專利名稱：一種含有植物血球凝集素或植物血球凝集素亞型的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳類(包括人)、禽鳥類、水生類等動物醫(yī)藥方面或醫(yī)療方面的技術(shù)領(lǐng)域，特別是保護植物血凝素或其亞型穩(wěn)定的組合物。本發(fā)明所述的植物血球凝集素可以稱之為植物凝集素。所述植物血球凝集素或植物血球凝集素亞型可以按照申請日之前的制備方法得到，或者由市場銷售獲得。本發(fā)明所述抗生素中“單位”是指抗生素是一種生理活性物質(zhì)，它對生命現(xiàn)象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效價，其最小效價單元就叫做“單位”(U)。
背景技術(shù)：
植物血球凝集素(PHA)又稱之為植物凝集素，具有凝集紅血球，促進淋巴細胞的分化、成熟和分裂的作用，屬新一代廣譜抗病毒和非特異性免疫功能刺激劑。主要用于激活免疫細胞-淋巴細胞，是從豆科、禾本科、蕁麻科、嬰粟科、商陸科、茄科、石蒜科、?？?、葫蘆科、莧科等中提取的一種物質(zhì)。目前植物血球凝集素(PHA)應用比較廣泛，臨床主要應用于急性白血病、乳癌、腸癌、鼻咽癌、再生障礙性貧血及肝炎等；作為廣譜抗病毒藥，可用于防制家禽、家畜病毒性疾病，如雞的傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎；新城疫、傳染性法氏囊、雞痘；鴨的鴨瘟、鴨病毒性肝炎；豬的圓環(huán)病毒、豬傳染性胃腸炎二豬病毒性腹瀉；豬繁殖與呼吸綜合征、非典型豬瘟；犬、水貂的犬瘟熱；犬細小病毒等病毒性疾病。作為動物免疫增強劑，可用于疾病輔助用藥或用于免疫功能受損引起的疾病，用來增強動物免疫力、提高藥物的療效。由于植物血球凝集素(PHA)及其不同的亞型不易以液態(tài)形式保存，目前國內(nèi)大部分的科研單位使用的較純PHA或其亞型產(chǎn)品，基本都是在真空環(huán)境下，長時間(大約3天) 經(jīng)超低溫(_85°C )冷凍干燥，來制備成白色無味粉末，耗費大量人力和物力，電力耗費更大，成本極高。因此如何實現(xiàn)PHA或其亞型以液態(tài)形式的保存，增強其穩(wěn)定性，使產(chǎn)品多元化，降低產(chǎn)品成本，已成為目前急需解決的技術(shù)問題。
發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本公司科研人員經(jīng)過長期的實驗研究，通過對產(chǎn)品穩(wěn)定劑的多次改進試驗，發(fā)現(xiàn)植物血球凝集素(PHA)或其亞型保存的有效組方，由此我公司可實現(xiàn)產(chǎn)品的多元化，包括醫(yī)用級、動物級、精品級、試劑級等，為PHA或其亞型的各個領(lǐng)域的應用打開提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。為達到上述目的，本發(fā)明所采取的解決方案是一種含有植物血球凝集素的組合物，它包括穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包括抗生素、螯合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，它包括穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包括抗生素、 螯合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。本發(fā)明所述的植物血球凝集素可以稱之為植物凝集素。所述植物血球凝集素或植物血球凝集素亞型可以按照申請日之前的制備方法得到，或者由市場購買獲得。上述所述抗生素包括但不限于青霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、土霉素；上述所述螯合劑包括但不限于金屬離子螯合劑EDTA(乙二胺四乙酸)、氨基三乙酸(NTA)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)中一種或幾種；上述所述螯合劑包括但不限于氨基酸螯合劑氨基酸螯合鋅、氨基酸螯合鐵、氨基酸螯合鈣、蛋氨酸鋅、賴氨酸螯合錳、甘氨酸鐵中的一種或幾種；上述所述抗氧化劑包括但不限于維生素C、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉鹽。上述所述含有植物血球凝集素的組合物可以通過冷凍干燥等技術(shù)制備成粉末保存；(任意比例)上述所述植物血凝素組合物可以溶解在水中制備成產(chǎn)品。(任意比例)上述所述的含有植物血球凝集素亞型的組合物可以通過冷凍干燥等技術(shù)制備成粉末保存；(任意比例)上述所述植物血凝素亞型組合物可以溶解在水中制備成產(chǎn)品。(任意比例)上述所述一種含有植物血球凝集素的組合物，其中優(yōu)選穩(wěn)定劑的比例包括抗生素80-120單位/ml ；或者螯合劑0. 1-0. 5mg/ml ；或者抗氧化劑0. 1-0. 5mg/ml。上述所述一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其中優(yōu)選穩(wěn)定劑的比例包括 抗生素80-120單位/ml ；或者螯合劑0. 1-0. 5mg/ml ；或者抗氧化劑0. 1-0. 5mg/ml。上述所述植物血球凝集素包括但不限于豆科凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素、莧科凝集素、II型核糖體失活蛋白、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集
