豐年蝦卵提取物、其制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：豐年蝦卵提取物、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豐年蝦卵提取物及其制備方法。本發(fā)明還涉及該提取物在治療和/或預(yù)防與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常和與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病中的用途。
背景技術(shù)：
一氧化氮(.Ν0)為生物體內(nèi)不穩(wěn)定的自由基，現(xiàn)今已成為人類生理及病理學(xué)重要指標(biāo)之一。一氧化氮是借助一氧化氮合成酶由L-精胺酸之端胍基的氮原子所形成。在生理狀況下，低量的.NO是由存在于多種細(xì)胞(包含內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元)中持續(xù)表現(xiàn)得鈣依賴性NOS異型態(tài)(cNOS)所產(chǎn)生。所述低量的一氧化氮與多種生理調(diào)節(jié)相關(guān)，例如血壓的控制、神經(jīng)信號的傳遞和免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)；另一方面，在病理狀況下，高量的.NO則由多種細(xì)胞型態(tài)(包含內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中可誘發(fā)表現(xiàn)的鈣依賴性NOS異型態(tài)(iNOS)所產(chǎn)生?？烧T發(fā)一氧化氮高量產(chǎn)生的刺激因子相當(dāng)多樣，例如炎癥性細(xì)胞素的過度制造(如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-1 (IL-1)、干擾素)可誘發(fā)的一氧化氮合成酶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生高量一氧化氮，進(jìn)而誘發(fā)發(fā)炎性細(xì)胞因子或其它發(fā)炎相關(guān)蛋白(例如，TNFa、IL-6、IL-1、IL-8、ICAM-U VCAM-1 和 VEGF)的過度產(chǎn)生?，F(xiàn)今，全球因氣 候變遷或各種污染物，例如全球暖化、溫室效應(yīng)、臭氧層破洞、紫外線過量、汽車排放有害氣體、室內(nèi)室外廢氣和二手煙等，已嚴(yán)重威脅到人類之健康。尤其過去100年來，臺灣的氣溫已上升1.3度，是全球平均值的2倍，估計未來的夏日將漫長又炎熱，使氣候因素與污染物的相互作用加劇，這些外在環(huán)境的改變，將對人體產(chǎn)生危害，尤以防御最前線的皮膚為最。當(dāng)皮膚新陳代謝減緩，陽光、紫外線、污染源，甚至生活方式與壓力的侵襲，導(dǎo)致其逐漸失去應(yīng)有的修復(fù)反應(yīng)與平衡狀態(tài)，此時細(xì)紋、斑點、松弛、粗糙、下垂等現(xiàn)象一一浮現(xiàn)。引發(fā)這些老化現(xiàn)象的原因之一是皮膚接受諸多內(nèi)外刺激，會于內(nèi)部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。根據(jù)特性與肇發(fā)原因可分為慢性炎癥反應(yīng)與神經(jīng)性炎癥反應(yīng)。皮膚連番接受兩種炎癥反應(yīng)的影響，會受到老化反應(yīng)加劇、皺紋提早出現(xiàn)和加深、皮膚失去緊實度等問題的困擾。皮膚炎癥反應(yīng)已成為抗老趨勢新顯學(xué)，除此之外，肌膚黑色素的生成是一項極為復(fù)雜的生理反應(yīng)，皮膚的炎癥、氧化反應(yīng)，也會導(dǎo)致黑色素生成，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)炎癥，會分泌細(xì)胞激素，刺激“酪氨酸酶”促使黑色素形成。再者，已知一氧化氮合成酶(特別是iNOS)與下列疾病有關(guān):血小板凝集、體內(nèi)平衡過程、組織損傷、發(fā)炎狀況、休克狀態(tài)、免疫病癥、胃腸能動性病癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病性神經(jīng)病變(Epstein, The New England Journal of Medicine, 1993, 329 (27):2002-2011 ；Hobbs 等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol, 1999, 39: 191-220 ；Pfeilschfter等人，Cell Biology International, 1996, 20 (I):51_58)。現(xiàn)有技術(shù)也指出神經(jīng)變性與糖尿病性潰瘍密切相關(guān)(N Engl J Med, Volume 343(11), September 14,2000，pp.787-793和 J.Fam.Pract, Volume 49 (II) Supplement.November 2000S40-S48)。