專利名稱：一種海洋源復合膠原敷料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其是涉及一種海洋源復合膠原敷料的制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚是抵御外界細菌入侵、維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防止水分蒸發(fā)的天然屏障，但在日常生活和工作中，意外皮膚創(chuàng)傷時有發(fā)生，而傳統(tǒng)的敷料如紗布、藥棉等植物纖維布止血 速度慢，而且僅僅是起到隔絕的作用，其本身并沒有抗菌、抑菌性，必須配合藥物來進行止血或者消毒，而且這些敷料不能防水，天氣或者環(huán)境因素會使傷口續(xù)發(fā)感染。膠原蛋白是一種天然的止血劑，具有良好的生物學特性和功能，能促進新細胞形成和促進上皮細胞、成纖維細胞生長，同時能誘導血小板附著，促進血小板聚焦，激活凝血因子的活動，且與人體組織與細胞具有良好的生物相容性，膠原敷料則能使傷口清潔，減緩細菌感染現(xiàn)象，減少傷口流膿，增加肉芽組織的形成，使得愈合的傷口不會產(chǎn)生收縮，而且膠原敷料降解后可形成細胞生長所需要的氨基酸，為創(chuàng)面修復提供營養(yǎng)物質(zhì)，加速傷口愈合，另外，海綿型的膠原敷料的多孔結(jié)構(gòu)可誘導修復細胞在敷料中浸潤和繁殖，并長時間用于創(chuàng)面覆蓋。中國專利公開號CN1569244A，
公開日2005年I月26日，公開了一種以生物膠原為原料生產(chǎn)的生物膠原止血綿及其生產(chǎn)工藝，其生產(chǎn)步驟如下1)將生物膠原磨成200 800目的生物膠原干粉待用；2)將生物膠原干粉與生物吸收性止血綿以0. 5 I. 5 9的重量比攪拌混合，然后灌裝入模具中沖壓；3)將沖壓成型后的生物膠原止血綿置于120 170攝氏度下烘干，得成品。但是，單純用膠原蛋白制成的敷料機械性能較差，止血效果不理想，且黏附性較差，易脫落。硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖，由于分子中帶有大量的負電荷，因此具有調(diào)脂、抗炎、加速傷口愈合等作用，還能促進基質(zhì)中纖維的增長，增強通透性，改善血液循環(huán)，加速新陳代謝，促進滲透液的吸收及炎癥的消除，與膠原蛋白結(jié)合，可形成交聯(lián)作用和靜電作用，在羥基、胺基之間相互交聯(lián)，提高膠原海綿敷料的韌性。但是，膠原蛋白和硫酸軟骨素主要來源于陸生屠宰動物中的結(jié)締組織與軟骨，但是由于近年來瘋牛病、口蹄疫等疾病的出現(xiàn)與蔓延，使得陸生動物來源的膠原蛋白和硫酸軟骨素在應用方面受到了極大限制，中國是個海洋漁業(yè)大國，魚類資源豐富，海洋魚類的表皮及軟骨中含有豐富的膠原蛋白與硫酸軟骨素，具有很大的開發(fā)潛力和利用價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了杜絕在陸生動物中提取膠原蛋白與硫酸軟骨素所不可避免的病毒隱患，以及克服單純用膠原蛋白制成的敷料機械性能較差，止血效果不理想，且黏附性較差，易脫落的不足，提供了一種從海洋魚類中提取的膠原蛋白與硫酸軟骨素來制備復合膠原敷料的方法，本發(fā)明不僅可以提高海洋魚類的綜合利用率，而且通過本發(fā)明制備的復合膠原敷料成本較低，安全性好，韌性高，黏附性強，能促進傷口的愈合，可廣泛用于皮膚創(chuàng)傷面的治療。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明的一種海洋源復合膠原敷料的制備方法，包括以下步驟
一.利用酶法從海洋魚類表皮中提取膠原蛋白。由于膠原蛋白主要來源于陸生屠宰動物中的結(jié)締組織，陸生動物來源的膠原蛋白存在一定的生物安全隱患，而從海洋魚類中提取的膠原蛋白可避免這個安全隱患，同時，我國是個漁業(yè)大國，海洋魚類加工中產(chǎn)生的廢棄 魚皮用來提取膠原蛋白，減少對環(huán)境的污染的同時又提高了海洋魚類的利用率?；瘜W法水解以酸或堿斷開蛋白質(zhì)肽鍵，由于反應環(huán)境較極端，不利于活性的保持，而酶法相對于化學法水解，安全性更高，在溫和條件下進行定位水解，水解過程也比較容易控制。所述的海洋魚類表皮包括魷魚皮、鱈魚皮等各種海洋魚類的表皮。二.從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素。硫酸軟骨素主要來源于陸生屠宰動物中的軟骨，同樣存在生物安全隱患，而從海洋魚類魚骨中提取的硫酸軟骨素可避免這個安全隱患，從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素，減少對環(huán)境的污染的同時也能提高海洋魚類的利用率。