專利名稱：一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法。
背景技術(shù)：
豬博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV)是一種無包膜的單鏈DNA病毒,歸屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬。2005年，Allander首次從患呼吸道感染的嬰幼兒中分離得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地紛紛在呼吸道，血液，糞便，尿液等處發(fā)現(xiàn)博卡病毒。有呼吸道病癥的患者感染博卡病毒的幾率明顯比正常人高。 2009年，在瑞典豬群中偶然發(fā)現(xiàn)豬群中存在PBoV，2010年我國豬群中也檢測到PBoV。在臨床上博卡病毒主要導(dǎo)致人、牛、豬等動(dòng)物的下呼吸道感染和腹灣。而豬Kobu病毒(Porcine Kokuvirus)為小RNA病毒科成員，不同種屬動(dòng)物體內(nèi)檢測的Kobu病毒存在著差異，這類病毒是胃腸炎疾病的主要病原之一，弓丨起幼齡動(dòng)物(豬、牛、人少數(shù))高發(fā)病率和高死亡率，成年動(dòng)物死亡率較低，但感染率同樣很高，主要癥狀和傳胃流腹極為相似。自2010年4月至今，韓國、泰國；我國的廣東、福建、廣西、江西、湖北、河北和山東規(guī)模化豬場的仔豬陸續(xù)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉哺乳仔豬多在出生后2-3天發(fā)生嘔吐，隨后發(fā)生劇烈腹瀉，死亡率較高，有的地區(qū)出現(xiàn)腹瀉后死亡率達(dá)到100%。而母豬和育肥豬無明顯癥狀。按照流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒感染時(shí)的處理措施，基本無顯著效果。臨床解剖主要癥狀為胃腸道的嚴(yán)重出血。對嚴(yán)重腹瀉仔豬采集的樣本分析發(fā)現(xiàn)，流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒檢測陽性率較低，陽性率不足5%,而豬博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)和Kobu病毒檢測陽性率達(dá)到86. 6%。由此可見，PBoV和Kobu病毒是這次仔豬腹瀉的罪魁禍?zhǔn)?。但到目前為止，由于對該兩種病毒的認(rèn)識還不夠深入，尚無有效的疫苗和防治措施，因此研制抗PBoV和Kobu病毒藥物迫在眉睫。目前，卵黃抗體已經(jīng)廣泛運(yùn)用于雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動(dòng)物疾病的緊急治療和預(yù)防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，制備簡單，容易提取，可以高效特異的對病毒性/細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療；而且雞大規(guī)模工業(yè)化飼養(yǎng)成本低，經(jīng)濟(jì)方便。同時(shí)使用卵黃抗體進(jìn)行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現(xiàn)，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物制品的開發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運(yùn)用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合癥的研究尚未有報(bào)到。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液及其制備方法，用于防治仔豬腹瀉，在降低防疫成本和耐藥性菌株產(chǎn)生的前提下，有效的提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和疫病防治效果，且不會對人產(chǎn)生食源性污染和藥物殘留。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液，以實(shí)驗(yàn)分離當(dāng)前流行的毒株為基礎(chǔ)，將分離的豬博卡病毒和豬Kobu病毒滅活后制備成二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫母雞，免疫后收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體將其制備成安全、高效的卵黃抗體注射液。上述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟I)分離當(dāng)前流行的PBoV和Kobu病毒，分別用豬腎原代細(xì)胞分離培養(yǎng)PBoV，用Vero細(xì)胞培養(yǎng)Kobu病毒，測定病毒滴度后制備成二聯(lián)滅活疫苗，制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml ；2)利用制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫非免產(chǎn)蛋母雞，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫，免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫,免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和 Kobu病毒的抗體；3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PBoV和Kobu病毒的中和抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn),合格后無菌分裝,使PBoV和Kobu病毒抗體效價(jià)不低于I : 64。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明中制備的卵黃抗體注射液為免疫球蛋白制劑，能夠特異性的中和PBoV和Kobu病毒，可用于治療臨床上由PBoV和Kobu病毒單獨(dú)感染或混合感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉；使用本發(fā)明中制備的注射液不僅可以治愈易感染上述病原的豬，同時(shí)對同群未感染上述病原的豬使用可以使其獲得被動(dòng)免疫；臨床實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品后可以顯著提高豬群生產(chǎn)性能；本發(fā)明制備成本低，見效快，本制品無毒副作用，使用后無藥物殘留，生產(chǎn)使用過程中對人畜無危害，同時(shí)使用本發(fā)明中制備的產(chǎn)品不會導(dǎo)致耐藥菌毒株的出現(xiàn)，對食品安全無潛在的危害，適宜大規(guī)模推廣。