一氧化氮合成酶亦與由一氧化氮引起的狀況有關(guān)，諸如組織損傷、腦部缺血、癲癇、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)(Mulligan 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1991,88:6338_6342)。許多嚴(yán)重且難治的人類疾病與發(fā)炎過程的調(diào)節(jié)異常有關(guān)，這類疾病包括傳統(tǒng)上未視為炎癥性病狀的疾病，諸如癌癥、動脈粥樣硬化和糖尿病。類似地，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、牛皮癬和多發(fā)性硬化癥的自身免疫疾病涉和患病組織中發(fā)炎過程的不當(dāng)且慢性的活化，其由免疫系統(tǒng)中自身識別和反應(yīng)機(jī)制對非自身識別和反應(yīng)機(jī)制的功能障礙引起。在諸如阿爾茨海默癥(Alzheimer, s disease)和帕金森氏癥(Parkinson, s disease)的神經(jīng)退化性疾病中，神經(jīng)損傷與微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和促炎性蛋白(例如誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS))的含量升高有關(guān)。源于四億年前地球上最原始的海洋浮游生物鹵蟲屬(學(xué)名=Artemia),俗稱豐年蝦(Artemia Salina)、鹵蟲、海猴子、鹽水蝦、鹽蟲子、水馬騮等，是無背甲目鹵蟲科下唯一的屬，可當(dāng)成寵物飼養(yǎng)，也可作為魚飼料，是軟珊瑚的主要食物之一。而在歷史紀(jì)載中，當(dāng)歐洲人最初進(jìn)入北美大陸之時，就曾發(fā)現(xiàn)東北美的一些印第安原住民就以曬干的豐年蝦卵做為輔助性食物。豐年蝦經(jīng)過漫長生物進(jìn)化，已發(fā)現(xiàn)其極耐各種惡劣的環(huán)境，豐年蝦能在連魚類也無法生存的含鹽量超過海水六倍的水域中存活。豐年蝦卵被稱為耐久卵，可長期抗拒外界環(huán)境中不利因素的傷害，保護(hù)其中休眠的胚胎，等到環(huán)境適合豐年蝦繁殖生存時，再破壁而出，繁衍種族。目前已發(fā)現(xiàn)，豐年蝦卵在長期高強(qiáng)度的紫外線、輻射線照射下，高溫干旱，以及在有毒溶劑中，皆表現(xiàn)出令人驚嘆的生命力和活動力。1978年法國和俄國科學(xué)家將豐年蝦卵送上外層空間，長達(dá)96小時接受外層空間極惡劣的環(huán)境，例如極溫、大量宇宙輻射線照射等。當(dāng)這些卵被帶回地 球后，在接下來的一二十年中做了大量的研究，包括孵化率和卵的化學(xué)成分改變等，結(jié)果顯示帶回的豐年蝦卵有高達(dá)96%的孵化率。依照豐年蝦的生活史及其從成蟲到幼蟲的過程，有各種對抗外界不利環(huán)境的分子，以保護(hù)豐年蝦卵渡過極端不利的環(huán)境，例如P26、青蒿琥酯(Artemin)、二鳥苷四磷酸(diguanosine tetraphosphate,GP4G)和海藻糖(Trehalose)。其中二鳥苷四憐酸已證實具有多種療效，例如歐洲專利第1049455號揭示其可加強(qiáng)皮膚免疫系統(tǒng)，刺激皮膚細(xì)胞再生，并且同時由改善角質(zhì)隔層的輔助提供紫外防護(hù)；中國臺灣專利公開第200640475號揭示其可刺激真皮或表皮大分子合成和/或防止其降解；日本專利公開第204238297號揭示二鳥苷四磷酸具有保護(hù)皮膚對抗外部壓力的作用，并可促進(jìn)熱休克蛋白的產(chǎn)生；日本專利公開第204238297號、美國專利公開第2009148544號、美國專利第7，615，546和7，544，375號和法國專利第2834887號揭示二鳥苷四磷酸具有活化再生細(xì)胞功能、改善皮膚細(xì)胞狀態(tài)、防止皮膚粗糙并可除皺和抗老化；中國臺灣專利第1281413號揭示其可調(diào)節(jié)細(xì)胞間的聯(lián)系；歐洲專利第1336402號揭示可促進(jìn)頭發(fā)生長和/或減少掉發(fā)。由于豐年蝦卵的成分豐富，極具治療潛力，本發(fā)明因此關(guān)注開發(fā)新穎豐年蝦卵提取物、其制造方法及其用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備豐年蝦卵提取物的方法，其包含下列步驟:
a)提供豐年蝦卵；b)逆境處理所述豐年蝦卵；和c)均質(zhì)化步驟b)的豐年奸卵。本發(fā)明還提供一種豐年蝦卵提取物。本發(fā)明又提供一種包含本發(fā)明豐年蝦卵提取物的組合物。本發(fā)明也提供一種根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵提取物在預(yù)防和/或治療與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常中的用途。本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵提取物在預(yù)防和/或治療與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病中的用途。本發(fā)明在以下部分中詳細(xì)描述。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點可顯而易見地在本發(fā)明的具體實施方式