所述的海洋魚類魚骨可為安康魚、鰻魚、鯊魚等各種海洋魚類的魚骨。三.將步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與絮凝劑、生長因子、抗炎消毒劑、交聯(lián)劑同時溶于濃度為0. 05-0. 2 mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為2. 0 3. 0%，硫酸軟骨素為I. 0 I. 5%，絮凝劑為0. 03 0. 05%，生長因子為0. 001 0. 005%，抗炎消毒劑為0. I 0. 4%，交聯(lián)劑為0. 3 0. 8% ;將所得混合液注入模具中，在0 4°c下靜置12 18 h后預冷5 8h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中真空冷凍干燥24 36h后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌30 60 min后得到復合膠原敷料成品。膠原蛋白是一種天然的止血劑，具有良好的生物學特性和功能，能促進新細胞形成和促進上皮細胞、成纖維細胞生長，同時能誘導血小板附著，促進血小板聚焦，激活凝血因子的活動，且與人體組織與細胞具有良好的生物相容性，膠原敷料則能使傷口清潔，減緩細菌感染現(xiàn)象，減少傷口流膿，增加肉芽組織的形成，使得愈合的傷口不會產(chǎn)生收縮，而且膠原敷料降解后可形成細胞生長所需要的氨基酸，為創(chuàng)面修復提供營養(yǎng)物質(zhì)，以促進傷口的愈合。硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖，由于分子中帶有大量的負電荷，因此具有調(diào)脂、抗炎、加速傷口愈合等作用，還能促進基質(zhì)中纖維的增長，增強通透性，改善血液循環(huán)，加速新陳代謝，促進滲透液的吸收及炎癥的消除。絮凝劑可以使溶液中的膠原蛋白更容易形成絮體，使制備后的復合膠原敷料呈多孔結(jié)構(gòu)的海綿狀，海綿狀的復合膠原敷料的多孔結(jié)構(gòu)提高復合膠原敷料的機械強度的同時還提高了與皮膚黏附性，使其可以長時間覆蓋在創(chuàng)面上，還可以誘導修復細胞在敷料中浸潤和繁殖，生長因子為具有刺激細胞生長活性的細胞因子，可以促進創(chuàng)傷面皮膚組織的再生修復，從而增強傷口的愈合能力，而抗炎消毒劑可以在膠原復合敷料黏附在創(chuàng)傷面上時，可以緩慢釋放，增強局部的抗菌能力，避免創(chuàng)傷面的感染，交聯(lián)劑可以使溶液中的其他成分與膠原蛋白交聯(lián)在一起形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以此提高復合膠原敷料的力學強度。所述的模具可以根據(jù)臨床使用的需要制成不同的形狀，冷凍干燥是利用升華原理，將待干燥物料快速凍結(jié)后，再在高真空條件下將其中的冰升華為水蒸氣而去除的干燥方法。在真空冷凍干燥過程中，由于冰的升華帶走熱量使凍干整個過程始終保持低溫凍結(jié)狀態(tài)，組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)被較好地保存，干燥后的膠原蛋白能保持原來的物理與化學性質(zhì)，物理結(jié)構(gòu)變化極小，因而可以最大限度地保持膠原蛋白的活性，而且物料不存在表面硬化問題，干燥的膠原蛋白呈多孔狀，能長時間穩(wěn)定貯存，并易重新復水而恢復活性。放射性同位素60Co衰變時可放射出Y射線，Y射線的穿透力很強，操作簡便，速度快，經(jīng)60Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5°C，輻射劑量適當，不會破壞生長因子及抗炎消毒劑的有效成分，亦不會對人產(chǎn)生傷害，且有滅菌后較長時間控制細菌的再增殖等優(yōu)點。作為優(yōu)選，步驟三中所述的絮凝劑為硫酸肝素，所述的生長因子為成纖維生長因子、人表皮生長因子、血小板生成素或血管生成素中的一種或幾種，所述的抗炎消毒劑為苯 扎溴銨或苯扎氯銨，所述的交聯(lián)劑為戊二醛。硫酸肝素可以與膠原蛋白交聯(lián)，改變支架材料空間結(jié)構(gòu)，使其成交聯(lián)成多孔結(jié)構(gòu)的海綿狀，海綿狀的膠原敷料的多孔結(jié)構(gòu)提高復合膠原敷料的機械強度的同時還提高了與皮膚黏附性，使其可以長時間覆蓋在創(chuàng)面上，海綿狀的膠原敷料的多孔結(jié)構(gòu)還可誘導修復細胞在敷料中浸潤和繁殖，更有利于組織修復和傷口愈合。