專利名稱：抗腫瘤多藥耐藥靶向脂質體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤耐藥的脂質體及其制備方法，特別涉及抗腫瘤多藥耐藥長循環(huán)靶向脂質體。其特征在于將槲皮素與抗腫瘤藥物聯(lián)合包載于脂質體中，同時靶向于腫瘤組織，逆轉腫瘤多藥耐藥，增強抗腫瘤藥物對耐藥腫瘤的細胞毒作用，避免不同藥物在體內藥代動力學性質上的差異和相互作用導致的抗腫瘤藥物體內藥代動力學性質的改變和毒副作用增強，提高對耐藥腫瘤的治療效果。
背景技術：
腫瘤多藥耐藥(Multidrug Resistance, MDR)是指腫瘤細胞長期接觸一種化療藥物產生耐藥性后，此腫瘤對未接觸過的、結構無關、機制各異的多種抗腫瘤藥物產生交叉耐藥性。目前已知與MDR有關的藥物包括阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、博來霉素、絲裂霉素、 長春堿、依托泊苷、紫杉醇類，以及順鉬和美法蘭等；隨著化療藥物的頻繁使用，腫瘤治療中的耐藥問題顯得越來越突出，目前已成為腫瘤化學治療最嚴重的障礙之一。美國癌癥協(xié)會估計90%的癌癥患者的死亡在不同程度上與耐藥性的產生有關。MDR形成的分子機制相當復雜，包括①多藥耐藥基因(MDRl)及其所編碼的細胞膜P-gp(P-glyc0pr0tein)過度表達，以及MDR相關蛋白(Multidrug resistance-relatedprotein,MRP)表達增加，促進藥物外排和藥物的亞細胞分布改變以降低腫瘤中的藥物濃度；②核酶DNA拓撲異構酶II (Topoisomerase II, TOPO II)含量減少或性質改變，導致對以TOPO為靶點的抗腫瘤藥物耐藥；③細胞內氧化和解毒酶系統(tǒng)谷胱甘肽(GSH)轉移酶(GST)，以及P450活性增強，腫瘤細胞內藥物滅活增加；④腫瘤細胞內DNA 修復能力增強；⑤蛋白激酶(Proteinkinase C, PKC)活性表達增加，使P_gp或MRP發(fā)生磷酸化而具有活性；⑥細胞凋亡(Programmedcel death，P⑶)相關基因對MDR基因表達的調節(jié)；⑦其它機制還包括細胞增殖速率改變，以及體內藥代動力學因素改變等。MDR的形成是一個諸多因素參與的復雜生物過程，可以是某一耐藥基因表達，也可以是多種耐藥基因同時表達的多種耐藥表型。如何針對MDR的發(fā)生機制設計出特異性的干預對策，以提高腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性，已成為國內外腫瘤治療學的研究熱點。到目前為止，人們已經嘗試了多種方法努力克服腫瘤MDR，包括使用化學增敏劑和抗腫瘤藥物的靶向治療等。研究最深入，最重要的還是針對MDRl/P-gp介導的MDR的逆轉劑。此外，還有與谷胱甘肽(GSH)轉移酶(GST)有關的MDR逆轉劑和與DNA修復有關的MDR逆轉劑，以及與蛋白激酶(H(C)有關的MDR逆轉劑等。但目前的腫瘤MDR逆轉劑普遍存在作用靶點單一，自身毒副作用大的問題，使其臨床應用受到很大影響。已有的個別研究嘗試了將抗腫瘤藥物與腫瘤耐藥逆轉劑聯(lián)合給藥，但最終效果不好。此外，有報道嘗試采用脂質體為載體同時包載抗腫瘤藥物與其它藥物共同治療腫瘤，但通過進一步研究發(fā)現(xiàn)這些藥物與抗腫瘤藥物聯(lián)用后仍不能很好的解決多藥耐藥的問題。
發(fā)明內容
本發(fā)明通過比較摸索不同的腫瘤耐藥逆轉劑，發(fā)現(xiàn)槲皮素作為多靶點高效腫瘤 MDR逆轉劑，與抗腫瘤藥物聯(lián)用效果好，并且適合采用脂質體制備技術制備復方長循環(huán)脂質體，通過靜脈注射實現(xiàn)腫瘤MDR逆轉劑與抗腫瘤藥物的靶向給藥，顯著提高對耐藥腫瘤的治療效果。本發(fā)明提供了一種抗腫瘤的脂質體，脂質體的活性成分含有至少一種抗腫瘤藥物以及至少一種腫瘤耐藥逆轉劑。本發(fā)明的抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或其藥學上可接受的鹽或酯中的一種或多種，這些抗腫瘤藥物的理化性質和藥理活性相似，都可應用于本發(fā)明。本發(fā)明的腫瘤耐藥逆轉劑為槲皮素或其藥學上可接受的鹽或酯。優(yōu)選本發(fā)明脂質體中的活性成分由上述兩類物質組成，優(yōu)選阿霉素和槲皮素或它們藥學上可接受的鹽，具體可使用阿霉素和槲皮素。