包含小熱激蛋白的微粒的制作方法

專利名稱：包含小熱激蛋白的微粒的制作方法
包含小熱激蛋白的微粒發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。具體而言，其屬于用于治療炎性疾病的藥物領(lǐng)域。發(fā)明背景
小熱激蛋白家族以一個共同特點為特征，即存在含90-100個殘基的高保守的所謂α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域。脊椎動物眼晶狀體蛋白-αΑ-和α B-晶體蛋白以及包括HSPBl、HSPB2、HSPB3、HSPB6、HSPB7、HSPB8、HSPB9 和 HSPBlO 在內(nèi)的 15-30-kDa 熱激蛋白普遍存在的群均屬于該小熱激蛋白組。眼晶狀體α晶體蛋白的2個亞基是a A-晶體蛋白(CRYAA)和α B-晶體蛋白(CRYAB)。雖然CRYAA優(yōu)選在眼晶狀體中表達(dá)，CRYAB在許多組織和器官中廣泛表達(dá)。認(rèn)為小熱激蛋白的主要作用是抵消脅迫條件對細(xì)胞完整性的去穩(wěn)定化影響。有證據(jù)顯示其參與變性疾病等。
α晶體蛋白被描述為許多疾病和病癥中的潛在藥物。W02008073466中，描述了抑制患者炎性疾病的方法，所述方法包含給予患者治療有效劑量的游離可溶CRYAB蛋白，其中組織內(nèi)受自身免疫病影響的免疫細(xì)胞在該試劑存在下減少活化。W09533997中，描述了游離可溶CRYAB蛋白在多發(fā)性硬化中的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
α晶體蛋白家族的蛋白的缺點是這些作為游離可溶蛋白的產(chǎn)品不如預(yù)期有效，特別是給予人時。本發(fā)明的目標(biāo)是解決此問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):小熱激蛋白以生物可降解微粒形式給予時相較以其游離可溶形式給予時，能有效得多地激活巨噬細(xì)胞。因此，此發(fā)明方面的小熱激蛋白不作為游離可溶蛋白給予。
因此，本發(fā)明提供一種生物可降解微粒，所述生物可降解微粒的直徑為0.2-3.5微米，且含藥學(xué)有效量的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-10產(chǎn)生的至少一種小熱激蛋白，所述小熱激蛋白包含與SEQ ID NO:1和12-26所列任何序列具有至少50%相同性的氨基酸序列或其組合。與SEQ ID NO:1和12-26所列任何序列有至少50%的氨基酸序列相同性表明所述小熱激蛋白包含α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域。這種α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域是確定其是否激活巨噬細(xì)胞的蛋白活性區(qū)，巨噬細(xì)胞活化通過誘導(dǎo)該巨噬細(xì)胞中IL-10產(chǎn)生而趨于明顯。α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域可與SEQ ID NO:1和12-26具有至少50%，優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少60%、70%、80%、90%或95%的氨基酸序列相同性 。所述小熱激蛋白優(yōu)選是具有選自SEQ ID N0:2-ll的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所述小熱激蛋白更優(yōu)選是具有SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選實施方式中，所述生物可降解微粒是生物可相容的。在其它優(yōu)選實施方式中，所述微粒包含己內(nèi)酯、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)或乳酸-羥甲基乙醇酸共聚物(PLHMGA)。所述生物可降解微粒優(yōu)選具有0.2-5 μ m的平均直徑，更優(yōu)選0.2-3.5 μ mD
本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明用于對象醫(yī)學(xué)治療的生物可降解微粒。所述對象優(yōu)選是人對象。所述醫(yī)學(xué)治療優(yōu)選針對炎性疾病。所述炎性疾病優(yōu)選是皮膚、粘膜、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、胰腺或關(guān)節(jié)的急性或慢性炎癥性病癥，優(yōu)選皮炎、牛皮癬、濕疹、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、牙周炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、慢性阻塞性肺疾病、氣腫、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視神經(jīng)炎、腦炎、炎性周圍神經(jīng)病、動脈粥樣硬化、血管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿病。本發(fā)明還提供含治療有效劑量的本發(fā)明所述生物可降解微粒的藥物組合物。優(yōu)選地,藥物組合物中存在的至少百分之50、60、70、80或90的微粒是本發(fā)明的所述生物可降解微粒。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明所述生物可降解微粒的方法，所述方法包括以下步驟:混合含CRYAB的水溶液與溶于揮發(fā)性有機溶劑(優(yōu)選二氯甲烷(DCM))的己內(nèi)酯、PLA、PLGA或PLHMGA溶液，以提供水/揮發(fā)性有機溶劑二相系統(tǒng)；乳化所述水/揮發(fā)性有機溶劑二相系統(tǒng)以提供油包水乳液；向含聚乙烯醇的水溶液中加入所述油包水乳液，并乳化所得混合物以提供水包油包水乳液；使所述揮發(fā)性有機溶劑從所述水包油包水乳液中蒸發(fā)，并在所述蒸發(fā)過程中形成生物 可降解微粒。本發(fā)明還提供治療患有炎性疾病的對象的方法，包含給予所述對象治療有效量的本發(fā)明的生物可降解微粒或本發(fā)明的藥物組合物。附圖簡要說明