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :PboV和Kobu病毒流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測定I、PboV流行毒株的分離鑒定I)采集疑似PboV發(fā)病豬糞便，按照I : I的比例加入生理鹽水稀釋混勻后以500g的離心力低速離心10分鐘，取離心上清分別按照1000IU/ml的比例加入青霉素、鏈霉素和卡那霉素，37°C放置I小時(shí)后接種豬腎原代細(xì)胞；37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，期間每隔15分鐘搖勻一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C，5% CO2培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至5天后無細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種豬腎原代細(xì)胞細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第5代時(shí)在接種72小時(shí)后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的方法，合成一對特異性引物P1、P2。其中Pl :GGGCGAGAACATTGAAGAGGT, P2 :TTGTGAGTATGGGTATTGGTG，擴(kuò)增片段大小為 496bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取DNA，運(yùn)用PCR進(jìn)行進(jìn)行鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為PBoV陽性。2、PBoV分離毒株的TCID5tl測定將生長良好的豬腎原代細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/ml，傳代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒接種。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，然后去除病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，運(yùn)用Reed-Muench氏法計(jì)算TCID5tlt5經(jīng)計(jì)算該病毒的TCID5tl為106 25/ml。3、Kobu病毒流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測定I)采集疑似Kobu病毒發(fā)病豬糞便，按照I : I的比例加入生理鹽水稀釋混勻后·以500g的離心力低速離心10分鐘，取離心上清分別按照1000IU/ml的比例加入青霉素、鏈霉素和卡那霉素，37°C放置I小時(shí)后接種Vero細(xì)胞；37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，期間每隔15分鐘搖勻一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，370C ,5% CO2培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至5天后無細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種Vero細(xì)胞細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第3代時(shí)在接種72小時(shí)后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的方法，合成一對特異性引物P3、P4。其中P3 TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC,P4 AGTGCAAGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA,擴(kuò)增片段大小為495bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取RNA，運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為Kobu病毒陽性。4、Kobu病毒分離毒株的TCID5tl測定將生長良好的Vero細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化后按照I : 4的比例傳代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒接種。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，然后去除病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù),運(yùn)用Reed-Muench氏法計(jì)算TCID50 0經(jīng)計(jì)算該病毒的TCID5tl為IO7 2Vml實(shí)施例2滅活疫苗的制備及免疫I、菌毒滅活分別將測定好菌毒滴度的菌毒液混合，混合后制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID50不低于107/ml，混合后加入O. 2%的甲醛37°C滅活24小時(shí)，滅活檢驗(yàn)合格后備用。2、滅活疫苗制備油相制備由注射用白油94體積份，加司本_80°C 6體積份，混合后,然后加硬脂酸鋁(每100毫升混合液加入2克硬脂酸鋁)，逐漸攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取滅菌吐溫_80°C 4體積份，加入滅活病毒液96體積份，充分振搖，使吐溫-80°C完全溶解。