本發(fā)明的脂質體含有上述活性成分、磷脂和膽固醇，磷脂和膽固醇的用量以能夠形成脂質體為目標根據(jù)需要進行調整，優(yōu)選磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為5 40 1， 磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為5 0.5 5。優(yōu)選磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為10 30 1，磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為5 1 3。最優(yōu)選所述磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為20 1，磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為5 1。磷脂和膽固醇的摩爾比為1 5 1;優(yōu)選摩爾比為2 4 1;最優(yōu)選摩爾比為3 1。本發(fā)明所采用的磷脂可采用本領域中制備脂質體的常規(guī)磷脂，磷脂選自一種或多種大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)，二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)，二棕櫚酰卵磷脂 (DPPC)，二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰卵磷脂(MPPC)，1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)，1-棕櫚酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕櫚酰卵磷脂(SPPC)，蛋黃卵磷脂(EPC)，氫化蛋卵黃磷脂(HEPC)，大豆磷脂(SPC)，氫化大豆磷脂 (HSPC)，二油酰基卵磷脂(DOPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)，二棕櫚脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(DMPS)，二棕櫚酰磷脂酰二絲氨酸(DPPS)，腦磷脂酰絲氨酸(PS)，腦神經鞘磷脂(BSP)，二棕櫚酰神經鞘磷脂(DPSP)，二硬脂酰神經鞘磷脂(DSSP)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。優(yōu)選采用氫化大豆磷脂。本發(fā)明還進一步提供了長循環(huán)脂質體，通過使脂質體中進一步含有被PEG修飾的磷脂或膽固醇達到長循環(huán)的效果。本發(fā)明選用的PEG修飾的磷脂或膽固醇中PEG的分子量為 200-5000，優(yōu)選 1000-4000，更優(yōu)選 2000-3000，最優(yōu)選為 2000。本發(fā)明優(yōu)選使用被PEG修飾的磷脂，特別是PEG修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)制備長循環(huán)脂質體。通過實驗摸索，確定最適合本發(fā)明的磷脂和PEG修飾的磷脂的摩爾比為12 4 1;優(yōu)選摩爾比為10 6 1;最優(yōu)選摩爾比為8 1。在此條件下，脂質體既能保證具有長效的效果，且制備的脂質體活性藥物包封率較高。本發(fā)明具體提供的脂質體含有阿霉素、槲皮素、膽固醇、氫化大豆磷脂和PEG2000 修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。本發(fā)明進一步具體提供的脂質體是含有以下摩爾比的成分的脂質體
5成分
氫化大豆磷脂膽固醇
PEG2000修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
摩爾比 120 40 15 6
24