圖1顯示基于乳酸和乙醇酸合成具有羥基側(cè)基的親水性聚酯。圖1的反應(yīng)流程顯示親水性聚酯合成中的關(guān)鍵步驟，所述親水性聚酯能用于產(chǎn)生比傳統(tǒng)聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物更親水的微球。這種微球的制備由Ghassemi等更詳細(xì)描述[J.Control.Releasel38:57-63 (2009)]。BMMG 單體中 R=CH3。圖2顯示基于親水性PLHMGA聚合物或PLGA聚合物的含CRYAB微球的掃描電子顯微照片。圖2的圖像顯示用傳統(tǒng)聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物(PLGA)或含羥甲基化聚酯(PLHMGA)的更親水形式所得微粒的類似大小分布。如實施例中更詳細(xì)描述制備的PLGA微球的直徑一般為0.2-3.5微米，以類似方式制備的PLHMGA微球直徑一般為0.2-2微米。圖3顯示用游離可溶CRYAB (左)和微球包封的CRYAB (右)誘導(dǎo)IL-10。圖3的數(shù)據(jù)顯示由微球包封的CRYAB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-10比將巨噬細(xì)胞暴露于游離可溶CRYAB有效得多。還顯示PLHMGA微粒甚至比PLGA微粒更有效。圖4顯示α晶體蛋白/小熱激蛋白的10個家族成員的序列比對。加框的序列表不保守α晶體蛋白樣結(jié)構(gòu)域[摘自Kapp6等.(2003)Cell Stress Chaperones8:53]。圖4顯示所有目前已知的10種α晶體蛋白/小熱激蛋白的序列比對，突出顯示稱為α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域的具顯著同源性的蛋白區(qū)段。圖5顯示CRYAB的α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(殘基68-148)與其它小熱激蛋白的α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域之間的同源性。序列相同性由雙點指示，結(jié)構(gòu)同源性通過位于殘基間的單點指示。此圖更詳細(xì)顯示10種不同人小熱激蛋白間序列相同性和結(jié)構(gòu)同源性的程度。圖6顯示空PLGA微球不僅不能誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生，而且不影響由含CRYAB微球誘導(dǎo)的IL-10產(chǎn)生。
當(dāng)將降低濃度的空微球加入人巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物以補充增加濃度的含CRYAB微球至恒定總微球水平時，反應(yīng)概況與僅用增加濃度的含CRYAB微球所得的相同。這證實巨噬細(xì)胞對含CRYAB的PLGA-微球的反應(yīng)確實由包封的蛋白介導(dǎo)，而不是該微球介導(dǎo)。具有相同大小和化學(xué)特征的空PLGA微球不僅不能誘導(dǎo)任何產(chǎn)生，其還不影響含CRYAB微球?qū)L-10的誘導(dǎo)。
圖7顯示人血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞和人腦源性小膠質(zhì)細(xì)胞對多個含CRYAB微球的迅速和完全吞噬作用
不同于對微球所探求的大部分應(yīng)用，本發(fā)明不旨在于數(shù)日到數(shù)周內(nèi)從微球緩慢釋放治療蛋白。相反，本發(fā)明旨在由巨噬細(xì)胞迅速攝取含CRYAB微球，并隨后迅速釋放吞噬體內(nèi)的治療蛋白。圖3顯示此策略如何引起人巨噬細(xì)胞中在20小時時間范圍內(nèi)顯著產(chǎn)生抗炎因子IL-10。圖7中，還顯示目前描述的含CRYAB微球如何被不同類型人巨噬細(xì)胞迅速和基本完全吞噬。右側(cè)圖中，顯示24小時時間范圍內(nèi)每個細(xì)胞攝入多個微球的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。顯示此時間階段中無任何添加培養(yǎng)的細(xì)胞或提供游離可溶CRYAB的細(xì)胞以用于比較。
圖8顯示由含CRYAB的PLGA微球誘導(dǎo)的人免疫應(yīng)答的抗炎質(zhì)量。
不同于其它哺乳動物，成年人免疫系統(tǒng)包含應(yīng)答CRYAB的記憶T細(xì)胞以及針對CRYAB的血清抗體。此免疫響答性通過天然過程啟動，且在所有人中發(fā)現(xiàn)。此情況導(dǎo)致的缺點是游離可溶CRYAB不僅激活人中的巨噬細(xì)胞，還能激活引起炎癥而不是有助于緩解炎癥的記憶T細(xì)胞。圖8顯示游離可溶CRYAB確實誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中的抗原特異T細(xì)胞應(yīng)答(左圖；上圖針對⑶4+輔助T細(xì) 胞，下圖針對⑶45R0+記憶T細(xì)胞)。因此，游離可溶CRYAB在抑制對另一抗原(在本情況下為破傷風(fēng)類毒素)的T細(xì)胞應(yīng)答中無效(右圖)。事實上，向外周血單個核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中添加游離可溶CRYAB引起T細(xì)胞應(yīng)答增加。相反，含CRYAB微球而不是空微球強烈抑制對破傷風(fēng)類毒素的T細(xì)胞應(yīng)答，強調(diào)其抗炎作用。因此，與游離可溶CRYAB相反，含CRYAB微球激活巨噬細(xì)胞的抗炎反應(yīng)，而不引發(fā)(記憶)T細(xì)胞的促炎反應(yīng)。
圖9顯示加載CRYAB的PLGA微球在慢性阻塞性肺病(COPD)小鼠模型中的治療性抗炎活性
含CRYAB微球的治療性抗炎活性通過治療COPD小鼠模型中用香煙煙氣(cigarette smoke)誘導(dǎo)炎癥來證明。由于香煙煙氣誘導(dǎo)的肺部炎癥，大量淋巴細(xì)胞、巨曬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在6天內(nèi)浸潤肺部。在首次暴露于煙后開始用含CRYAB微球進(jìn)行一天2次治療，引起明顯和統(tǒng)計上顯著抑制淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集，分別使這些浸潤細(xì)胞數(shù)目減少75%和44%(圖9A)。巨噬細(xì)胞數(shù)目減少明顯更溫和，且未達(dá)到統(tǒng)計顯著的水平。相反，相當(dāng)或甚至更高劑量的游離可溶CRYAB不能產(chǎn)生這種治療性抗炎效果(圖9B)。除了對細(xì)胞浸潤的治療性抑制效果，通過微球包封CRYAB幾乎完全防止了通常在COPD期間發(fā)現(xiàn)的動物體重減輕(圖9C)。
圖10顯示將含CRYAB的PLGA微球氣管內(nèi)給予暴露于煙的小鼠后從支氣管肺泡灌洗液收集的細(xì)胞的蘇木精-伊紅染色。
所述圖顯示氣管內(nèi)給予小鼠含CRYAB的微球后，其僅被肺泡巨噬細(xì)胞選擇性攝取。用微球治療性處理小鼠5天以抑制煙誘導(dǎo)的炎癥后，通過支氣管肺泡灌洗從肺收集所有細(xì)胞。在由此獲得的細(xì)胞群中，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞能輕易根據(jù)其形態(tài)鑒定。微球還通過其暗外觀和大小輕易鑒定。此圖還顯示，僅大的活化巨噬細(xì)胞包含被吞噬的微球，而中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞則不包含。這確認(rèn)了含CRYAB的PLGA微球的治療效果僅由巨噬細(xì)胞應(yīng)答這些微粒而介導(dǎo)。圖11顯示本文所定義小熱激蛋白家族的不同成員在人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中對白介素-10的誘導(dǎo)。從所有值中減去IL-10背景水平。所述圖顯示除了 CRYAB，小熱激蛋白家族的其它成員也具有誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生有力免疫調(diào)節(jié)因子IL-10的能力。所示重組、純化的熱激蛋白以5μ g/mL濃度加入經(jīng)分化人巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中，培養(yǎng)基中出現(xiàn)的IL-10水平如前所述定量。測量重復(fù)兩次進(jìn)行。