和權(quán)利要求中發(fā)現(xiàn)。除非本文中另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科技術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語的含義和范疇?wèi)?yīng)是明確的；然而，若存在任何潛在得含糊性，則本文所提供的定義優(yōu)先于任何詞典或外來定義。除非上下文另外需要，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語也應(yīng)包括單數(shù)。除非另外指示，否則應(yīng)理解為根據(jù)本申請所用的以下術(shù)語具有以下含義:
本文所用的術(shù)語“預(yù)防”表示延緩易患病個體的癥狀的起始或降低病癥的發(fā)生。本文所用的術(shù)語“治療”表示減少和/或改善患病個體的癥狀。本文所用的術(shù)語“個體”表示動物，特別是哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，“個體”是指人類。本文所用的術(shù)語“治療有效量”表示活性成分單獨或與其它治療/藥物合并使用時的用量，該用量足以顯示治療功效。本文所用的術(shù)語“載體”或“藥學(xué)上可接受的載體”是指稀釋劑、賦形劑、接受體或類似物，其為藥物組合物制備技術(shù)領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員所熟知。制備方法根據(jù)本發(fā)明，制備豐年蝦卵提取物的方法可包含下列步驟:a)提供豐年蝦卵；b)逆境處理所述豐年蝦卵；和c)均質(zhì)化步驟b)的豐年蝦卵。本文所用的術(shù)語“豐年奸卵”是指Artemia Salina或Brine Shrimp的卵，豐年蟲下亦稱鹵蟲、海猴子、鹽水蝦、鹽蟲子、水馬騮，屬無背甲目鹵蟲科鹵蟲屬。根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵的收集方法、取得期間和取得條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并無特殊限制。根據(jù)本發(fā)明，將收集而得的豐年蝦卵經(jīng)受逆境，在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述逆境是鹽逆境、UV逆境、熱逆境和酸逆境。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述鹽逆境是用約2 %至約5 %的鹽水處理約6至約12小時；優(yōu)選用約3%之鹽水處理約12小時。所述鹽優(yōu)選是氯化鈉、氯化鎂或氯化鉀。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述UV逆境是用UV照射約12至約24小時，且照射強(qiáng)度為約6000至約lOOOOmW/cm2 ;優(yōu)選照射約18小時。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述熱逆境是于約95°C至約105°C處理約3至約7分鐘；優(yōu)選于約100°C煮沸約5分鐘。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述酸逆境是用約IN至約4N的氫離子濃度處理約20至約40分鐘；優(yōu)選地，所述酸逆境是用約2N的氫離子濃度處理約30分鐘。所述氫離子優(yōu)選由硫酸或鹽酸提供。根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟c)均質(zhì)化步驟b)的豐年蝦卵是為取得提取物的處理步驟。優(yōu)選地，經(jīng)過步驟b)逆境處理后的豐年蝦卵首先經(jīng)過濾雜質(zhì)和清洗后，再進(jìn)行均質(zhì)化。所述過濾雜質(zhì)和清洗的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以完成的。根據(jù)本發(fā)明的均質(zhì)豐年蝦卵的方法可以是一般細(xì)胞破碎方法，例如使用細(xì)胞破碎儀或超音波震蕩儀進(jìn)行。為使均質(zhì)化可方便進(jìn)行，可先將經(jīng)逆境處理的豐年蝦卵加入水中，優(yōu)選地，是用約3至約10倍的水混合步驟b)的豐年蝦卵，以獲得豐年蝦卵水混合物；更優(yōu)選地，是用約6倍的水混合步驟b)的豐年蝦卵。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包含去除步驟c)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵的細(xì)胞碎片，并獲得澄清液。所述去除細(xì)胞碎片的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以完成的，例如使用離心或過濾方式去除。