阿霉素槲皮素本發(fā)明還提供了制備上述脂質體的方法，所述方法包括以下步驟采用薄膜分散法制備腫瘤耐藥逆轉劑脂質體；用擠壓過聚碳酸酯膜或高壓均質、超聲等方法將脂質體的粒徑控制在200nm以內；然后采用硫酸銨梯度法或PH梯度法包載抗腫瘤藥物，優(yōu)選采用硫酸銨梯度法，特別優(yōu)選使用透析方式形成硫酸胺梯度。在進行硫酸銨梯度法時，實驗證明適當控制孵育溫度將有利于脂質體中抗腫瘤藥物的包載，孵育溫度優(yōu)選控制在45-75°C ；更優(yōu)選50-65°C ；最優(yōu)選55°C。本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明脂質體的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物適合制備成注射制劑，通過靜脈注射的方式給藥實現(xiàn)對耐藥腫瘤的靶向治療。本發(fā)明中所稱的“磷脂”或“膽固醇”系指未連接PEG基團的磷脂和膽固醇。本發(fā)明所稱的“PEG修飾的磷脂”或“PEG修飾的膽固醇”系指具有PEG基團的修飾后的磷脂或膽固醇。多酚類化合物槲皮素(Quercetin)對多種惡性腫瘤細胞，如多種白血病細胞、人卵巢癌細胞、膀胱癌細胞、前列腺癌細胞、多種胃癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、骨髓瘤細胞、鼻咽癌細胞、神經膠質瘤細胞、乳腺癌細胞、Hela細胞、Ehrlich腹水癌細胞和NK/LY實體瘤細胞等均具有抑制其增殖的作用，同時還能夠通過多種機制強力逆轉腫瘤MDR，具有良好的臨床應用前景。但在臨床使用時，要發(fā)揮槲皮素抑制腫瘤細胞增殖和逆轉腫瘤MDR的作用需要使其在腫瘤部位達到有效濃度。特別是在與抗腫瘤藥物聯(lián)合應用時，如何使槲皮素與抗腫瘤藥物同時在腫瘤部位達到有效治療濃度，發(fā)揮協(xié)同作用，就成為問題的關鍵。通過常規(guī)給藥途徑，由于二者體內藥代動力學性質上的差異，通常難以實現(xiàn)上述目標；此外， 由于槲皮素可直接抑制P-gp的表達，并且對細胞色素P4503A(CYP3A)同工酶的活性具有抑制作用。通過常規(guī)給藥途徑與抗腫瘤藥物合用時，伴隨正常細胞的P-gp功能抑制和CYP3A 活性降低，會導致合用藥物的清除率發(fā)生改變，從而提高抗腫瘤藥物的血藥濃度，延長體內半衰期，增加在人體各器官的累積，增大毒副作用。為克服上述難題，如何提高槲皮素與抗腫瘤藥物聯(lián)合給藥的靶向性，降低其在正常組織中的藥物濃度，就成為要考慮和解決的關鍵問題。脂質體由磷脂和膽固醇組成，具有類似細胞膜的雙分子層結構，可以包封水溶性藥物和脂溶性藥物。經親水性聚乙二醇(PEG)修飾的長循環(huán)脂質體能夠逃避血漿中調理素的調理，避免被巨噬細胞攝取，從而顯著延長藥物在循環(huán)系統(tǒng)內的滯留時間，提高藥物的血藥濃度，通過在腫瘤新生血管部位的滲透滯留增強效應(EPR)增加被包載藥物在腫瘤組織內的分布，增強抗腫瘤藥物的治療指數(shù)，是抗腫瘤藥物靶向治療的優(yōu)良載體。經研究發(fā)現(xiàn)采用長循環(huán)脂質體為載體同時包載腫瘤MDR逆轉劑與抗腫瘤藥物，通過靶向效應將兩種藥物同時靶向于腫瘤部位，能夠有效避免兩種藥物在體內藥代動力學性質上的差異和相互作用導致的抗腫瘤藥物體內藥代動力學性質的改變和毒副作用的增強，有利于提高對耐藥腫瘤的治療效果。但多種藥物與阿霉素類抗腫瘤藥物聯(lián)用制備成脂質體后，實際效果不佳。通過研究，意外發(fā)現(xiàn)槲皮素和阿霉素聯(lián)用制備成脂質體，特別是長循環(huán)脂質體對耐用腫瘤具有顯著地治療效果。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的組合物用長循環(huán)脂質體為載體，聯(lián)合包載多靶點高效腫瘤MDR逆轉劑槲皮素與抗腫瘤藥物，通過腫瘤新生血管部位的滲透滯留增強效應(EPR)靶向于腫瘤組織， 可以顯著提高抗腫瘤藥物對耐藥腫瘤的治療效果。本發(fā)明的脂質體中脂溶性的多靶點高效腫瘤MDR逆轉劑槲皮素以分子狀態(tài)分散在脂質體的脂質雙分子層中，進入腫瘤組織后能夠通過與細胞膜之間的吸附、脂交換、膜融合和細胞內吞等作用較快釋放；而阿霉素等蒽環(huán)類抗腫瘤藥物由于在脂質體中產生不溶性沉淀而緩慢釋放。先釋放的槲皮素逆轉腫瘤細胞的耐藥性和P-gp介導的藥物外排作用，提高阿霉素等蒽環(huán)類抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內的濃度，增強其對腫瘤細胞的細胞毒作用，因此特別有利于高效的殺傷耐藥腫瘤細胞。本發(fā)明的藥物組合物制備方法簡單，技術可行，有利于產業(yè)化。