此圖所示結(jié)果確認(rèn)CRYAB的熱激蛋白家族成員不僅共有保守α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域，還由于此而共有激活巨噬細(xì)胞的能力。發(fā)明詳述定義本文所用的術(shù)語“微?！焙w“納米粒子”、“微膠囊”、“微珠”和“微球”。關(guān)鍵在于本文所用的微粒是小于3.5 μ m且大于0.2 μ m的生物可降解顆粒，優(yōu)選小于2 μ m且大于Ium0本文所指定微粒大小指平均粒徑。微粒大小重要，這是因為所述微粒必須由吞噬細(xì)胞吞噬以通過釋放本文所示小熱激蛋白來激活吞噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的激活通過巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生而變得明顯。所述微?？删哂腥魏涡问?，包括基本球狀和不規(guī)則形式。如果微粒不是球形，術(shù)語直徑指所述微粒可匹配(fit)的最小球面結(jié)構(gòu)內(nèi)徑。微粒可為均勻微粒。本文所用的術(shù)語“均勻微?！敝钙浠钚詣?即α晶體蛋白) 在整個微粒中分散或溶解的微粒。均勻微粒在結(jié)構(gòu)上優(yōu)選由賦形劑基質(zhì)形成，通常是聚合物賦形劑。均勻微粒中，優(yōu)選所述聚合物賦形劑是生物可降解聚合物。優(yōu)選所述生物可降解聚合物遍布各均勻微粒存在，活性劑捕獲于所述生物可降解聚合物分子內(nèi)。所述聚合物賦形劑可具有同一聚合物或包含不同類型聚合物的混合物?？捎糜诒景l(fā)明方面的其它微粒是包封微粒。本文所用的術(shù)語“包封微?！敝赴锟山到獍碌奈⒘＃霭掳夂鲈噭┑慕M合物或基本純形式的試劑。所述試劑可在整個所述組合物中分散或溶解。具有延遲所述試劑釋放功能的包封微粒外膜優(yōu)選包含生物可降解聚合物或由其組成。本文所用的術(shù)語“生物可降解微粒”指微粒在生理條件下隨著時間分解成較小片段或釋放活性劑的能力。降解可通過例如酶、化學(xué)或物理過程發(fā)生。生物可降解微粒通常經(jīng)藥物擴散和聚合物侵蝕的組合來釋放其試劑。所述較小片段優(yōu)選小于生物可降解微粒在生理條件下暴露于流體前所具有的90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1%微粒直徑。在生物可降解微粒的優(yōu)選實施方式中，較小片段指小于50、40、30、20、10nm的片段。術(shù)語“生理條件”指生物系統(tǒng)中存在的條件。其優(yōu)選指微粒所暴露于的流體的可能參數(shù)值，如果所述參數(shù)具有活溫血脊椎動物組織或體液中出現(xiàn)的某一值，則所述參數(shù)值被視作是生理性的。所述參數(shù)優(yōu)選包含溫度、鈉濃度、液體靜壓力、滲透壓、和/或pH?！吧項l件下”優(yōu)選指至少所述流體的溫度、液體靜壓力、滲透壓和PH在活溫血脊椎動物組織或體液中正常出現(xiàn)的值范圍內(nèi)。所述生理條件優(yōu)選包括35-41度的溫度，pH2-9，更優(yōu)選7_8，且甚至更優(yōu)選7.35-7.45。在替代的優(yōu)選實施方式中，所述生理條件指巨噬細(xì)胞內(nèi)涵體和/或吞噬體小室內(nèi)出現(xiàn)的參數(shù)值，涉及降低的pH，優(yōu)選5-7。更優(yōu)選地，其指血液、白血球，最優(yōu)選巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)的可能參數(shù)值。在優(yōu)選實施方式中，術(shù)語生物可降解指微粒為巨噬細(xì)胞攝取時被降解。更優(yōu)選地，所述微粒在巨噬細(xì)胞內(nèi)的降解速率高于體液，優(yōu)選血液。
本文所用的術(shù)語“隨著時間”指一年內(nèi)，但更優(yōu)選一個月內(nèi)、一周內(nèi)或一小時內(nèi)。
本文所用的術(shù)語“生物可降解聚合物”指如上所述在生理條件下隨著時間降解的聚合物。生物可降解聚合物的示例包括具有至少一些重復(fù)單位的那些聚合物，所述重復(fù)單元的代表為如下所述中的至少一種:α -羥基羧酸、α -羥基羧酸的交酯、二氧噁烷酮、內(nèi)酯、環(huán)狀碳酸酯、環(huán)草酸鹽、環(huán)氧化物、乙二醇和酸酐。優(yōu)選的生物可降解聚合物包含至少一些重復(fù)單元，所述重復(fù)單元的代表為如下所述中的至少一種:乳酸、乙醇酸、丙交酯、乙交酯、環(huán)氧乙烷和乙二醇。
優(yōu)選的生物可降解聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚酐、聚原酸酯、聚醚酯、聚已酸內(nèi)酯、聚酯酰胺、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、其混合物和共聚物。
待用于本過程的聚合物的考慮分子量范圍能由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于一些因素容易地確定，如所需的聚合物降解速率，或優(yōu)選在(模擬)體內(nèi)條件下(優(yōu)選人中)的巨噬細(xì)胞活化水平。通常，分子量范圍為2000-2，000, 000道爾頓。
優(yōu)選的聚合物選自 -己內(nèi)酯、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和乳酸-羥甲基乙醇酸共聚物(PLHMGA)。優(yōu)選由這些聚合物形成本發(fā)明所述微粒的基質(zhì)材料。
本文所用的術(shù)語“乳酸和/或乙醇酸(共)聚合物”意在指單獨乳酸的聚合物、單獨乙醇酸的聚合物、所述聚合物的混合物、乙醇酸和乳酸的共聚物、所述共聚物的混合物、或所述聚合物和共聚物的混合物。
術(shù)語“生物相容性聚合物”指降解成無毒產(chǎn)物的生物相容性聚合物。降解成無需從生物系統(tǒng)移除的無毒產(chǎn)物的生物相容性聚合物的特定示例包括聚氫酸(poly(hydroacids))、聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸和其共聚物。
本文所用的術(shù) 語“生物相容性微?！敝笇ι锵到y(tǒng)沒有毒性或有害作用的微粒。在生物可降解微粒的一個優(yōu)選實施方式中，其指如下的微粒:能在醫(yī)療治療方面行使其所需功能，且不引起該治療受體或受益者中任何不需要的局部或全身效果，但在該特定情況中產(chǎn)生合適的有益細(xì)胞或組織反應(yīng)，優(yōu)選優(yōu)化所述治療的臨床相關(guān)性能。
本文所用的術(shù)語“藥物遞送裝置”指沒有活性劑的微?！，F(xiàn)有技術(shù)中已描述了許多微粒類型，或產(chǎn)生此類微粒的方法，有時指定納入特定活性劑。如果本文提及特定現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的某一微粒，若該現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)指定納入特定活性劑，則意味著提及無現(xiàn)有技術(shù)活性劑的微粒(除非另有說明)。如果提及產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)特定微粒(其中特定活性化合物被納入該特定微粒)的方法，則意味著提及用本文所述小熱激蛋白替代現(xiàn)有技術(shù)的活性劑的方法。