乳化取油相I體積份放于乳化缸內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相I體積份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其終濃度為O. 01%，得到制備卵黃抗體用滅活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母雞產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和Kobu病毒的抗體。實(shí)施例3卵黃抗體的制備和效價(jià)測定I、卵黃抗體的制備第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，·運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，力口入乳酸至PH為4.0，2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨。2、PBoV和Kobu病毒抗體的效價(jià)測定I)細(xì)胞制備分別取豬原代腎細(xì)胞和Vero，運(yùn)用胰酶消化調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5/ml,然后傳代至96孔板中，每孔0. Iml,加入至96孔板后輕微前后左右搖晃,混勻細(xì)胞使其能夠均勻貼壁。2)體外中和實(shí)驗(yàn)分別將PBoV病毒液和Kobu病毒進(jìn)行稀釋，稀釋至2000TCID5(I/ml。取制備的卵黃抗體進(jìn)行2倍倍比稀釋，取21 21°等10個(gè)稀釋度。每個(gè)稀釋度取0. 4ml卵黃抗體稀釋液分別加入等量的稀釋病毒液，37°C水浴I小時(shí)使卵黃抗體與PBoV或Kobu病毒進(jìn)行中和反應(yīng)。3)細(xì)胞接種以及中和效價(jià)測定中和反應(yīng)完畢后，將96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液去除，力口入中和反應(yīng)后的混合液，其中PBoV中和后加入到豬原代腎細(xì)胞中，Kobu病毒中和后加入到Vero細(xì)胞中，每孔O. lml，37°C吸附I小時(shí)，然后去除吸附混合液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察細(xì)胞病變孔數(shù)并記錄,然后按照Reed-Muench氏法計(jì)算中和抗體效價(jià)。3、將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn),合格后無菌分裝,使PBoV和Kobu病毒的抗體效價(jià)不低于I : 64。實(shí)施例42011年3月天津某豬場10日齡仔豬489頭，出現(xiàn)腹瀉癥狀，主要表現(xiàn)為食欲減退、并出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐等癥狀。發(fā)病率高達(dá)60 %，死亡病豬解剖主要癥狀為胃腸道嚴(yán)重出血。采集病豬腸道和排泄物進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果為Kobu病毒陽性。隨后對所有腹瀉仔豬注射本發(fā)明制備的卵黃抗體進(jìn)行治療，每頭豬注射3ml，每天I次連續(xù)3天，同時(shí)對未發(fā)病仔豬注射等劑量卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防。同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對嚴(yán)重腹瀉豬進(jìn)行補(bǔ)液，腹腔注射5%的葡萄糖氯化鈉溶液，每頭豬40ml，每天一次，另外與加強(qiáng)消毒等其它措施相結(jié)合。用卵黃抗體治療后新發(fā)病例迅速減少，輕度腹瀉豬只迅速好轉(zhuǎn)，用藥后3天無仔豬因腹瀉死亡。
權(quán)利要求
1.一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液，其特征在于在于其包括從以PBoV和Kobu病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞后收集的免疫產(chǎn)蛋母雞雞蛋的卵黃中提取的卵黃抗體。
2.權(quán)利要求I所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)分離當(dāng)前流行的PBoV和Kobu病毒，分別用豬腎原代細(xì)胞分離培養(yǎng)PBoV，用VeiO細(xì)胞培養(yǎng)Kobu病毒，測定病毒滴度后制備成二聯(lián)滅活疫苗； 2)利用制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫非免產(chǎn)蛋母雞； 3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨； 4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PBoV和Kobu病毒的中和抗體效價(jià)； 5)將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，合格后無菌分裝，使PBoV和Kobu病毒抗體效價(jià)不低于I : 64。
3.權(quán)利要求2所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟I)中制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml。
4.權(quán)利要求2或3所述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟2)中，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2月、4月分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PBoV和Kobu病毒的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，所述的卵黃抗體注射液以實(shí)驗(yàn)分離當(dāng)前流行的毒株為基礎(chǔ)，將分離的豬博卡病毒和豬Kobu病毒滅活后制備成二聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫母雞，免疫后收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體將其制備成安全、高效的卵黃抗體注射液。本發(fā)明的有益效果為制備的卵黃抗體注射液能有針對性的對豬博卡病毒和豬Kobu病毒單獨(dú)感染或混合感染病豬進(jìn)行有效的治療，同時(shí)可運(yùn)用該注射液對同舍未感染仔豬注射進(jìn)行預(yù)防；該注射液制備工藝簡單可規(guī)?；a(chǎn)并運(yùn)用于臨床。
文檔編號A61K39/395GK102908620SQ20111022329
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者李帥偉, 廖榮斌 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司