)致與單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)化療相比更有效的殺菌活性,接種的動(dòng)物在治療停止后的復(fù)發(fā)比例低于未接種的對(duì)照(T-V對(duì)NC-WHO和NC-V)。在圖5中示出的特定時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行ELISpot測(cè)定(RadosevicKet.al,2007;HavengaMet.al.,2006;LemckertAAet.al,2005)以確定對(duì)于疫苗抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。特別地,將分離自每組動(dòng)物的脾細(xì)胞用在疫苗內(nèi)編碼的來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的抗原如Ag85A、Ag85B和TB10.4刺激。對(duì)于Ag85A,使用已知的⑶4和⑶8肽以鑒定在本研究中刺激的精確T細(xì)胞亞集。在用抗原刺激時(shí)IFN-Y分泌的數(shù)量級(jí)用作T細(xì)胞應(yīng)答性的指標(biāo)。ELISpot研究結(jié)果表明當(dāng)與對(duì)照組(NC-WH0和NC-V)相比時(shí),在T-V組中所述疫苗顯著加強(qiáng)針對(duì)所有檢測(cè)的抗原的免疫應(yīng)答。對(duì)于幾乎所有使用的抗原,在T-V組中由接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答明顯高于NC-1組,后者含有更高的全身性細(xì)菌負(fù)荷。在疫苗T-V組內(nèi)對(duì)Ag85A的⑶8應(yīng)答也一致地較高。這些有希望的免疫原性結(jié)果提示所述疫苗當(dāng)在小鼠中用作TB化療的輔助手段時(shí)能克服慢性TB感染所致的T細(xì)胞無(wú)應(yīng)答性。為了支持得自免疫原性ELISpot研究的數(shù)據(jù)及鑒別保護(hù)作用的潛在聯(lián)系,在進(jìn)行ELISpot分析的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了多重細(xì)胞因子分析。對(duì)得自所有組中動(dòng)物的肺樣品進(jìn)行組織病理學(xué)分析以檢測(cè)可能與用Ad35.TB-S接種相關(guān)的肺病理學(xué)。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)而言,來(lái)自初次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的樣品作為基線對(duì)照。在迄今為止的所有案例中,與對(duì)照組相比在接種的T-V組中均沒(méi)有觀測(cè)到免疫病理學(xué)。這些結(jié)果證實(shí)當(dāng)所述疫苗在嚴(yán)密控制的小鼠感染模型中在TB感染中使用時(shí),其具有與在人體試驗(yàn)中相同的極佳的安全性譜。預(yù)期這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在化療方案中加入疫苗導(dǎo)致當(dāng)與僅用標(biāo)準(zhǔn)化療方案相比時(shí)復(fù)發(fā)率降低,這是由于治療期間由所述疫苗激發(fā)的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答所致。總之,這些結(jié)果表明Ad35.TB-S可以與化療聯(lián)合使用以縮短治療持續(xù)時(shí)間和/或復(fù)發(fā)率和/或降低細(xì)菌負(fù)荷??股刂委煏r(shí)間長(zhǎng)度、使用的抗生素及用腺病毒疫苗的接種時(shí)機(jī)在這個(gè)模型中易于變化。例如,用抗生素治療的時(shí)間長(zhǎng)度縮短為3個(gè)月,2個(gè)月,6周,4周,及如果認(rèn)為有效的更短時(shí)間。實(shí)施例3:在小鼠TB治療模型中通過(guò)Ad35.TB-S與Ad26.TB-S疫苗的異源加強(qiáng)的治療性接種的作用首次異源初免-加強(qiáng)疫苗由牛津的AdrianHill小組在人體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)(Schneideretal.1998),試驗(yàn)設(shè)計(jì)為研究預(yù)防性疫苗針對(duì)瘧疾的免疫原性。然后觀測(cè)到用攜帶相同抗原的不同載體的初免和加強(qiáng)導(dǎo)致由于記憶T細(xì)胞增殖所致的明顯增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。為了檢測(cè)用Ad35初免及用Ad26加強(qiáng)在縮短TB治療時(shí)間時(shí)是否明顯導(dǎo)致免疫原性增強(qiáng)以及復(fù)發(fā)比例下降,在實(shí)施例2所示研究中加入兩個(gè)額外臂(arm)(圖6)。在一個(gè)臂中,在4個(gè)月治療結(jié)束時(shí)另外給予含有與Ad35.TB-S相同抗原的Ad26.TB-S接種。如果Ad26.TB-S加強(qiáng)免疫在此感染階段增強(qiáng)免疫應(yīng)答并靶向緩慢生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)持留菌,則在此臂中在該研究結(jié)束時(shí)動(dòng)物復(fù)發(fā)比例應(yīng)該甚至低于在治療I和2個(gè)月接受兩次Ad35.TB-S接種的實(shí)驗(yàn)組。為了對(duì)照單獨(dú)的Ad26載體的作用,加入另一個(gè)臂。這個(gè)Ad26對(duì)照組預(yù)期復(fù)發(fā)比例與接受兩次單獨(dú)的Ad35.TB-S接種的組(T-V)相同。為了確定Ad26.TB-S加強(qiáng)是否導(dǎo)致免疫原性增強(qiáng),在免疫之前及在接種之后2周進(jìn)行ELISpot測(cè)定,如圖6所示。ELISpot研究結(jié)果高度支持Ad26.TB-S接種導(dǎo)致顯著加強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答,超過(guò)在治療期間用初始Ad35.TB-S接種可見的最高應(yīng)答。