在本發(fā)明的一個具體實施例中，步驟c)包含:Cl)用約3至約10倍的水混合步驟(b)的豐年蝦卵，以獲得豐年蝦卵水混合物；c2)均質(zhì)化步驟Cl)的豐年蝦卵水混合物；和c3)去除步驟 c2)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵水混合物中的細(xì)胞碎片，并獲得澄清液；優(yōu)選地，步驟c3)通過離心去除步驟c2)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵水混合物中的細(xì)胞碎片。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選還另包含步驟d)，以濃縮所述豐年蝦卵提取物，其可以任何熟知的方法濃縮豐年蝦卵提取物，例如冷凍干燥或蒸發(fā)(J.Pharmacol.Sc1.,99:294-300,2005和J.Chromatography，932 =91-95,2001)以獲得經(jīng)過濃縮的豐年蝦卵提取物，并可選擇地加入賦形劑，例如與甲基纖維素共同冷凍干燥。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，所述經(jīng)過處理的豐年蝦卵經(jīng)過過濾以去除處理過程所添加的溶劑，所述過濾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實施的。例如使用一般濾紙過濾，在過濾后用水清洗，再用約3至約10倍量的含蛋白酶抑制劑的水混合后打碎細(xì)胞；優(yōu)選用約6倍量的含蛋白酶抑制劑的水混合后打碎細(xì)胞，然后于4°C 4500rpm離心20分鐘取其上清液，經(jīng)過濾、濃縮、冷凍干燥，保存于_20°C冰柜中備用。提取物本發(fā)明提供一種豐年蝦卵提取物，其根據(jù)上述得方法制得。在本發(fā)明的具體實施例中，將提取物進(jìn)行高壓液相色譜法，使用的色譜柱為LiChroCART 250-4HPLC-Cartridge NH2,5 μ m,柱溫箱溫度為 25°C，進(jìn)樣體積為 10 μ L，流速為1.0mL/min，運行時間為30min，流動相為CH3CN: H2O = 4: 1(體積比)，根據(jù)本發(fā)明的提取物在保留時間為2.43至2.45,3.12至3.15,4.59至4.61,5.05和5.57至5.63分鐘處具有吸收峰。在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選實施例中，將豐年蝦卵用鹽逆境處理，并根據(jù)上述制備方法制得提取物，所述提取物經(jīng)上述條件分析得高壓液相色譜圖如圖1所示，其在保留時間為1.92,2.45,3.12,4.59,5.05和5.57分鐘處具有吸收峰。在本發(fā)明的另一個具體的優(yōu)選實施例中，將豐年蝦卵用UV逆境處理，并根據(jù)上述制備方法制得提取物，所述提取物經(jīng)上述條件分析的高壓液相色譜圖如圖2所示，其在保留時間為1.92,2.45,3.12,4.59,5.05和5.57分鐘處具有吸收峰。在本發(fā)明的另一個具體的優(yōu)選實施例中，將豐年蝦卵用熱逆境處理，并根據(jù)上述制備方法制得提取物，所述提取物經(jīng)上述條件分析的高壓液相色譜圖如圖3所示，其在保留時間為1.92,2.43,3.15,4.61,5.05和5.60分鐘處具有吸收峰。在本發(fā)明的另一個具體的優(yōu)選實施例中，將豐年蝦卵用酸逆境處理，并根據(jù)上述制備方法制得提取物，所述提取物經(jīng)上述條件分析的高壓液相色譜圖如圖4所示，其在保留時間為2.45,3.12,3.63,4.61,5.05和5.63分鐘處具有吸收峰。組合物本發(fā)明提供一種包含治療有效量的本發(fā)明豐年蝦卵提取物的組合物。本發(fā)明組合物可作為食品組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物。本發(fā)明組合物可通過任何適當(dāng)途徑施用于個體，例如口服施用。本發(fā)明組合物的適當(dāng)?shù)膭┬桶ǎ幌抻阱V劑、喉片、硬式或軟式膠囊、水性或油性懸浮液、乳劑、可分散粉末或顆粒、糖衆(zhòng)或酏劑。如需要，可將所述組合物滅菌或與任何藥學(xué)上可接受的載體，例如穩(wěn)定劑、濕潤劑等混合。本發(fā)明組合物可通過任何熟知的方法與熟知的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。因此，用于口服的本發(fā)明組合物可包含，例如一或多種著色劑、甜味劑、增味劑和/或防腐劑。本發(fā)明組合物可 與其它一或多種目前正在使用的藥物聯(lián)用，以治療與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病。根據(jù)本發(fā)明的化妝品組合物優(yōu)選保存于水性液態(tài)介質(zhì)中。本質(zhì)上，水相可包括水；其還可包含水和與水互溶溶劑的混合物(在25°C為大于50重量％的水互溶力)，例如含I至5個碳原子的低碳一元醇，如乙醇或異丙醇，含2至8個碳原子的二元醇，如丙二醇、乙二醇、1，3- 丁二醇、或二丙二醇，C3-C4酮與C2-C4醛，和甘油。