具體實施例方式通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為本發(fā)明的限制。實施例1 不同腫瘤耐藥逆轉劑-阿霉素聯(lián)合包載脂質體的血漿滲漏率比較稱取處方量的HSPC、CHOL、DSPE-PEG2000、槲皮素或姜黃素 (HSPC CHOL DSPE-PEG2000 槲皮素或姜黃素=120 40 15 6mol/mol)置梨形瓶中，加無水乙醇溶解。40°C減壓旋轉蒸發(fā)形成均勻的薄膜。加入0. 15mol/L硫酸銨溶液， 75°C水浴常壓水化30min，使磷脂充分溶脹水合。所得混懸液經探頭超聲(600W) 9min，再依次經0. 8 μ m、0. 4 μ m和0. 2 μ m核跡聚碳酸酯膜擠出各5次整粒。所得脂質體置于透析袋 (分子量8000-14000M)中，用生理鹽水透析10h，形成硫酸銨梯度；再與處方量的阿霉素溶液 1 1 (ν/ν)混合(HSPC DOX = 5 lmol/mol)，55°C水浴孵育 25min，即得本品。所得槲皮素-阿霉素復方長循環(huán)脂質體平均粒徑為118nm,姜黃素-阿霉素復方長循環(huán)脂質平均粒徑為U9nm。稱取處方量的HSPC、CHOL、DSPE-PEG2000 (HSPC CHOL DSPE-PEG2000 = 120 40 15m0l/m0l)置梨形瓶中，加無水乙醇溶解。40°C減壓旋轉蒸發(fā)形成均勻的薄膜。加入0. 15mol/L硫酸銨溶液，75°C水浴常壓水化30min，使磷脂充分溶脹水合。所得混懸液經探頭超聲(600W) 9min,再依次經0. 8 μ m、0. 4 μ m和0. 2 μ m核跡聚碳酸酯膜擠出各5 次整粒。所得脂質體置于透析袋(分子量8000-14000M)中，用生理鹽水透析10h，形成硫酸銨梯度；再與處方量的阿霉素和維拉帕米或粉防己堿溶液1 1 (v/v)混合(HSPC DOX =5 lmol/mol, HSPC 維拉帕米或粉防己堿=5 lmol/mol)，55°C水浴孵育25min，即得本品。所得維拉帕米-阿霉素復方長循環(huán)脂質體平均粒徑為103nm，粉防己堿-阿霉素復方長循環(huán)脂質平均粒徑為117nm。脂質體的血漿滲漏率測定方法取上述脂質體與空白血漿于37°C孵育，分別于不同時間點取樣，經超速離心G°C，200，000g)后取上清液測定藥物含量，與脂質體中藥物的初始含量比較，計算滲漏率，結果見表1。表1脂質體的血漿滲漏率測定結果
權利要求
1.一種抗腫瘤的脂質體，其特征在于所述脂質體的活性成分含有至少一種抗腫瘤藥物以及至少一種腫瘤耐藥逆轉劑，其中所述抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或其藥學上可接受的鹽或酯中的一種或多種，所述腫瘤耐藥逆轉劑為槲皮素或其藥學上可接受的鹽或酯；優(yōu)選所述活性成分由上述兩類物質組成，最優(yōu)選所述活性物質是阿霉素和槲皮素或它們藥學上可接受的鹽，具體采用阿霉素和槲皮素。
2.根據(jù)權利要求1所述的脂質體，其特征在于所述脂質體含有活性成分、磷脂和膽固醇，優(yōu)選所述磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為5 40 1，磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為 5 0.5 5;更優(yōu)選所述磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為10 30 1，磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為5 1 3;最優(yōu)選所述磷脂和腫瘤耐藥逆轉劑的摩爾比為20 1，磷脂和腫瘤藥物的摩爾比為5 1。