生長因子為成纖維生長因子、人表皮生長因子、血小板生成素或血管生成素中一種或幾種，均可以促進皮膚組織再生，從而加快創(chuàng)傷面的愈合速度，所述的抗炎消毒劑為苯扎溴銨或苯扎氯銨，苯扎溴銨或苯扎氯銨具有毒性小，無積累性毒性，無刺激性，不損壞物品，且性質(zhì)穩(wěn)定，耐光，耐熱，無揮發(fā)性，可長期存放，使用方便、成本低等優(yōu)點，并易溶于水，能與蛋白質(zhì)迅速結(jié)合，能改變細菌胞漿膜通透性，使菌體物質(zhì)外滲，阻礙其代謝而起殺菌作用。所述的交聯(lián)劑為戊二醛，戊二醛滲透快，交聯(lián)能力強，對蛋白質(zhì)的固定效果好。作為優(yōu)選，步驟三中所述的預冷溫度為-30 _50°C。在預冷階段，需要嚴格控制預冷溫度，如果預冷溫度不夠低，則藥品可能沒有完全凍結(jié)，在抽真空升華時會膨脹起泡，引起物理結(jié)構(gòu)的變化；若預冷溫度太低，又會增加不必要的能量消耗。-30 -50°C為一個優(yōu)選的預冷溫度范圍。作為優(yōu)選，步驟三中所述的冷凍干燥的降溫范圍為_25°C -60°C，降溫速度為3 4°C /min。冷凍干燥的降溫速率可影響復合膠原敷料內(nèi)部孔徑的大小，降溫速度過快，會使孔徑過小，不僅會使下層膠原蛋白的干燥程度，還會導致膠原復合敷料的通透性較差，而降溫速率過大，又會使孔徑過大，導致膠原復合敷料的力學性能較差，合適的降溫速率，能使形成的膠原復合敷料中的內(nèi)部孔徑結(jié)構(gòu)均勻，比表面積大。作為優(yōu)選，步驟一中所述的利用酶法從海洋魚類表皮中提取膠原蛋白包括以下步驟
(I)將海洋魚類表皮洗凈后搗碎待用。搗碎能使海洋魚類表皮在溶液中能夠能均勻分散。(2)在步驟(I)得到的海洋魚類表皮中加入NaOH溶液浸泡24_30h，每隔5 6 h更換NaOH溶液I次，最后用蒸餾水洗至pH為中性。加入NaOH溶液用以去除雜蛋白。(3)加入正丁醇溶液攪拌16_24h后用蒸餾水洗至pH為中性。丁醇溶液用于脫脂，正丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強，正丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活，另外，丁醇提取法的PH及溫度選擇范圍較廣。(4)按每克海洋魚類表皮以10 15ml的加入量加入蒸餾水，再調(diào)節(jié)pH至6. 5
7.5后按每克海洋魚類表皮以0. 01 0. 02g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45 60°C下保溫并攪拌3 5h，再調(diào)節(jié)酶解溶液pH至7. 5 9. O后按每克海洋魚類表皮以0. OI 0. 02g的加入量加入胰蛋白酶，在45 60°C下保溫并攪拌3 5h，最后加熱至90 100°C滅酶5 IOmin0胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果相對較好，膠原蛋白提取率較高，用木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶先后酶解海洋魚類表皮，可使海洋魚類表皮充分水解，以提高膠原蛋白的提取率。pH為6. 5 7. 5，溫度為45 60°C是木瓜蛋白酶進行酶解的優(yōu)選條件范圍，pH為
7.5 9. 0，溫度為45 60°C是胰蛋白酶進行酶解的優(yōu)選條件范圍，膠原蛋白的提取率在一定范圍內(nèi)會隨著酶與海洋魚類表皮的重量比的增加而提高，但到一定程度后，魚皮中膠原 蛋白得率降低，因此需要一個酶的最佳加入量范圍，每克海洋魚類表皮加0. 01 0. 02g木瓜蛋白酶與0. 01 0. 02g胰蛋白酶為本發(fā)明的一個優(yōu)選范圍，可以得到較高的提取率。(5)將得到的酶解液在0 4°C離心，收取上層清夜進行鹽析沉淀。0 4°C時，膠原蛋白的性質(zhì)最為穩(wěn)定。鹽析沉淀即為普通的蛋白分離方法，加入固體氯化鈉、氯化鉀等中性鹽使膠原蛋白完全沉淀下來即可，鹽析沉淀可使各種膠原蛋白分段沉淀，不僅操作簡單，且成本也較低。(6)將沉淀物以0. 5 0. 7mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋，用0. I 0. 2 mol/L醋酸溶液作為透析外液透析24 36 h,每4 5h更換透析外液,再用蒸懼水作為透析外液透析24 36 h，每4 5h更換透析外液，最后將透析液冷凍干燥后即得膠原蛋白。透析以去除膠原蛋白中的雜離子，提高膠原蛋白的純度，冷凍干燥既能防止膠原蛋白變質(zhì)，又能保持膠原蛋白的天然結(jié)構(gòu)和特性。作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的NaOH溶液濃度為0. I 0. 