術(shù)語“小熱激蛋白”在本文中用于指與圖4所示任一小熱激蛋白HSPBl、HSPB2、HSPB3、HSPB4、HSPB5、HSPB6、HSPB7、HSPB8、HSPB9*HSPB1(^3 α 晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO: 2-11)的氨基酸序列相同性為至少約為50%的蛋白質(zhì)化合物，優(yōu)選至少56%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更加優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，特別優(yōu)選至少97%、98%，最優(yōu)選至少99%的蛋白質(zhì)化合物。優(yōu)選氨基酸序列相同性涉及至少40個連續(xù)氨基酸的區(qū)域，更優(yōu)選至少50個，更優(yōu)選至少60個，更優(yōu)選至少70個，更優(yōu)選至少73個，更優(yōu)選至少74個，更優(yōu)選至少75個，更優(yōu)選至少77個，最優(yōu)選至少80個連續(xù)氨基酸的區(qū)域。所述小熱激蛋白優(yōu)選具有選自SEQ ID ΝΟ:2-11組的序列的氨基酸序列。本文所用的“氨基酸序列相似性”指2種多肽或蛋白質(zhì)間存在相似性。如果2種序列中的氨基酸序列在對齊用于最大對應(yīng)時相同，多肽具有“相似”序列。2種或多種多肽間的序列比較一般通過在比較窗口中比較2種序列部分來進(jìn)行，以鑒定和對比具有序列相似性的局部區(qū)域。比較窗口一般從約10到80個連續(xù)氨基酸。多肽的“序列相似性百分?jǐn)?shù)”如百分之50、60、70、80、90、95、98、99或100序列相同性可通過在比較窗口中比較2種最優(yōu)比對序列來確定，其中比較窗口中的多肽序列部分可包括就最優(yōu)比對2種序列而言相較參照序列(不包含添加或缺失)的氨基酸缺失、修飾或單氨基酸或氨基酸組添加。所述百分?jǐn)?shù)通過以下計算:(a)確定2種序列中出現(xiàn)相同氨基酸的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)；(b)將匹配位置數(shù)除以比較窗口中的總位置數(shù)；和(c)將結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列相似性百分?jǐn)?shù)。用于比較的最優(yōu)序列比對可通過計算機執(zhí)行已知算法或通過目測來進(jìn)行。序列比較和多序列比對算法可輕易獲自因特網(wǎng)，例如William Pearson的“LALIGN”程序。LALIGN程序執(zhí)行Huang 和 Miller 的算法，發(fā)表于 Adv.Appl.Math.(1991) 12:337-357。其能見于http://www.c h.embnet.0rg/software/LALIGN form, html。術(shù)語“巨噬細(xì)胞”包括由單核細(xì)胞擴增和分化產(chǎn)生的組織內(nèi)白血球。通常，巨噬細(xì)胞的直徑約為21微米。巨噬細(xì)胞駐留在可能發(fā)生微生物入侵或灰塵聚集的戰(zhàn)略點。本發(fā)明方面的巨噬細(xì)胞包括不同類型的巨噬細(xì)胞，由其體內(nèi)定位確定。這些巨噬細(xì)胞有特定名稱。優(yōu)選的巨噬細(xì)胞包括位于肺部肺泡中的塵細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞，位于結(jié)締組織中的組織細(xì)胞，位于肝中的枯氏細(xì)胞，位于神經(jīng)組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞，位于肉芽腫中的上皮樣細(xì)胞，位于骨中的破骨細(xì)胞，位于脾中的竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal lining cell)和位于腎中的系膜細(xì)胞。體外鑒定巨噬細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，且包括使用針對巨噬細(xì)胞上所存在的膜結(jié)合標(biāo)記物的優(yōu)選單克隆抗體以用于鑒定。優(yōu)選的膜標(biāo)記物包含⑶13、⑶14和 CD68。術(shù)語“活化的巨噬細(xì)胞”指巨噬細(xì)胞的功能性狀態(tài)，以特異細(xì)胞因子和/或趨化因子的表達(dá)水平等為特征。本文所用的術(shù)語“活化的巨噬細(xì)胞”指特征為IL-10、TNF-α、CCLl、IL-13、CCL-5和/或TGF-β產(chǎn)生相對非活化巨噬細(xì)胞增加的巨噬細(xì)胞?；罨木奘杉?xì)胞優(yōu)選不表達(dá)水平顯著高于正常巨噬細(xì)胞的CCL18或IL-12。術(shù)語“顯著更高”指統(tǒng)計上不同的表達(dá)水平，優(yōu)選比未刺激巨噬細(xì)胞高至少5倍，優(yōu)選來自同一對象。所述活化優(yōu)選還以出現(xiàn)胞內(nèi)一氧化氮為特征。所述活化優(yōu)選還以所述巨噬細(xì)胞上出現(xiàn)MHC II類和⑶86表面標(biāo)記物為特征。所述活化的巨噬細(xì)胞優(yōu)選不表達(dá)CD80、CD163、FcyR或甘露糖受體。確定與巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的特異細(xì)胞因子和/或趨化因子水平的優(yōu)選方法涉及使用市售可得酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或PCR擴增特異細(xì)胞因子和/或趨化因子轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選這些特異細(xì)胞因子和/或趨化因子中的至少一種在活化巨噬細(xì)胞中的分泌相較未刺激巨噬細(xì)胞分泌水平顯著更高。優(yōu)選地，所述至少一種細(xì)胞因子的分泌水平與未刺激或非活化巨噬細(xì)胞相比高至少5、10、15、25、50或100，所述未刺激或非活化巨噬細(xì)胞是來自同一來源且在相同條件但沒有刺激下培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞。
術(shù)語“巨噬細(xì)胞的活化”用于指巨噬細(xì)胞經(jīng)歷生理變化產(chǎn)生活化形式的調(diào)控過程。
