專利名稱：重組七鰓鰻鰻溶素、制備方法及在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種屬于醫(yī)藥與醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，尤其是一種可阻斷血栓形成且有效劑量低、安全范圍大、作用強(qiáng)度高、不良反應(yīng)輕以及低毒的重組七鰓鰻鰻溶素的制備方法及在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常情況下，體內(nèi)止血、凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)處于生理性平衡，保持正常血流狀態(tài)。但在一些病理情況下，如血管內(nèi)膜損傷或靜脈血流阻滯時(shí)，由于血小板活化并粘附到內(nèi)皮下組織，進(jìn)而引發(fā)一系列止血、凝血過程，最后形成了血栓。血栓的主要成分是由活化的血小板和纖維蛋白組成。因此，特異的抗活化血小板和抗纖維蛋白的藥品可以作為血栓導(dǎo)向劑。目前所研制的血小板抗體主要是針對活化血小板上兩個(gè)主要位點(diǎn)而制備的
(I； GPIIb-IIIa D GMP140.而最有效的抗血小板藥物就是GPIIb- IIIa拮抗劑，因?yàn)椴还?br>
通過什么受體，什么代謝途徑，血小板最后必須通過GPIIb- IIIa復(fù)合物的纖維蛋白原受體，才能發(fā)生“聚集”而形成血栓。目前，稱為“抗血小板藥物”的一類藥物已經(jīng)被作為治療血栓性疾病的有效手段在臨床上得到廣泛應(yīng)用，如阿斯匹林等。然而，阿司匹林抗血小板作用的特點(diǎn)是小劑量時(shí)抗血小板聚集，產(chǎn)生抗血栓作用；而大劑量時(shí)促進(jìn)血小板聚集，產(chǎn)生促進(jìn)血栓形成作用。另外，隨著阿司匹林長期應(yīng)用而帶來的“阿司匹林抵抗”亦愈來愈限制其抗血栓的臨床應(yīng)用。日本七鰓鰻(lampetra japonica)屬圓口綱(O^^xsioaaia)、七鰓鰻目、七鰓鰻科、七鰓鰻屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老的無頌脊椎動(dòng)物。其為海洋洄游性魚類，成體生活在海洋，經(jīng)常用吸盤附在其它魚體上吸食其血與肉，使被吸附的魚血流不止，日本七鰓鰻的這種獨(dú)特生活習(xí)性暗示著其口腔腺中必定具有強(qiáng)效抗凝物質(zhì)。但是，迄今為止還沒有以日本七鰓鰻口腔腺為原料，制備抗血栓藥物的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種可阻斷血栓形成且有效劑量低、安全范圍大、作用強(qiáng)度高、不良反應(yīng)輕以及低毒的重組鰻溶素蛋白、制備方法及在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種重組七鰓鰻蛋白-鰻溶素，其特征在于將七鰓鰻鰻溶素基因構(gòu)建于pET28a(+)載體，并對其在大腸桿菌中進(jìn)行了高效誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，所述鰻溶素cDNA序列351bp長，蛋白由117個(gè)氨基酸組成，cDNA及氨基酸序列如下
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tea acg ttc ate aac gga acc cag gaa gtg gat gcc att tgt cat aag48
權(quán)利要求
1.一種重組七鰓鰻鰻溶素蛋白，其特征在于是將七鰓鰻鰻溶素基因構(gòu)建于pET28a(+) 載體，并對其在大腸桿菌中進(jìn)行了高效誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，所述鰻溶素cDNA序列351bp長， 蛋白由117個(gè)氨基酸組成，cDNA及氨基酸序列如下
2.一種如權(quán)利要求1所述重組七鰓鰻鰻溶素的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行a.制備鰻溶素基因(1)取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中保存；(2)稱取0.2g七鰓鰻口腔腺，加Iml TRIzol試劑制備毒腺勻漿，4°C孵育5min ；(3)加0.2ml氯仿，蓋緊蓋后振搖15sec，然后置于冰上5min ；(4)4°C，12000xg，離心 15min ；(5)將上層水相移入另一離心管，加0.5ml異丙醇，并在冰上孵育IOmin ；(6)4°C，12000xg，離心 15min ；(7)棄上清，在沉淀中加Iml75%乙醇洗滌，旋渦混勻；(8)4°C, IOOOOxg離心5min，得到七鰓鰻蛋白鰻溶素的RNA沉淀；(9)空氣干燥后，用TE或無RNase水溶解RNA備用；b.進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得目的cDNA；RT-PCR擴(kuò)增的具體操作條件是42°C 20min,99°C 5min,5°C 5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；弓I物序列如下Pl: 5，-XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3，； P2 5' -XXaagcttctccccaacacattcactcac-3'；c.將獲取的目的cDNA與pETj8a(+)載體相連接，轉(zhuǎn)化入克隆菌Dffia后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定；具體操作如下(1)目的基因的回收目的基因的回收采用TaKafciPCR Fragment Recovery Kit進(jìn)行；(2)質(zhì)粒的提取采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行；(3)目的基因DNA片段與載體pETj8a(+)以Mfe I ^WHind III雙酶切，以T4 DNA Ligase進(jìn)行16°C過夜連接，將目的基因與pET48a (+)相連；(4)將連接產(chǎn)物CaCl2法轉(zhuǎn)化至克隆菌E.coli DH5a中；(5)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定；d.將鑒定的陽性重組子&(12法轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.c^iBL21中，進(jìn)行終濃度為lmmol/ L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)條件為30°C低溫過夜誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物為重組七鰓鰻RGD毒素蛋白，命名為鰻溶素。
3. 一種如權(quán)利要求1所述重組鰻溶素在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組七鰓鰻鰻溶素蛋白、制備方法及在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。重組鰻溶素蛋白是將七鰓鰻蛋白鰻溶素基因構(gòu)建于pET28a(+)載體，并對其在大腸桿菌中進(jìn)行了高效誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，所述鰻溶素cDNA序列351bp長，蛋白由117個(gè)氨基酸組成，可與血小板細(xì)胞膜上糖蛋白GpⅡb／Ⅲa專一性結(jié)合而競爭性拮抗纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，防止血小板活化和GPIIb/IIIa受體構(gòu)象的改變，阻斷受體與多種配體的結(jié)合，從而抑制血小板聚集的最終共同通路以阻斷血栓形成，具有顯著抗栓作用。
文檔編號A61P7/02GK102212125SQ20111010142
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者呂莉, 張艷, 李慶偉, 王繼紅 申請人:遼寧師范大學(xué)