5mol/L，并按每克海洋魚類表皮以10 15ml的加入量加入。NaOH溶液的濃度過高會使蛋白發(fā)生變性，因此需要控制NaOH溶液的加入量及濃度。NaOH溶液濃度為0. I 0. 5mol/L,每克海洋魚類表皮加入10 15ml所述的NaOH溶液為本發(fā)明的一個優(yōu)選范圍。作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的正丁醇溶液中正丁醇的體積百分數(shù)為10 15%，并按每克海洋魚類表皮以15 20ml的加入量加入。正丁醇溶液濃度過高也會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。正丁醇溶液中正丁醇的體積百分數(shù)為10 15%，每克海洋魚類表皮加15 20ml所述的正丁醇溶液體為本發(fā)明的一個優(yōu)選范圍。作為優(yōu)選，根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，步驟一中所述的從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素包括以下步驟
a.將海洋魚類魚骨上的殘肉剔凈后在40 50°C熱水中清洗干凈。熱水沖洗使殘肉與軟骨完全分離。b.處理后的海洋魚類魚骨中加入NaOH溶液與NaCl溶液，再將海洋魚類魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50 60°C下攪拌浸提6 8h后用150 200目濾布過濾。先用堿液對軟骨進行堿提，使硫酸軟骨素初步溶于堿液中，加入NaCl以增加硫酸軟骨素的溶解度，同時穩(wěn)定硫酸軟骨素的活性，再通過濾布過濾對硫酸軟骨素進行粗分離。c.將步驟b得到的濾渣按照步驟b再提取一次，合并步驟b與步驟c所得的兩次濾液。再提取一次以充分提取硫酸軟骨素。d.將步驟c所得酶解液pH調(diào)至6. 5 7. 5，按每克海洋魚類魚骨以0.005 0.0Ig的加入量加入木瓜蛋白酶，在45 55°C下保溫攪拌2 3 h后加熱至90 100°C滅酶5 IOmin0加入木瓜蛋白酶進行酶解在除去溶液中蛋白質(zhì)。
e.在步驟d的酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為60 65%，在0 4°C靜置18 24 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。先用乙醇進行醇沉，使硫酸軟骨素沉淀，再用乙醇對沉淀下來的硫酸軟骨素進行脫水，脫水后進行冷凍干燥便得到硫酸軟骨素。作為優(yōu)選，步驟a中所述的NaOH溶液濃度為0.5 1.0 mol/L，并按每克海洋魚類魚骨以10 20ml的加入量加入，所述的NaCl溶液中NaCl的質(zhì)量百分數(shù)為10 15%，并按每克海洋魚類魚骨以200 300ml的加入量加入。本發(fā)明先通過從海洋魚類的表皮與軟骨中分別提取的膠原蛋白與硫酸軟骨素，再用提取的膠原蛋白與硫酸軟骨素來制備復合膠原敷料，不僅成本較低，還提高了海洋魚類 的綜合利用率，最重要的一點制備所得的復合膠原敷料生物安全性好，可避免病毒隱患，而且通過本發(fā)明制備得到的復合膠原敷料的韌性高，黏附性強，能促進傷口的愈合，可廣泛用于皮膚創(chuàng)傷面的治療。
具體實施例方式下面以具體實施方式
對本發(fā)明做進一步的描述。實施例I
一.取I. 2kg鱈魚皮洗凈后搗碎待用；搗碎后的鱈魚皮中按每克鱈魚皮以IOml的加入量加入12L濃度為0. lmol/L的NaOH溶液，浸泡30h，每隔6 h更換I次NaOH溶液，最后用蒸餾水洗至PH為中性；按每克鱈魚皮以20ml的加入量加入24L體積百分數(shù)為10%的正丁醇溶液，攪拌20h后用蒸餾水洗至pH為中性；按每克鱈魚皮以IOml的加入量加入12L蒸餾水，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6. 5后按每克鱈魚皮以0. Olg的加入量加入12g木瓜蛋白酶，在60°C下保溫并攪拌5h，再用氨水調(diào)節(jié)酶解溶液pH至8. 5后按每克鱈魚皮以0. Olg的加入量加入12g胰蛋白酶，在60°C下保溫并攪拌3h，最后加熱至100°C滅酶IOmin ;將得到的酶解液在0°C離心，收取上層清夜，加入氯化鈉固體直至清液中無沉淀物析出；將沉淀物以0. 5mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋,用0. I mol/L醋酸溶液作為透析外液透析24 h,每5h更換透析外液,再用蒸懼水作為透析外液透析28 h,每4h更換透析外液,最后將透析液冷凍干燥后得到膠原蛋白。二 .