所述水性組合物可作為皮膚爽膚劑、濕潤劑或保濕劑，以對暴露于環(huán)境因素或病理情況中或受損的皮膚發(fā)揮促進(jìn)皮膚屏蔽修補(bǔ)和回復(fù)正常皮膚屏蔽的功能。可選擇地，本發(fā)明的化妝品組合物還可以是乳液或乳霜組合物的形式。其可包含乳化表面活性劑，可選自陰離子和非離子表面活性劑。對于表面活性劑的性質(zhì)和功能(乳化)，可參考文件“Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer，，，第 22 卷，第333-432頁，第3版，1979，Wiley ;對于陰離子和非離子表面活性劑，特別地，可參考數(shù)據(jù)的第 347-377 頁。優(yōu)選用于本發(fā)明組合物的表面活性劑選自:非離子界面活性劑:脂肪酸，脂肪醇，聚乙氧化或聚乙二醇化脂肪醇，如聚乙氧化硬脂醇或鯨蠟基硬脂醇，蔗糖的脂肪酸酯，烷基葡萄糖酯，特別是C1-C6烷基葡萄糖的聚氧亞乙基化脂肪酸酯，及其混合物；陰離子界面活性劑:經(jīng)胺、氨水或堿鹽中和的C16-C3tl脂肪酸，及其混合物。優(yōu)選使用可得到水包油或水包蠟乳液的表面活性劑。可選擇地，本發(fā)明的組合物是水性凝膠或水凝膠組合物的形式。水凝膠組合物包含增稠劑以使液態(tài)溶液增稠。增稠劑的實例包括但不限于碳合物、纖維素為主的材料、膠、海藻素、瓜爾膠、果膠、鹿角菜苷、明膠、礦物性或經(jīng)變性的礦物性增稠劑、聚乙二醇與多醇、聚丙烯酰胺和其它的聚合增稠劑。優(yōu)選使用對組合物賦與穩(wěn)定性和最適流動特性的增稠劑。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含有效量的生理上可接受的抗氧化劑、天然或變性氨基酸、天然或變性固醇化合物、天然或變性膠蛋白、絲蛋白或大豆蛋白。本發(fā)明的組合物優(yōu)選制備成應(yīng)用于局部，如皮膚、毛發(fā)、睫毛、或指甲的角蛋白材料。其可以是正常用于此類應(yīng)用的任何表現(xiàn)形式，特別是水性或油性溶液、水包油或油包水乳液、聚硅氧乳液、微乳液或納米乳液、水性或油性凝膠或液體、漿狀或固態(tài)水合產(chǎn)物的形式。本發(fā)明通常可以是流體且可具有白色或有色乳霜、軟膏、乳汁、洗劑、漿液、漿料、慕斯或凝膠的外觀。其可選擇地以氣溶膠、貼片或粉末的形式局部地應(yīng)用于皮膚上。其也可以是固態(tài)形式，例如棒狀形式。其可作為皮膚用保養(yǎng)產(chǎn)品和/或化妝產(chǎn)品使用。或者，其可制備成洗發(fā)精或護(hù)發(fā)素。在已知方式中，本發(fā)明的組合物也可包含化妝品常用得添加劑和佐劑，如親水性或親脂性膠凝劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、顏料、臭味吸收劑和染料。本發(fā)明化妝品組合物可包含脂肪物質(zhì)，例如油，而且特別是礦物油(液態(tài)石油膠)、植物來源油(酪梨油、月見草油、紅花油、大豆油、小麥胚芽油、杏仁核油)、動物來源油(羊毛脂)、合成油(全氫鯊烯)、聚硅氧油(環(huán)甲硅脂)和氟油(全氟多醚)。脂肪醇(如鯨蠟醇)、脂肪酸、蠟和膠，特別是聚硅氧膠，也是代表性的脂肪物質(zhì)。

本發(fā)明化妝品組合物可包含乳化劑和共乳化劑，其包括聚乙二醇的脂肪酸酯，如PEG-100硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯與PEG-40硬脂酸酯；多元醇之脂肪酸酯，如硬脂酸乙二醇酯、葡萄糖醇三硬脂酸酯與氧亞乙基化葡萄糖醇硬脂酸酯，例如市售的商標(biāo)名Tween 20或Tween 60 ;及其混合物。本發(fā)明化妝品組合物可包含親水性膠凝劑，特別地，其包括羧基乙烯基聚合物(碳合物)、丙烯酸共聚物(如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯酰胺、多糖、天然膠和黏土。特別地，親脂性膠凝劑的實例包括變性黏土(例如膨潤土)、脂肪酸的金屬鹽和疏水性硅膠。根據(jù)本發(fā)明的化妝品組合物特別適合局部應(yīng)用于角質(zhì)素基質(zhì)/材料，如皮膚、角質(zhì)素纖維(頭發(fā)與睫毛)和指甲。用途本發(fā)明提供一種根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵提取物在預(yù)防和/或治療與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常中的用途。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例中，與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常包括:如老化、皮膚粗糙、皮膚或毛發(fā)色素沉淀癥、皮膚干燥、高皮脂溢、高皮脂溢相關(guān)缺陷、敏感性皮膚、頭皮屑、自然掉發(fā)、禿頭、異常痤瘡、黑頭粉刺或多態(tài)、老年粉刺、日光和醫(yī)藥或?qū)I(yè)粉刺、玫瑰斑、大規(guī)模和/或嚴(yán)重形式的牛皮癬、魚鱗病與類魚鱗病狀態(tài)、毛囊角化病、手掌角化病、白化病與類白化病狀態(tài)、扁平苔癬、所有良性或惡性皮膚增生、大規(guī)?；驀?yán)重類風(fēng)濕性牛皮癬、瘙癢；紅斑、特異性皮炎、接觸性皮炎、接觸性濕疹、扁平苔癬、癢疹、蕁麻疹、癢疹毒性皮炎和角化過度。