術(shù)語“炎性疾病”指免疫系統(tǒng)活性被病理性刺激或抑制的機體病理狀態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述活性是炎性疾病的主因。所述炎性疾病優(yōu)選是皮膚、粘膜、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、胰腺或關(guān)節(jié)的急性或慢性炎癥性病癥，優(yōu)選皮炎、牛皮癬、濕疹、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、牙周炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、慢性阻塞性肺疾病、氣腫、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視神經(jīng)炎、腦炎、炎性周圍神經(jīng)病、動脈粥樣硬化、血管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿病。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指給予所述微粒的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體能包含適于遞送所述微粒至治療靶標(biāo)的任何物質(zhì)或載劑。所述術(shù)語指任何藥物載體，所述載體本身不誘導(dǎo)對接受組合物個體有害的抗體產(chǎn)生，其可被給予而沒有過度毒性。合適的載體可為一種或多種可選的穩(wěn)定劑、稀釋劑或賦形劑。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上有效量”指有效引起巨噬細(xì)胞分泌可檢測IL-10水平的本文所述小熱激蛋白量。優(yōu)選用刺激濃度I μ g/mL的包封蛋白在含有100.000-150.000個人巨噬細(xì)胞且總培養(yǎng)基體積為200 μ L的培養(yǎng)孔中能于24小時期間使IL-10聚集到至少Ing/mL的濃度。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”指對預(yù)防、治愈或至少部分抑制紊亂癥狀和其并發(fā)癥所需的本發(fā)明所述生物可降解微粒量。當(dāng)然，有效實現(xiàn)此目標(biāo)的量將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者的體重及整體狀況。通常，體外使用的劑量可對用于原位給予藥物組合物的量提供有用指南，動物模型可用于確定治療特定紊亂的有效劑量。
實施方式
本發(fā)明是基于以下意外發(fā)現(xiàn):含CRYAB的微粒激活巨噬細(xì)胞的有效性遠(yuǎn)高于游離可溶CRYAB。
因此，本發(fā)明提供含CRYAA或CRYAB蛋白的微粒，優(yōu)選含藥學(xué)上有效量。引起強抗炎物質(zhì)IL-10產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞活化預(yù)示了前面記載的不同炎癥小鼠模型中CRYAB蛋白的抗炎效果。
根據(jù)本發(fā)明的微?？捎筛鞣N組合物和結(jié)構(gòu)構(gòu)成?？墒褂弥睆綖?.2-3.5的任何生物可降解微粒。描述了適于制備本發(fā)明所述微粒的許多制備藥物遞送裝置方法，所述方法在微粒中納入藥學(xué)上有效量的小熱激蛋白。原則上，可使用任何微粒如果其可由巨噬細(xì)胞攝取并釋放該巨噬細(xì)胞內(nèi)藥學(xué)上有效量的小熱激蛋白。根據(jù)本發(fā)明的微粒的有效性與其大小等相關(guān)。微粒必須由吞噬細(xì)胞吞噬。因此，優(yōu)選的微粒大小等于或小于3 μ m。這種微粒適于口服或注射遞送、吸入或肺部遞送。
在一個優(yōu)選實施方式中,所述微粒的平均直徑為1-2.5 μ m。在一個優(yōu)選實施方式中，如實施例更詳細(xì)描述所制備的PLGA微粒的直徑為0.5-2微米。此范圍內(nèi)的PLGA微粒非常有效。涉及能以類似方式制備的PLHMGA微粒直徑時，所述直徑優(yōu)選為0.2-2微米以實現(xiàn)好結(jié)果。
微粒優(yōu)選不是脂質(zhì)體。在某些實施方式中，明確否認(rèn)脂質(zhì)體。
合適的微粒是由聚(環(huán)氧乙烷)_聚(L-乳酸)/聚(L-天冬氨酸-e芐酯)構(gòu)成的納米粒子。其合成描述于Majeti N.V.Ravi Kumar的J Pharm PharmaceutSci3 (2):234-258, 2000中的圖1。同樣，在同一文獻(xiàn)中如下記載的納米例子被考慮作為納入藥學(xué)上有效量小熱激蛋白的藥物遞送裝置:聚乙二醇包衣的納米球、疊氮胸苷(AZT)/雙脫氧胞苷(ddc)納米粒子、聚(氰基丙烯酸異丁酯)納米膠囊、獲自聚(L-谷氨酸-y-芐酯)/聚(環(huán)氧乙烷)的納米粒子、殼聚糖-聚(環(huán)氧乙烷)納米粒子和固體脂質(zhì)納米粒。另外，如MajetiN.V.Ravi Kumar 的 J Pharm Pharmaceut Sci3 (2): 234-258，2000中所述的如下材料被考慮作為本文所述小熱激蛋白的藥物遞送裝置:殼聚糖多孔珠、包衣的海藻酸鹽微球、N-(氨烷基)殼聚糖微球、殼聚糖/海藻酸鈣珠、聚(己二酸酐)微球、結(jié)冷膠珠、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)微球、聚L-賴氨酸海藻酸酯微膠囊、交聯(lián)殼聚糖微球、殼聚糖/明膠微球、有間隔基團的交聯(lián)殼聚糖網(wǎng)絡(luò)珠、1，5-二氧氮雜-2-酮(I, 5-diozepan-2-one, DX0)和D，L-二丙交酯(D，L-LA)微球、甘油三酯脂肪球、海藻酸鈉殼聚糖的聚電解質(zhì)復(fù)合物、多肽微膠囊和白蛋白微球。作為藥物遞送裝置的優(yōu)選包封微粒描述于US2004247670。制備本發(fā)明微粒的方法文獻(xiàn)中描述了很多種制備微粒的方法。本發(fā)明的微粒能用任何現(xiàn)有方法制備。合適技術(shù)包括噴霧干燥、研磨或乳化技術(shù)。經(jīng)研磨產(chǎn)生微粒的合適方法是用丙酮、乙醇和/或水超聲清洗混合有本文所述小熱激蛋白的燒結(jié)磷酸鈣，然后可選地對微粒進(jìn)行干燥和滅菌。制備所述生物可降解微粒的一個優(yōu)選方法由Ghassemi等[J.Control.Releasel38:57-63 (2009)]更詳細(xì)描述。合適方法使用乳劑制備生物可降解微粒，特別是準(zhǔn)備直徑小于100 μ m的微粒。為給出所述工藝的一般示例，可將聚合物溶于合適有機溶劑(聚合物溶劑)，在此聚合物溶液中溶解或分散試劑，將所得聚合物/試劑混合物分散于水相(加工介質(zhì))獲得含有分散于加工介質(zhì)中的油微滴的水包油乳劑，并從微滴中移除溶劑以形成微粒。這些工藝能用油包水乳劑和復(fù)乳劑即水包油包水乳劑進(jìn)行。根據(jù)此基本方法使用基于乳劑的工藝描述于數(shù)個美國專利中。例如，美國專利號4，384，975描述通過形成乳劑并隨后經(jīng)真空蒸餾從乳劑的微滴中移除聚合物溶劑來產(chǎn)生微粒。另一示例美國專利號3，891，570公開了通過供熱或降低制造容器壓力從乳劑的微滴中移除聚合物溶劑的方法。另一示例美國專利號4，389，330中，聚合物溶劑通過真空蒸餾從乳劑的微滴中部分移除(優(yōu)選40-60%聚合物溶劑)，并隨后提取剩余聚合物溶劑以凝固微粒。制備生物可降解微粒的最廣泛使用方法是相分離、噴霧干燥和溶劑蒸發(fā)。
·
也稱為凝聚的相分離通過添加非溶劑來利用降低的聚合物溶解度。在一個典型過程中，生物可降解聚合物溶于有機溶劑(如二氯甲烷)中。親脂性藥物溶于聚合物溶液中。親水性藥物溶于水中，然后分散于聚合物溶液(油包水(w/o)乳劑)或作為固體粉末分散。逐步加入非溶劑(通常為硅油)。形成2相:富集聚合物的硅油相和聚合物耗盡的液體有機溶劑相。當(dāng)有機溶劑被提取或蒸發(fā)，含有包入藥物的聚合物微粒在硅油相中凝固。凝聚物(硅油)吸附于聚合物微粒。噴霧干燥中，生物可降解聚合物溶于揮發(fā)性有機溶劑，如二氯甲烷。藥物溶解或分散于聚合物溶液。在加熱的空氣中噴射溶液或分散液。溶劑蒸發(fā)，引起固體微粒形成。溶劑蒸發(fā)是最常用的微粒制備方法。此方法中，含藥物的有機聚合物溶液在分散介質(zhì)中乳化，所述介質(zhì)通常為水性但可以是油。所述方法能進(jìn)一步分成水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w),和油包油(ο/ο)乳化方法。