取I. 2kg鰻魚魚骨，將鰻魚魚骨上的殘肉剔凈后在40°C熱水中清洗干凈；在處理后的鰻魚魚骨中按每克鰻魚魚骨以IOml的加入量及每克鰻魚魚骨以200ml的加入量分別加入12L濃度為0. 6 mol/L的NaOH溶液與240L質(zhì)量百分數(shù)為10%的NaCl溶液，再將鰻魚魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50°C下攪拌浸提8h后用200目濾布過濾；將濾布上的濾渣按照上步驟提取一次，合并所得的兩次濾液；將濾液用醋酸將PH調(diào)至7. 5，按每克鰻魚魚骨以0. 005g的加入量加入6g木瓜蛋白酶，在45°C下保溫攪拌2 h后加熱至90°C滅酶IOmin ;在酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為65%，在(TC靜置24 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。三.用步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與硫酸肝素、成纖維生長因子、苯扎溴銨、戊二醛同時溶于濃度為0. 05mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為2. 5%,硫酸軟骨素為1%,硫酸肝素為0. 03%,成纖維生長因子為0. 001%,苯扎溴銨為0. 3%，戊二醛為0. 3% ;將所得混合液注入模具中，在0°C下靜置18 h，在-30°c預冷5h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中，冷凍干燥的在降溫范圍-25°C _60°C，降溫速度為3°C /min,真空冷凍干燥24h后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌30 min后得到復合膠原敷料成品。實施例2
一.取Ikg安康魚皮洗凈后搗碎待用；搗碎后的安康魚皮中按每克安康魚皮以12ml的加入量加入12L濃度為0. 5mol/L的NaOH溶液，浸泡26h，每隔5. 5h更換I次NaOH溶液，最后用蒸餾水洗至PH為中性；按每克安康魚皮以15ml的加入量加入15L體積百分數(shù)為15% 的正丁醇溶液，攪拌18h后用蒸餾水洗至pH為中性；按每克安康魚皮以12ml的加入量加入12L蒸餾水，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 5后按每克安康魚皮以0. 015g的加入量加入15g木瓜蛋白酶，在45°C下保溫并攪拌4h，再用氨水調(diào)節(jié)酶解溶液pH至8后按每克安康魚皮以0. 012g克的加入量加入12g胰蛋白酶，在45°C下保溫并攪拌5h，最后加熱至100°C滅酶5min ;將得到的酶解液在2°C離心，收取上層清夜，加入氯化鈉固體直至清液中無沉淀物析出；將沉淀物以0. 7mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋，用0. 2 mol/L醋酸溶液作為透析外液透析36h,每4h更換透析外液,再用蒸懼水作為透析外液透析26 h,每4. 5h更換透析外液,最后將透析液冷凍干燥后得到膠原蛋白。二 .取Ikg安康魚魚骨，將安康魚魚骨上的殘肉剔凈后在50°C熱水中清洗干凈；在處理后的安康魚魚骨中按每克安康魚魚骨以20ml的加入量及每克安康魚魚骨以300ml的加入量分別加入20L濃度為0. 5 mol/L的NaOH溶液與300L質(zhì)量百分數(shù)為15%的NaCl溶液，再將安康魚魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在60°C下攪拌浸提7h后用150目濾布過濾；將濾布上的濾渣按照上步驟提取一次，合并所得的兩次濾液；將濾液用醋酸將PH調(diào)至6. 5，按每克安康魚魚骨以0. Olg的加入量加入IOg木瓜蛋白酶，在50°C下保溫攪拌2. 5h后加熱至100°C滅酶5min ;在酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為62%，在2°C靜置22 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。三.用步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與硫酸肝素、成纖維生長因子、血管生成素、苯扎溴銨、戊二醛同時溶于濃度為0. I mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為3%，硫酸軟骨素為I. 2%，硫酸肝素為0. 04%，成纖維生長因子與血小板生成素共為0. 005%,苯扎溴銨為0. 3%，戊二醛為0. 4% ;將所得混合液注入模具中，在2°C下靜置13 h，在-40°C預冷6h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中，冷凍干燥的降溫范圍為_25°C _60°C，降溫速度為4°C /min，真空冷凍干燥36小時后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌40 min后得到復合膠原敷料成品。實施例3