本文所用的術(shù)語“老化”是指皺紋與細(xì)紋、失去皮膚的緊實和/或彈性、皮膚萎縮、存在擴(kuò)大毛細(xì)孔的較不規(guī)則皮膚粒、失去皮膚光彩和/或色素沉淀痕跡。本文所用的術(shù)語“敏感性皮膚”的癥狀通常包括皮膚區(qū)域經(jīng)歷的疼痛感，如螫痛、刺痛、癢或癬癢、燒痛、發(fā)紅、熱痛、不適、緊繃等。本發(fā)明提供一種豐年蝦卵提取物在預(yù)防和/或治療與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病中的用途。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例中，與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病包括:如發(fā)炎、敗血性休克、出血性休克、創(chuàng)傷性休克、過敏性休克、毒性休克癥候群、低血容量性休克、缺血、腦缺血、細(xì)胞素給藥、細(xì)胞素過度表現(xiàn)、潰瘍、炎癥性腸疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏癥(Crohn; s disease))、糖尿病、代謝癥候群、糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性潰瘍、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氣喘、阿爾茨海默癥、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、硬變、異體移植排斥作用、腦脊髓炎、腦膜炎、胰炎、腹膜炎、脈管炎、淋巴球性脈絡(luò)叢腦膜炎、絲球體性腎炎、葡萄膜炎、回腸炎、發(fā)炎(如肝發(fā)炎、腎發(fā)炎等)、灼傷、感染(包含細(xì)菌、病毒、真菌和寄生性感染)、流感、上呼吸道感染有關(guān)的呼吸道發(fā)炎、血液透析、慢性疲勞癥候群、中風(fēng)、癌癥(如乳癌、黑色素細(xì)胞瘤、實體瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等)、心肺旁通、缺血性再灌注損傷、血栓性或出血性中風(fēng)、蛛網(wǎng)膜下出血、腦血管痙攣、心肌梗塞、休克、胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、成人呼吸痛苦癥候群、惡病質(zhì)、心肌炎、自身免疫失調(diào)、濕疹、牛皮癬、心臟衰竭、心臟疾病、動脈硬化、心肌梗塞、急性冠狀動脈癥候群、血管手術(shù)后再狹窄、高血壓和血管炎、皮膚炎、異位性皮炎、痤瘡、蕁麻疹、全身性紅斑性狼瘡、AIDS、AIDS癡呆、慢性神經(jīng)退化性疾病、慢性疼痛、異常勃起、囊腫纖維變性、肌萎縮性側(cè)索硬化、ALS和肌肉萎縮癥、肌張力障礙、重癥肌無力(M.G.)、精神分裂癥、抑郁、行經(jīng)前癥候群、焦慮、成癮(如藥物、酒精和尼古丁依賴)、嗎啡引起的耐受性和戒斷癥狀、雙極性病癥、創(chuàng)傷后壓力癥、神經(jīng)性厭食、ADHD和泛自閉癥障礙、偏頭痛、 炎癥性疼痛和神經(jīng)痛、亨廷頓氏病、癲癇、神經(jīng)退化失調(diào)、胃腸能動性失調(diào)、肥胖癥、攝食過度、實心腫瘤(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤)、瘧疾、血癌、脊髓纖維變性、肺損傷、移植對宿主疾病、頭損傷、CNS創(chuàng)傷、肝炎、腎衰竭、胰腺炎、肝疾病(如慢性肝炎C)、藥物誘發(fā)的肺損傷(如Paraquat)、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、視網(wǎng)膜炎、聽力喪失、耳鳴、哮喘、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫癥候群、囊腫性纖維化、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、硬骨和軟骨的其它退化性病狀、急性或慢性移植失敗或排斥反應(yīng)和移植抗宿主疾病、與癌癥療法(包括放射療法或化學(xué)療法)有關(guān)的黏膜炎、重度燒傷、血小板凝集不足、體內(nèi)平衡過程失調(diào)、組織損傷等。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例中，用豐年蝦卵提取物處理巨噬細(xì)胞，可明顯減少因脂多糖誘發(fā)的一氧化氮產(chǎn)生且呈劑量依賴效應(yīng)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病是發(fā)炎；更優(yōu)選地，其是皮膚發(fā)炎。發(fā)炎與許多細(xì)胞激素相關(guān)，其中白介素-6(InterleUkin-6，IL-6)主要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞所分泌，可刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的增生分化和急性蛋白質(zhì)的增加，為感染時早期炎癥反應(yīng)(acute phase reaction)的重要細(xì)胞激素。