O上述所述植物血球凝集素亞型包括但不限于PHA-E和PHA-L。上述所述植物血球凝集素或者植物血球凝集素亞型在水中濃度為在飽和溶解度下任意濃度。本發(fā)明上述所述的組合物可以以液體形式存在，也可以經(jīng)過凍干等工藝得到凍干粉形式存在。本發(fā)明所述抗生素中“單位”是指抗生素是一種生理活性物質(zhì)，它對生命現(xiàn)象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效價，其最小效價單元就叫做“單位”(U)。本發(fā)明組合物中植物血凝素或亞型與氨基酸螯合劑組合時，可以用于飼料使用， 用于禽畜等預防、治療疾病等。本發(fā)明組合物有益的技術(shù)效果(1)使產(chǎn)品可以以液態(tài)形式保存，拓寬了產(chǎn)品應用，實現(xiàn)了產(chǎn)品的多元化。(2)大大降低了成本，利于產(chǎn)品規(guī)?；?。(3)建立了一種PHA(植物血凝素)保存和應用的新方法。(4)為我國醫(yī)藥、食品、日化提供了新的發(fā)展機會。(5)對開發(fā)防治禽流感與水生魚類繁殖制劑技術(shù)的發(fā)展帶來新的契機。一、試驗研究本發(fā)明下述試驗是在多次試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)本發(fā)明所要保護的技術(shù)方案進行的試驗。下述試驗中植物血球凝集素購自廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所。
1、預實驗試驗組別試驗1組(對照)取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中；試驗2組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入蛋白酶抑制劑100 μ g ；
試驗3組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入L-谷氨酰胺1. 6mg ；試驗4組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入L-谷氨酰胺3. 2mg ；試驗5組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml緩沖液中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液 (ρΗ6· 8)。試驗6組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入抗生素720單位，抗生
素為青霉素。試驗7組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入抗生素840單位，抗生
素為鏈霉素。試驗8組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入螯合劑0. 96mg,螯合劑為 EDTA。試驗9組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入抗氧化劑0. 96mg，抗氧化劑為去氧膽酸鈉。試驗10組取植物血球凝集素0. Ig溶解在12ml水中，加入螯合劑0. 96mg,螯合
劑為氨基酸螯合鈣。試驗方法將上述不同試驗組別分裝后分別放置于4°C冷藏箱中和常溫保存，在不同時間檢測其效價(凝集活力)，記錄其效價低于2的時間。檢測方法靜脈采血后，注入裝有玻璃珠的椎形瓶中搖動，以脫去纖維。取脫纖維血液2. 5mL加入50mL pH7. 2的血球緩沖液(PSB) (0. 02mol/L磷酸緩沖液，0. lmol/L NaCL) 將紅細胞配成5% (V/V)懸液，再加入含4%戍二醛的等體積PBS，立即混勻，再加入疊氮鈉 0. 2% (W/V)。室溫Q0-25°C )下靜置10小時，其間每隔2小時攪拌一次。然后用相同的 PBS洗滌數(shù)次，除去未作用的戍二醛，用IOOmL相同的PBS配成2. 5%的紅細胞懸液(每μ L 紅細胞懸液中紅細胞數(shù)目約為1. 6 X 105個)，40C 保存?zhèn)溆茫杀４?-6個月。在72孔“V” 型血凝板中每孔加入15μ L ρΗ7. 2的血球緩沖液。取凝集素標準樣品15μ 1，加入第一孔， 混勻后取出15 μ L，加入第二孔，混勻后亦取出15 μ L，加入第三孔。以此類推，作倍比稀釋。 待測樣品也按上述步驟操作。然后每孔加入15 μ L 2. 5%紅細胞懸液，在室溫Q0-25°C)置放1. 5-2小時。無凝集時血球沉于“V”型孔底部，呈一小圓點；凝集時血球相互集聚形成一片網(wǎng)絡(luò)，不下沉。不同程度的凝集孔，其凝集強度用數(shù)字表示紅細胞形成薄層凝集，均勻分布整個孔底(強凝集時邊緣可出現(xiàn)萎縮)，判為全凝集，記“4” ；孔內(nèi)凝集范圍比半凝集大， 未遍及全孔者，判為多半凝集，記為“3” ；紅細胞少許沉積中部，周圍有混濁帶，約占孔面積的50%，外圍液澄明者，判為半凝集，記為“2”；紅細胞大部分沉積于孔中心，沉積點邊緣模糊者，判為少許凝集，記為“1”。凝集效價的計算以“2”為終點。試驗結(jié)果見表1。表1不同組別的凝集力比較