一.取I. 5kg鱈魚皮洗凈后搗碎待用；搗碎后的鱈魚皮中按每克鱈魚皮以12ml的加入量加入18L濃度為0. 2mol/L的NaOH溶液，浸泡24h，每隔6 h更換I次NaOH溶液，最后用蒸餾水洗至pH為中性；按每克鱈魚皮以18ml的加入量加入27L體積百分數(shù)為13%的正丁醇溶液，攪拌16h后用蒸餾水洗至pH為中性；按每克鱈魚皮以115ml的加入量加入22. 5L蒸餾水，再用鹽酸調(diào)節(jié)PH為7后按每克鱈魚皮以0. 02g的加入量加入30g木瓜蛋白酶，在50°C下保溫并攪拌3h，再用氨水調(diào)節(jié)酶解溶液pH至7. 5后按每克鱈魚皮以0. 02g的加入量加A 30g胰蛋白酶，在50°C下保溫并攪拌4h，最后加熱至95°C滅酶8min ;將得到的酶解液在4°C離心，收取上層清夜，加入氯化鈉固體直至清液中無沉淀物析出；將沉淀物以0. 6mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋，用0. 15 mol/L醋酸溶液作為透析外液透析26 h,每4. 5h更換透析外液，再用蒸餾水作為透析外液透析24h，每4h更換透析外液，最后將透析液冷凍干燥后得到膠原蛋白。二 .取Ikg鱈魚魚骨，將鱈魚魚骨上的殘肉剔凈后在45°C熱水中清洗干凈；在處理后的鱈魚魚骨中按每克鱈魚魚骨以15ml的加入量及每克鱈魚魚骨以300ml的加入量分別加入15L濃度為I. 0 mol/L的NaOH溶液與300L質(zhì)量百分數(shù)為12%的NaCl溶液，再將鱈魚魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在55°C下攪拌浸提6h后用180目濾布過濾；將濾布 上的濾渣按照上步驟提取一次，合并所得的兩次濾液；將濾液用醋酸將PH調(diào)至7，按每克鱈魚魚骨以0. 006g的加入量加入6g木瓜蛋白酶，在55°C下保溫攪拌3 h后加熱至95°C滅酶8min ;在酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為65%，在4°C靜置24 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。三.用步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與硫酸肝素、成纖維生長因子、人表皮生長因子、血小板生成素、血管生成素、苯扎氯銨、戊二醛同時溶于濃度為0. 15 mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為2. 0%，硫酸軟骨素為I. 5%，硫酸肝素為0. 05%，成纖維生長因子、人表皮生長因子、血小板生成素、血管生成素共為0. 003%,苯扎溴銨為0. 4%,戊二醒為0. 6% ;將所得混合液注入模具中，在4°C下靜置15h，在-50°C預冷7h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中，冷凍干燥的降溫范圍為_25°C _60°C，降溫速度為3. 50C /min，真空冷凍干燥28小時后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌50 min后得到復合膠原敷料成品。實施例4
一.取I. 5kg鱈魚皮洗凈后搗碎待用；搗碎后的鱈魚皮中按每克鱈魚皮以14ml的加入量加入21L濃度為0. lmol/L的NaOH溶液，浸泡30h，每隔5 h更換I次NaOH溶液，最后用蒸餾水洗至PH為中性；按每克鱈魚皮以16ml的加入量加入24L體積百分數(shù)為15%的正丁醇溶液，攪拌24h后用蒸餾水洗至pH為中性；按每克鱈魚皮以IOml的加入量加入15L蒸餾水，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6. 5后按每克鱈魚皮以0. Olg的加入量加入15g木瓜蛋白酶，在60°C下保溫并攪拌3h，再用氨水調(diào)節(jié)酶解溶液pH至9. 0后按每克鱈魚皮以0. Olg的加入量加入15克g蛋白酶，在50°C下保溫并攪拌5h，最后加熱至100°C滅酶IOmin ;將得到的酶解液在0°C離心，收取上層清夜，加入氯化鈉固體直至清液中無沉淀物析出；將沉淀物以