3.根據(jù)權利要求2所述的脂質體，其特征在于所述磷脂和膽固醇的摩爾比為1 5 1 ；優(yōu)選摩爾比為2 4 1 ；最優(yōu)選摩爾比為3:1。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的脂質體，其特征在于所述磷脂選自一種或多種大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)，二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)，二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)，二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰卵磷脂(MPPC)，1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)，1-棕櫚酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕櫚酰卵磷脂(SPPC)，蛋黃卵磷脂(EPC)，氫化蛋黃卵磷脂(HEPC)，大豆磷脂(SPC)，氫化大豆磷脂(HSPC)，二油?；蚜字?DOPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)，二棕櫚脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油 (DSPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸 (DMPS)，二棕櫚酰磷脂酰二絲氨酸(DPPS)，腦磷脂酰絲氨酸(PS)，腦神經鞘磷脂(BSP)，二棕櫚酰神經鞘磷脂(DPSP)，二硬脂酰神經鞘磷脂(DSSP)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)； 優(yōu)選氫化大豆磷脂。
5.根據(jù)權利要求2-4所述的脂質體，其特征在于所述脂質體還含有被PEG修飾的磷脂或膽固醇；優(yōu)選含有被PEG修飾的磷脂；更優(yōu)選含有PEG修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)。
6.根據(jù)權利要求5所述的脂質體，其特征在于所述PEG的分子量為200-5000，優(yōu)選 1000-4000，更優(yōu)選 2000-3000，最優(yōu)選為 2000。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的脂質體，其特征在于所述磷脂和PEG修飾的磷脂的摩爾比為12 4 1;優(yōu)選摩爾比為10 6 1;最優(yōu)選摩爾比為8 1。
8.根據(jù)權利要求1所述的脂質體，其特征在于所述脂質體含有阿霉素、槲皮素、膽固醇、氫化大豆磷脂和PEG2000修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；優(yōu)選脂質體含有以下摩爾比的成分成分摩爾比氫化大豆磷脂120膽固醇40PEG2000修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺15 °阿霉素6槲皮素24
9.權利要求1-9任意一項所述脂質體的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟采用薄膜分散法制備腫瘤耐藥逆轉劑脂質體，用擠壓過聚碳酸酯膜或高壓均質、超聲等方法將脂質體的粒徑控制在200nm以內，然后采用硫酸銨梯度法或pH梯度法包載抗腫瘤藥物；優(yōu)選采用硫酸銨梯度法，更優(yōu)選所述硫酸銨梯度法使用透析方式形成硫酸胺梯度；硫酸銨梯度法中孵育溫度優(yōu)選控制在45-75°C ；更優(yōu)選50-65°C ；最優(yōu)選55°C。
10.一種藥物組合物，所述組合物含有權利要求1-8任意一項所述脂質體，優(yōu)選所述組合物是一種注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤耐藥的脂質體及其制備方法，特別涉及抗腫瘤多藥耐藥長循環(huán)靶向脂質體。其特征在于將槲皮素與抗腫瘤藥物聯(lián)合包載于脂質體中，同時靶向于腫瘤組織，逆轉腫瘤多藥耐藥，增強抗腫瘤藥物對耐藥腫瘤的細胞毒作用，避免不同藥物在體內藥代動力學性質上的差異和相互作用導致的抗腫瘤藥物體內藥代動力學性質的改變和毒副作用增強，提高對耐藥腫瘤的治療效果。
文檔編號A61P35/00GK102357074SQ20111034903
公開日2012年2月22日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者孫毅坤, 戴俊東, 王玉蓉, 王英姿, 陳浩 申請人:北京中醫(yī)藥大學