相反,對(duì)照載體不激發(fā)任何加強(qiáng)效應(yīng),證實(shí)所述免疫應(yīng)答靶向所述載體內(nèi)包含的抗原。如實(shí)施例2所述,在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取組織病理學(xué)樣品以保證沒(méi)有由于用Ad26.TB-S加強(qiáng)所致的免疫病理學(xué)發(fā)生。參考文獻(xiàn)BurkeDS.0fpostulatesandpeccadiI1es:RobertKochandvaccine(tuberculin)therapyfortuberculosis.Vaccine.1993;11(8):795-804.CardonaPJ.RUT1:anewchancetoshortenthetreatmentoflatenttuberculosisinfection.Tuberculosis(Edinb).2006May-Jul;86(3-4):273-89.Clinicaltrialof6-monthand4-monthregimensofchemotherapyinthetreatmentofpulmonarytuberculosis:theresultsupto30months.Tubercle.1981;62(2):95-102.ChurchyardGJ,KaplanG,F(xiàn)allowsD,WallisRSjOnyebujohP,RookGA.Advancesinimmunotherapyfortuberculosistreatment.ClinChestMed.2009Dec;30(4):769-82.FanM,ChenXjWangK,etal.AdjuvanteffectofMycobacteriumvaccaevaccineonrecurrenttreatedpulmonarytuberculosis:ameta-analysis.ChineseJournalofEvidence-BasedMedicine.2007;7(6):449-55FoxWjEllardGA,MitchisonDA.StudiesonthetreatmentoftuberculosisundertakenbytheBritishMedicalResearchCounciltuberculosisunits,1946—1986,withrelevantsubsequentpublications.1ntJTubercLungDis.19990ct;3(10Suppl2):S231_79.HaSJ,JeonBY,YounJIjKimSC,etal.ProtectiveeffectofDNAvaccineduringchemotherapyonreactivationandreinfectionofMycobacteriumtuberculosis.GeneTher.2005Apr;12(7):634-8.HavengaMjRVogels,DZuijdgeestjKRadosevicjetal.2006.Novelreplication-1ncompetentadenoviralB-groupvectors:highvectorstabilityandyieldinPER.C6cells.J.Gen.Virol.87:2135-2143.LemckertAA,SumidaSM,HoltermanLjVogelsR,etal.1mmunogenicityofheterologousprime-boostregimensinvolvingrecombinantadenovirusserotype11(Adll)andAd35vaccinevectorsinthepresenceofanti_Ad5immunity.JVirol.2005Aug;79(15):9694-701LowrieDB,TasconRE,BonatoVLjLimaVMjetal.TherapyoftuberculosisinmicebyDNAvaccination.Nature.1999Jul15;400(6741):269-71.MitchisonDA.2005.Thediagnosisandtherapyoftuberculosisduringthepast100years.AmJRespirCritCareMed171:699-706.NuermbergerE.Usinganimalmodelstodevelopnewtreatmentsfortuberculosis.SeminRespirCritCareMed.2008Oct;29(5):542-51OiConnorKAjHolguinA,HansenMK,MaierSFjWatkinsLR..Amethodformeasuringcytokinesfromsmallsamples.Brain,BehaviourandImmunity.2004,18(3);274_280RadosevicKjCWWielandjARodriguez,GJWeverlingjetal.2007.Protectiveimmuneresponsestoarecombinantadenovirustype35Tuberculosisvaccineintwomousestrains:CD4andCD8T—cellepitopemappingandroleofgammainterferon.1nfectImmunity75:4105-4115.Schneider,J.etal.EnhancedimmunogenicityforCD8+TcellinductionandcompleteprotectiveefficacyofmalariaDNAvaccinationbyboostingwithmodifiedvacciniavirusAnkara.Nat.Med.4,397-402(1998)TaylorJLjOCTurner,RJBasarabajJTBelislejetal.2003.PulmonarynecrosisresultingfromDNAvaccinationagainstTuberculosis.1nfect.1mmun.71:2192-2198.WeicholdFFjMuellerSjKortsikCjHitzlerWE,etal.2007.1mpactofMCHclassIallel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