在本發(fā)明更優(yōu)選的一個具體實施例中，用豐年蝦卵提取物處理巨噬細(xì)胞，IL-6的產(chǎn)生量也被豐年蝦卵提取物所抑制，特別是可抑制IL-6的生成達(dá)38%。并且所述豐年蝦卵提取物對促炎癥細(xì)胞激素的影響并非由細(xì)胞毒性所致。因此根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵提取物可有效增加吞噬活力，并降低炎癥激素的釋出，可增強(qiáng)免疫并能抑制發(fā)炎。根據(jù)本發(fā)明的豐年蝦卵提取物是可行的治療藥劑，其對正常細(xì)胞并不造成毒性，在本發(fā)明優(yōu)選的一個具體實施例中，用豐年蝦卵提取物和未添加提取物組處理正常皮膚纖維母細(xì)胞，豐年蝦卵提取物處理組相較于未添加提取物組有較高的細(xì)胞貼附和存活比例，可知豐年蝦卵提取物具有保護(hù)正常細(xì)胞生長的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以無困難地選擇適當(dāng)?shù)氖┯猛緩胶蛣┝恳赃M(jìn)行治療。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的途徑是口服施用。劑量則根據(jù)疾病的本質(zhì)及其狀況、個體的年齡和健康狀況、施用途徑和前處理等情形而定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解劑量會隨著個體的年齡、體重、健康狀況和其它相關(guān)因素而變化。以下的非限制性實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。所述實施例不應(yīng)視為過度地限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明的精神或范疇的情況下對本文所討論的實施例進(jìn)行修改和變化，而仍屬于本發(fā)明的范圍。


圖1顯示了實施例1中第2組提取物進(jìn)行的室溫高壓液相色譜圖。圖2顯示了實施例1中第3組提取物進(jìn)行的室溫高壓液相色譜圖。圖3顯示了實施例1中第4組提取物進(jìn)行的室溫高壓液相色譜圖。圖4顯示了實施例1中第5組提取物進(jìn)行的室溫高壓液相色譜圖。

圖5a顯示了用未添加提取物處理的正常皮膚纖維母細(xì)胞在顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。圖5b顯示了用實施例1中第2組提取物(lmg/mL)處理的正常皮膚纖維母細(xì)胞在顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。圖5c顯示了用未添加提取物處理的正常皮膚纖維母細(xì)胞在顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。圖5d顯示了用實施例1中第2組提取物(2mg/mL)處理的正常皮膚纖維母細(xì)胞在顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。圖6顯示了用實施例1中各組提取物、海藻糖或未添加提取物處理巨噬細(xì)胞后，經(jīng)脂多糖誘發(fā)的一氧化氮生成量分析結(jié)果圖。圖7顯示了用實施例1中第2組提取物或未添加提取物處理巨噬細(xì)胞后，經(jīng)脂多糖誘發(fā)的IL-6生成量分析結(jié)果圖。圖8顯示了用實施例1中第2組提取物或未添加提取物處理巨噬細(xì)胞后，經(jīng)脂多糖誘發(fā)的MTT細(xì)胞增殖分析結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1、豐年蝦卵提取物的制備本實施例分別提供五組提取物:第I組:未經(jīng)過處理的豐年蝦卵第2組:將豐年蝦卵置于3%鹽水中6小時
第3組:將豐年蝦卵在UV下照射18小時第4組:將豐年蝦卵于100°C煮沸10分鐘第5組:將豐年蝦卵在2N H2SO4中靜置30分鐘每組秤取5g，分別 處理后過濾并以純水清洗，分別用6倍量的含1: 1000蛋白酶抑制劑的水混合，并用細(xì)胞破碎儀(Planetary micro mill machine)于500rpm處理5分鐘，打碎，并于4°C 4500rpm離心20分鐘，提取液經(jīng)過濾、濃縮、冷凍干燥，保存于-20°C冰柜中備用。實施例2、豐年蝦卵提取物對正常皮膚纖維母細(xì)胞的存活率分析本實施例所使用的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7和NIH 3T3正常皮膚纖維母細(xì)胞購自新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所，細(xì)胞生長在內(nèi)含10%胎牛血清和ImM丙酮酸鈉的DMEM(Dulbecco' s modified Eagles medium)的細(xì)胞培養(yǎng)液中。將上述細(xì)胞置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將6X104的NIH 3T3正常皮膚纖維母細(xì)胞接種于六孔盤中，并培養(yǎng)過夜，再用I至2mg/ml的如實施例1中第2組，或未添加提取物處理5天，于顯微鏡下照相(IOX)，其結(jié)果如圖5a至圖5d所示。