在o/w方法中，藥物和聚合物溶于有機溶劑，如二氯甲烷或甲醇/ 二氯甲烷混合物。藥物-聚合物-有機溶劑溶液分散于水相中。水相中包含乳化劑(通常是聚乙烯醇)以幫助在水相中形成小的有機溶劑滴。有機溶劑在攪拌中蒸發(fā)，隨著蒸發(fā)，液滴凝固成含有包入藥物的聚合物微粒。
在w/o/w復(fù)乳化中，制備水性藥物溶液，并分散于聚合物的有機溶劑溶液中，以形成含所述藥物和聚合物的油包水乳劑。w/o聚合物-藥物乳劑隨后在水相中乳化形成w/o/W乳劑。有機溶劑在攪拌下蒸發(fā)，使乳劑中的聚合物-藥物液滴能固化成微粒。
在0/0乳化方法中，藥物和聚合物溶于水混溶性溶劑(如，乙腈)。該溶液在乳化劑(如SPAN80)存在下于油相中乳化形成油包油乳劑。所述有機溶劑通過油提取，且微粒能由過濾收集。
通常，活性劑的水溶液、懸液或固體形式能與含聚合物的有機溶劑混合。使用活性成分的水溶液時，會形成聚合物:活性劑乳劑，并用于制備微粒。使用活性劑的懸液或固體形式時，形成聚合物:活性劑懸液，并用于制備微粒。
產(chǎn)生本發(fā)明微粒的優(yōu)選方法包含以下步驟:將含本文所述小熱激蛋白的溶液加入PLGA或PLHMGA的二氯甲烷(DCM)溶液中，產(chǎn)生水/DCM 二相系統(tǒng)，乳化所述水/DCM 二相系統(tǒng)產(chǎn)生油包水乳劑，加入含聚乙烯醇的溶液產(chǎn)生混合物,乳化所述混合物產(chǎn)生水包油包水乳劑，使DCM從所述水包油包水乳劑中蒸發(fā)，并收集生物可降解微粒。
治療炎性疾病
本發(fā)明的生物可降解微粒極有效活化巨噬細(xì)胞。因此，其提供比簡單供應(yīng)游離可溶蛋白有效許多的策略以選擇性遞送本文所述小熱激蛋白到巨噬細(xì)胞。不希望受理論約束，認(rèn)為這是因為微粒由其靶細(xì)胞 直接吞噬。因此，本發(fā)明的生物可降解微粒適用于人對象的醫(yī)學(xué)治療。本發(fā)明還提供治療患有炎性疾病的人對象的方法，所述方法包括將本發(fā)明所述微粒給予所述人對象。直接遞送微粒一般通過皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射完成，或通過注射遞送至組織間隙完成。微粒還能給予神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。其它給予模式包括局部、口月艮、栓劑、透皮施用、針、顆粒槍或無針注射器。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。本發(fā)明的生物可降解微?？稍诿咳铡⒚恐芑蛎吭禄A(chǔ)上給予。
所述生物可降解微粒優(yōu)選用于針對炎性疾病的醫(yī)學(xué)治療。所述炎性疾病優(yōu)選是皮膚、粘膜、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、胰腺或關(guān)節(jié)的急性或慢性炎癥性病癥，優(yōu)選皮炎、牛皮癬、濕疹、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、牙周炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、慢性阻塞性肺疾病、氣腫、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視神經(jīng)炎、腦炎、炎性周圍神經(jīng)病、動脈粥樣硬化、血管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿病。
藥物纟目合物
本發(fā)明還提供含有效量微粒的藥物組合物。為了本發(fā)明目的，有效劑量為給予個體中約100ng/kg-50mg/kg組合物?；蛘?就局部應(yīng)用預(yù)期有效劑量在lOng/mL-lOmg/mL范圍內(nèi)。
所述藥物組合物還能包含藥學(xué)上可接受載體。藥學(xué)上可接受載體為本領(lǐng)域已知，包括例如用于無菌注射組合物的等滲水溶液以及水性和非水性無菌懸液，所述等滲水溶液能包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)受體血液等滲的溶質(zhì)，所述水性和非水性無菌懸液能包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或微球等其它試劑以輔助生物可降解微粒分布和/或遞送到靶位點和/或靶細(xì)胞。這種載體為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
所述藥物組合物優(yōu)選不含大量的非本發(fā)明所述微粒。例如，若藥物組合物包含過多的過大微粒，其不是很有效。因此，藥物組合物中存在的至少百分之50、60、70、80、90的微粒是本發(fā)明所述生物可降解微粒。
在一個優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明所述生物可降解微粒配制成能制成劑型的藥物組合物，特別是口服固體劑型如膠囊和壓縮片劑，其如本領(lǐng)域所熟知。
壓縮片劑從含生物可降解微粒的藥物組合物中配制，或使用承載所述微粒的藥物載體顆粒、藥物學(xué)惰性(藥學(xué)上可接受)添加劑或賦形劑配制。
為制備片劑，通常需要在藥物組合物中包括一種或多種溫和藥物賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種稀釋劑，其加入使片劑更大并因而使患者和護理者更易處理。普通稀釋劑是微晶纖維素(如AviceW):、微粉纖維素、乳糖、淀粉、預(yù)膠化淀粉、碳酸鈣、硫酸鈣、糖、葡萄糖結(jié)合劑、糊精、右旋糖、二水合磷酸氫鈣、磷酸三鈣、高嶺土、碳酸鎂、氧化鎂、麥芽糖糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(如Eudragit )、氯化鉀、粉狀纖維素、氯化鈉、山梨醇和滑石。
粘合劑也可納入片劑制劑以幫助壓縮后保持片劑結(jié)合在一起。一些典型的粘合劑是阿拉伯膠、藻酸、卡波姆(如卡波普)、羧甲基纖維素鈉、糊精、乙基纖維素、明膠、瓜爾豆膠、氫化植物油、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素(如Kucel )、羥丙基甲基纖維素(如Methocel )、液狀葡萄糖、鎂鋁硅酸鹽、麥芽糖糊精、甲基纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚維酮(如Kollidon 、P'lasdone )、預(yù)膠化淀粉、海藻酸鈉和淀粉。
所述片劑還可包括崩解劑以加速片劑在患者胃中的崩解。崩解劑包括藻酸、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、膠態(tài)二氧化硅、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(如Ac-D1-Sol 、Primellose )、交聚維酮(如 Kollidon 、Po丨yplasdone :)、瓜爾豆膠、鎂鋁硅酸鹽、甲基纖維素、微晶纖維素、波拉克林鉀(polacrilin)、粉狀纖維素、預(yù)膠化淀粉、海藻酸鈉、羧乙酸淀粉鈉(如Explotab )和淀粉。
制備壓縮片劑的藥物組合物還可包括助流劑、潤滑劑、調(diào)味劑、著色劑和其它常用賦形劑。
本發(fā)明的液體口服藥物組合物包含本發(fā)明的生物可降解微粒和液體載體如水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油，最優(yōu)選水。