0.5mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋,用0. 2 mol/L醋酸溶液作為透析外液透析36 h,每5h更換透析外液,再用蒸懼水作為透析外液透析36 h,每5h更換透析外液,最后將透析液冷凍干燥后得到膠原蛋白。二 .取Ikg安康魚魚骨，將安康魚魚骨上的殘肉剔凈后在40°C熱水中清洗干凈；在處理后的安康魚魚骨中按每克安康魚魚骨以IOml的加入量及每克安康魚魚骨以250ml的加入量分別加入10L濃度為0. 7 mol/L的NaOH溶液與250L質(zhì)量百分數(shù)為10%的NaCl溶液，再將安康魚魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50°C下攪拌浸提8h后用200目濾布過濾；將濾布上的濾渣按照上步驟提取一次，合并所得的兩次濾液；將濾液用醋酸將PH調(diào)至7. 5，按每克安康魚魚骨以0. Olg的加入量加入IOg木瓜蛋白酶，在50°C下保溫攪拌3 h后加熱至90°C滅酶5min ;在酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為60%，在0°C靜置18 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。三.用步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與硫酸肝素、人表皮生長因子、血小板生成素、苯扎氯銨、戊二醛同時溶于濃度為0. 2 mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為2%，硫酸軟骨素為I. 3%，硫酸肝素為
0.03%，人表皮生長因子與血小板生成素共為0. 005%,苯扎氯銨為0. 1%，戊二醛為0. 8% ;將所得混合液注入模具中，在:TC下靜置12 h，在-35°C預冷8h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中，冷凍干燥的降溫范圍為_25°C _60°C，降溫速度為3°C /min，真空冷凍干燥26小時后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌60 min后得到復合膠原敷料成品。上述實施例均采用從海洋魚類中提取的膠原蛋白與硫酸軟骨素來制備膠原復合膠原敷料，不僅可以提高海洋魚類的綜合利用率，而且制備的復合膠原敷料成本較低，安全性好，可杜絕病毒隱患，同時在制備過程中均加入了生長因子與抗炎消毒劑，可增加傷口的愈合。
權(quán)利要求
1.一種海洋源復合膠原敷料的制備方法，其特征是，所述的制備方法包括以下步驟 利用酶法從海洋魚類表皮中提取膠原蛋白； 從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素； 將步驟一提取的膠原蛋白、步驟二提取的硫酸軟骨素與絮凝劑、生長因子、抗炎消毒齊U、交聯(lián)劑同時溶于濃度為0. 05-0. 2 mol/L的醋酸溶液中混合均勻，混合液中，各組分的質(zhì)量百分含量為膠原蛋白為2.0 3. 0%，硫酸軟骨素為1.0 1.5%，絮凝劑為0. 03 0. 05%，生長因子為0. 001 0. 005%，抗炎消毒劑為0. I 0. 4%，交聯(lián)劑為0. 3 0. 8% ;將所得混合液注入模具中，在0 4°c下靜置12 18 h后預冷5 8h，最后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中真空冷凍干燥24 36h后便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co福照滅菌30 60 min后得到復合膠原敷料成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征是，步驟三中所述的絮凝劑為硫酸肝素，所述的生長因子為成纖維生長因子、人表皮生長因子、血小板生成素或血管生成素中的一種或幾種，所述的抗炎消毒劑為苯扎溴銨或苯扎氯銨，所述的交聯(lián)劑為戊二醛。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征是，步驟三中所述的預冷溫度為-30 -50 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的制備方法，其特征是，步驟三中所述的冷凍干燥的降溫范圍為_25°C _60°C，降溫速度為3 4°C /min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征是，步驟一中所述的利用酶法從海洋魚類表皮中提取膠原蛋白包括以下步驟 將海洋魚類表皮洗凈后搗碎待用； 在步驟(I)得到的海洋魚類表皮中加入NaOH溶液浸泡24-30h，每隔5 6 h更換NaOH溶液I次，最后用蒸餾水洗至PH為中性； 加入正丁醇溶液攪拌16-24h后用蒸餾水洗至pH為中性； 按每克海洋魚類表皮以10 15ml的加入量加入蒸餾水，再調(diào)節(jié)pH至6. 