權(quán)利要求
1.一種含有植物血球凝集素的組合物，其特征在于組合物包括穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包括抗生素、螯合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。
2.一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其特征在于它包括穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包括抗生素、螯合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有植物血球凝集素的組合物，其中抗生素包括青霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、土霉素；其中螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、氨基三乙酸 (NTA)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、氨基酸螯合鋅、氨基酸螯合鐵、氨基酸螯合鈣、蛋氨酸鋅、賴氨酸螯合錳、甘氨酸鐵中的一種或幾種；其中抗氧化劑包括維生素C、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其中抗生素包括青霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、土霉素；其中螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、氨基三乙酸 (NTA)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、氨基酸螯合鋅、氨基酸螯合鐵、氨基酸螯合鈣、蛋氨酸鋅、賴氨酸螯合錳、甘氨酸鐵中的一種或幾種；其中抗氧化劑包括維生素C、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種含有植物血球凝集素的組合物，其中植物血球凝集素組合物溶解在水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其中植物血凝素亞型組合物溶解在水中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種含有植物血球凝集素的組合物，其中穩(wěn)定劑中抗生素 80-120單位/ml ；或者螯合劑0. 1-0. 5mg/ml ；或者抗氧化劑0. 1-0. 5mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其中穩(wěn)定劑中抗生素 80-120單位/ml ；或者螯合劑0. 1-0. 5mg/ml ；或者抗氧化劑0. 1-0. 5mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述一種含有植物血球凝集素的組合物，其中植物血球凝集素包括豆科凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素、莧科凝集素、II型核糖體失活蛋白、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素。
10.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求2或4一種含有植物血球凝集素亞型的組合物，其中植物血球凝集素亞型包括PHA-E和PHA-L。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動物(包括人)醫(yī)藥方面或醫(yī)療方面的技術(shù)領(lǐng)域，特別是保護植物血球凝集素(PHA)或其亞型穩(wěn)定的組合物。本公司科研人員經(jīng)過長期的實驗研究，通過對植物血球凝集素或其亞型的穩(wěn)定劑的多次改進試驗，找到植物血球凝集素或其亞型穩(wěn)定保存的有效組方，其中穩(wěn)定劑包括抗生素、螯合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。由此我公司可實現(xiàn)產(chǎn)品的多元化，包括醫(yī)用級、動物級、精品級、試劑級等，為PHA或其亞型的各個領(lǐng)域的應用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/20GK102416163SQ201110394270
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者李錦明, 秦清和 申請人:惠州鴻雨科技有限公司