液體口服藥物組合物可包含乳化劑以在整個組合物中均勻分散活性成分、藥物遞送載劑、或在液體載體中溶解度低的賦形劑。可用于本發(fā)明液體組合物的乳化劑包括例如明膠、蛋黃、酪蛋白、膽固醇、阿拉伯膠、黃芪膠、角叉菜、果膠、甲基纖維素、卡波姆、十八醇十六醇混合物和十六醇。
本發(fā)明的液體口服藥物組合物還可包含粘性增強劑以改善產(chǎn)物的口感和/或包被胃腸道壁。這種試劑包括阿拉伯膠、藻酸皂土、卡波姆、羧甲基纖維素鈣或鈉、十八醇十六醇混合物、甲基纖維素、乙基纖維素、明膠瓜爾豆膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糖糊精、聚乙烯醇、聚維酮、碳酸丙烯酯、藻酸丙二醇酯、海藻酸鈉、羧乙酸淀粉鈉、淀粉西黃蓍膠膠和黃原膠。所述液體口服藥物組合物還可包含:甜味劑，如山梨醇、糖精、糖精鈉、蔗糖、阿司帕坦、果糖、甘露醇和轉(zhuǎn)化糖；防腐劑和螯合劑，如醇、苯甲酸鈉、丁基化羥基甲苯、丁基化羥基茴香醚和乙二胺四乙酸；以及緩沖液，如葡糖酸、乳酸、檸檬酸或乙酸、葡萄糖酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉或乙酸鈉。在其它優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是適于局部應(yīng)用的組合物。局部應(yīng)用活性蛋白質(zhì)化合物的合適藥物組合物為本領(lǐng)域熟知。合適的局部藥物組合物可包括一種或多種干燥劑(優(yōu)選氧化鋅)、溶劑(優(yōu)選一羥基鏈烷醇)、濕潤劑(優(yōu)選甘油)和/或粘度產(chǎn)生劑(優(yōu)選膨潤土)，與水混合形成洗液或乳膏。本發(fā)明現(xiàn)在通過下列非限制性實施例來說明。
實施例
_5] 實施例1.人血清存在下微球包封CRYAB對免疫調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)的激活方法合成親水性聚酯:有L-丙交酯的3S-(芐氧基甲基)-6S-甲基-1，4_ 二氧六環(huán)-2，5- 二酮(BHMG)與和D，L-丙交酯的共聚物35-(芐氧基甲基)-65-甲基-1，4-二氧六環(huán)-2，5-二酮(BHMG)根據(jù)Leemhuis等 [Macromolecules39:3500-3508 (2006)]合成。BMMG 與 D, L-丙交酯的共聚物(單體比例35/65 和 50/50%mol/mol)通過 Ghassemi 等.[J.Control.Releasel38:57 - 63 (2009)]所述的熔融共聚來合成。共聚后，移除保護芐基，乳酸-羥甲基乙醇酸共聚物(PLHMGA)的組成由1H-NMR確立。所述共聚物的合適玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由差示掃描量熱法確認(rèn)，其期望分子量由大小排阻色譜確認(rèn)。所述共聚物(芐基保護和去保護)的1H-NMR分析證實所述共聚物組成與單體進(jìn)料比率匹配，且完全去保護。所述共聚物的產(chǎn)率通常為90-100%。加載CRYAB的PLHMGA & PLGA微粒的制備和鑒定PLHMGA聚合物的CRYAB加載微球(圖1)或更廣泛使用的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)通過復(fù)乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備，如Wang等.[Journal of ControlledRelease82:289 - 3073(2002)]所述。簡言之，將300 μ I溶于磷酸鹽緩沖鹽水的12.5mg/ml CRYAB溶液逐滴加入3ml的10% (w/v) PLHMGA溶液或PLGA溶液(溶于二氯甲烷(DCM))。水/DCM 二相系統(tǒng)用IKA均質(zhì)器(德國施陶芬的IKA Werke實驗室儀器公司(IKA WerkeLabortechnik, Staufen))以35，OOOrpm乳化I分鐘。然后，將所得油包水(w/o)乳劑加入30ml含150mM NaCl的5% (w/v)聚乙烯醇(PVA) (pH7.4)，所述混合物用IKA均質(zhì)器以35，OOOrpm乳化2分鐘。將所得水包油包水(w/o/w)乳劑轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，在真空下室溫蒸發(fā)DCM。然后，通過在25，OOOg離心20分鐘收集微球，用50ml水洗滌3次，過夜凍干并4° C干燥保存直到用于實驗。通過動態(tài)光散射和粒度分析儀(accusizer)分析鑒定顆粒大小，并通過掃描電子顯微術(shù)檢測形態(tài)。結(jié)果表明PLGA微球在球形顆粒形成中的大小分布為0.5-3.5 μ m，而PLHMGA顆粒具有0.2-2 μ m范圍的較窄粒度分布。由此獲得的微粒掃描電子顯微照片示于圖2。實施例2.用游離CRYAB或微球包封CRYAB激活人巨噬細(xì)朐。人外周血單個核細(xì)胞從獲自健康供體的全血中分離。CD14+單核細(xì)胞用包被有抗CD14抗體的磁珠通過陽性選擇而分離。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下，將如此純化的單核細(xì)胞在含10%人血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，以誘導(dǎo)其分化成巨噬細(xì)胞。7天后，在細(xì)胞充分分化時，移出一半的培養(yǎng)基，用等體積新鮮培養(yǎng)基替代，所述新鮮培養(yǎng)基含有10%人血清且包含不同濃度的多種刺激物。刺激物包括游離可溶人重組CRYAB、加載CRYAB的PLHMGA或PLGA微球制品(在相同培養(yǎng)基中制備)。將不含蛋白質(zhì)的空微球用作對照。培養(yǎng)18-20小時后，當(dāng)巨噬細(xì)胞明顯吞噬大部分微粒時，將培養(yǎng)板在4° C以1，250g離心20分鐘。最后，單獨收集所有培養(yǎng)基上清以用市售ELISA試劑盒定量IL-10。
實施例3.含CRYAB的微球而不是宇微球誘導(dǎo)人巨噬細(xì)朐產(chǎn)牛IL-10 (參見圖6)。
人外周血單個核細(xì)胞從獲自健康供體的全血中分離。CD14+單核細(xì)胞用包被有抗CD14抗體的磁珠通過陽性選擇而分離。將如此純化的單核細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)存在下培養(yǎng)7天以誘導(dǎo)其分化成巨噬細(xì)胞。7天后，在細(xì)胞充分分化時，移出一半的培養(yǎng)基，用等體積新鮮培養(yǎng)基取代，所述新鮮培養(yǎng)基包含不同濃度的多個刺激物。刺激物包括不同濃度的CRYAB加載PLGA微球，或具有相同尺寸的CRYAB加載與空PLGA微球的混合物，濃度示于圖6。培養(yǎng)18-20小時后，如上所述單獨檢測培養(yǎng)基上清的IL-10。
實施例4.微球包封CRYAB而不是游離可溶CRYAB抑制人外周血.T細(xì)胞的抗原特異增殖應(yīng)答(參見圖8)。