5 7. 5后按每克海洋魚類表皮以0. 01 0. 02g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45 60°C下保溫并攪拌3 5h，再調(diào)節(jié)酶解溶液pH至7. 5 9. 0后按每克海洋魚類表皮以0. 01 0. 02g的加入量加入胰蛋白酶，在45 60°C下保溫并攪拌3 5h，最后加熱至90 10(TC滅酶5 IOmin ； 將得到的酶解液在0 4°C離心，收取上層清夜進行鹽析沉淀； 將沉淀物以0. 5 0. 7mol/L醋酸溶液復溶后裝入透析袋，用0. I 0. 2 mol/L醋酸溶液作為透析外液透析24 36 h，每4 5h更換透析外液，再用蒸餾水作為透析外液透析24 36 h，每4 5h更換透析外液，最后將透析液冷凍干燥后即得膠原蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的NaOH溶液濃度為0.I 0. 5mol/L，并按每克海洋魚類表皮以10 15ml的加入量加入。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的，其特征是，步驟(3)中所述的正丁醇溶液中正丁醇的體積百分數(shù)為10 15%，并按每克海洋魚類表皮以15 20ml的加入量加入。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征是，步驟一中所述的從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素包括以下步驟 將海洋魚類魚骨上的殘肉剔凈后在40 50°C熱水中清洗干凈；處理后的海洋魚類魚骨中加入NaOH溶液與NaCl溶液，再將海洋魚類魚骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50 60°C下攪拌浸提6 8h后用150 200目濾布過濾；將步驟b得到的濾渣按照步驟b再提取一次，合并步驟b與步驟c所得的兩次濾液；將步驟c所得濾液pH調(diào)至6. 5 7. 5，按每克海洋魚類魚骨以0. 005 0. Olg的加入量加入木瓜蛋白酶，在45 55°C下保溫攪拌2 3 h后加熱至90 100°C滅酶5 IOmin ；在步驟d的酶解液中不斷加水攪拌加無水乙醇直至溶液中乙醇的體積百分數(shù)為60 65%，在0 4°C靜置18 24 h后離心分離，沉淀物用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得硫酸軟骨素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是，步驟a中所述的NaOH溶液濃度為0. 5 I. 0 mol/L，并按每克海洋魚類魚骨以10 20ml的加入量加入，所述的NaCl溶液中NaCl的質(zhì)量百分數(shù)為10 15%，并按每克海洋魚類魚骨以200 300ml的加入量加入。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋源復合膠原敷料的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟利用酶法從海洋魚類表皮中提取膠原蛋白；從海洋魚類魚骨中提取硫酸軟骨素；將提取的膠原蛋白及硫酸軟骨素與絮凝劑、生長因子、抗炎消毒劑、交聯(lián)劑同時溶于醋酸溶液中混合均勻；將所得混合液注入模具中交聯(lián)后迅速轉(zhuǎn)至冷凍干燥機中真空冷凍干燥便得到復合膠原敷料粗品；將得到的復合膠原敷料粗品包裝后，用60Co輻照滅菌后得到復合膠原敷料成品。本發(fā)明提供了一種從海洋魚類中提取的膠原蛋白與硫酸軟骨素來制備復合膠原敷料的方法，可以提高海洋魚類的綜合利用率，通過本發(fā)明制備的復合膠原敷料成本低，安全性好，韌性高，黏附性強，能促進傷口的愈合。
文檔編號A61L15/32GK102671231SQ20111042772
公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者付萬冬, 周宇芳, 廖妙飛, 楊會成, 王維倫, 鄭斌, 鐘明杰 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院