在缺乏CO2的狀態(tài)之下，豐年蝦卵提取物處理組細(xì)胞型態(tài)和未添加提取物組有些微的變化，第2組的樹突狀的細(xì)胞形成較少，且呈現(xiàn)圓型狀的細(xì)胞居多；但用豐年蝦卵提取物處理后有較高的細(xì)胞貼附、平鋪的比例，并且有較多的樹狀突觸產(chǎn)生。纖維母細(xì)胞的附著與伸展對于細(xì)胞增生是必要的，在穩(wěn)定狀態(tài)下的纖維母細(xì)胞會長出絲狀偽足、細(xì)胞質(zhì)呈網(wǎng)狀、平鋪的型態(tài)以及成長的數(shù)目明顯地增加。因此加入豐年蝦卵提取物的細(xì)胞持續(xù)且穩(wěn)定地生長，在嚴(yán)苛環(huán)境之下添加豐年蝦卵提取物具有保護(hù)正常細(xì)胞的作用。將6X104的NIH 3T3正常皮膚纖維母細(xì)胞接種于六孔盤中，并培養(yǎng)過夜，再用I至2mg/ml的如實施例1中第2組，或未添加提取物處理5天。去除澄清液的培養(yǎng)盤中每孔加入300 μ L的2%結(jié)晶紫，并于室溫染色15分鐘，接著用流動的自來水清洗以去除死細(xì)胞，并干燥3小時。再用ImL的30%醋酸溶解，并于OD 580nm下用ELISA儀讀取，并計算細(xì)胞存活率。其結(jié)果如表I所示。表1:
權(quán)利要求
1.種制備豐年蝦卵提取物的方法，其包含下列步驟: a)提供豐年蝦卵； b)逆境處理所述豐年蝦卵；和 c)均質(zhì)化步驟b)的豐年奸卵。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的制備豐年蝦卵提取物的方法，其中步驟b)的逆境選自由鹽逆境、UV逆境、熱逆境和酸逆境組成的群。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的制備豐年蝦卵提取物的方法，其還包含去除步驟c)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵的細(xì)胞碎片，并獲得澄清液。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的制備豐年蝦卵提取物的方法，其中步驟c)包含: Cl)用約3至約10倍的水混合步驟b)的豐年蝦卵，以獲得豐年蝦卵水混合物； c2)均質(zhì)化步驟cl)的豐年奸卵水混合物；和 c3)去除步驟c2)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵水混合物中的細(xì)胞碎片，并獲得澄清液。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的制備豐年蝦卵提取物的方法，其中步驟c3)通過離心去除步驟c2)所得的均質(zhì)化豐年蝦卵水混合物中的細(xì)胞碎片。
6.種豐年蝦卵提取物，其根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制得。
7.據(jù)權(quán)利要求6所述的豐年蝦卵提取物，其進(jìn)行高壓液相色譜法，使用的色譜柱為LiChroCART 250-4HPLC-Cartridge NH2,5 μ m,柱溫箱溫度為 25°C，進(jìn)樣體積為 10 μ L，流速為1.0mL/min，運行時間為30min，流動相為CH3CN: H2O = 4:1體積比，保留時間為2.43 至 2.45,3.12 至 3.15,4.59 至 4.61,5.05 和 5.57 至 5.63 分鐘處具有吸收峰。
8.種組合物，其包含治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的豐年蝦卵提取物和可選擇的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其是食品組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物。
10.種根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的豐年蝦卵提取物的用途，其用于制備預(yù)防和/或治療與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常的藥物。
11.種根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的豐年蝦卵提取物的用途，其用于制備預(yù)防和/或治療與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及豐年蝦卵提取物、其制備方法及其用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明中所述豐年蝦卵提取物在治療和/或預(yù)防與發(fā)炎相關(guān)的皮膚異常和與一氧化氮過量生成相關(guān)的疾病中的用途。
文檔編號A61P17/00GK103083361SQ20111033279
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者蘇倩雯, 陳世輝, 蕭述文, 周德清 申請人:臺鹽實業(yè)股份有限公司