人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)從獲自健康供體的全血沉棕黃層分離。如此純化的PBMC首先用熒光染料羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記。此染料穩(wěn)定標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，常用于T細(xì)胞增殖實驗，因為所述增殖能通過增殖期間細(xì)胞分裂引起的胞內(nèi)熒光標(biāo)記逐步稀釋來顯現(xiàn)和定量。經(jīng)CFSE標(biāo)記的PBMC在200 μ g/mL人重組CRYAB或0.2 μ g/mL破傷風(fēng)類毒素存在下培養(yǎng)9天，CRYAB和破傷風(fēng)類毒素是大部分人已建立對其的記憶T細(xì)胞應(yīng)答的2種測試抗原。在培養(yǎng)當(dāng)日，向有或沒有測試抗原的PBMC額外提供增加濃度的游離CRYAB (多至30 μ g/mL)或PLGA-微球包封CRYAB (多至30 μ g/mL總微球質(zhì)量)(其1%是CRYAB蛋白)。培養(yǎng)9天后，收集PBMC并用熒光標(biāo)記抗體染色表面標(biāo)記物CD4 (輔助T細(xì)胞標(biāo)記物)和⑶45R0(記憶T細(xì)胞標(biāo)記物)，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。經(jīng)熒光標(biāo)記的標(biāo)記物CD4或CD45R0的強度能使流式細(xì)胞術(shù)分析集中于PBMC群內(nèi)的記憶T細(xì)胞或輔助T細(xì)胞，而熒光CFSE標(biāo)記物強度能鑒定和定量培養(yǎng)中增殖的所述T細(xì)胞部分，因為這些細(xì)胞的特征為稀釋并因而變暗的CFSE信號。圖8顯示平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。統(tǒng)計學(xué)顯著性用ANOVA檢驗計算。
實施例5.含CRYAB的微球而不是即使劑暈高許多的游離可溶CRYAB抑制香煙煙氣誘發(fā)的肺部炎癥(參見圖9)。
在5天時間段內(nèi)，將小鼠(組n=6或n=7)l天2次暴露于香煙煙氣中30分鐘。作為處理，在異氟烷淺麻醉下I天2次氣管內(nèi)給予:溶于PBS的游離可溶CRYAB、重懸于PBS的含CRYAB的PLGA微球、或單獨PBS。在第6天，處死動物并從所有動物收集支氣管肺泡灌洗液，單獨檢測巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)目。所有實驗由合格人員進(jìn)行，有動物實驗倫理委員會的事先書面批準(zhǔn)，依照所有當(dāng)?shù)匾?guī)定和法律規(guī)制。圖9A和B顯示平均值土均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。統(tǒng)計學(xué)顯著性用未配對斯氏t檢驗計算。
序列表
〈110〉德爾塔克利斯塔隆有限 公司(Delta Crystallon B.V.)
權(quán)利要求
1.一種生物可降解微粒，所述生物可降解微粒的直徑為0.2-3.5微米，且含藥學(xué)有效量的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-1O產(chǎn)生的至少一種小熱激蛋白，所述小熱激蛋白包含與SEQ IDNO:1和12-26所列任何序列具有至少50%相同性的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述至少一種小熱激蛋白是具有選自SEQ ID NO:2-11的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，優(yōu)選SEQ IDNO:2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述生物可降解微粒是生物可相容的。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述微粒包含乳酸和/或乙醇酸的(共)聚合物，優(yōu)選選自:己內(nèi)酯、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)或乳酸-羥甲基乙醇酸共聚物(PLHMGA)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述生物可降解微粒具有1-2微米的最大直徑。
6.如權(quán)利要求1-5中 任一項所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述生物可降解微粒用于對象的醫(yī)學(xué)治療。
7.如權(quán)利要求6所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述醫(yī)學(xué)治療針對炎性疾病。
8.如權(quán)利要求7所述的生物可降解微粒，其特征在于，所述炎性疾病是皮膚、粘膜、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、胰腺或關(guān)節(jié)的急性或慢性炎癥性病癥，優(yōu)選皮炎、牛皮癬、濕疹、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、牙周炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、慢性阻塞性肺疾病、氣腫、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視神經(jīng)炎、腦炎、炎性周圍神經(jīng)病、動脈粥樣硬化、血管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿病。
9.包含有效劑量的權(quán)利要求1-8中任一項所述微粒的藥物組合物。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中存在的微粒的至少百分之50、60、70、80或90是權(quán)利要求1_8中任一項所述的生物可降解微粒。
11.產(chǎn)生權(quán)利要求1-8中任一項所述生物可降解微粒的方法，所述方法包含步驟: a.混合含權(quán)利要求1和2中任一項所定義的小熱激蛋白的水溶液與溶于揮發(fā)性有機溶劑的己內(nèi)酯、PLA、PLGA或PLHMGA溶液，以提供水/揮發(fā)性有機溶劑二相系統(tǒng)； b.乳化所述水/揮發(fā)性有機溶劑二相系統(tǒng)以提供油包水乳液； c.向含聚乙烯醇的水溶液中加入獲自步驟b的所述油包水乳液，并乳化所得混合物以提供水包油包水乳液； d.使揮發(fā)性有機溶劑從所述水包油包水乳液中蒸發(fā)，并在所述蒸發(fā)中形成生物可降解微粒。
12.—種治療患有炎性疾病對象的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的權(quán)利要求1-8中任一項所述的生物可降解微?；驒?quán)利要求9或10所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物可降解微粒，所述生物可降解微粒直徑為0.2-3.5微米且含藥學(xué)有效量的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-10生成的至少一種小熱激蛋白，所述小熱激蛋白包含與SEQ ID NO:1和12-26中所列任何序列有至少50%相同性的氨基酸序列。
文檔編號A61K9/16GK103189051SQ201180044686
公開日2013年7月3日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者J·M·范諾爾特 申請人:德爾塔克利斯塔隆有限公司