一種聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶Ⅰ其制備方法及應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：一種聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶Ⅰ其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及重組蛋白的化學(xué)修飾技木。發(fā)明背景精氨酸酶(Arginase)是尿素循環(huán)中的ー種酶，催化精氨酸水解產(chǎn)生鳥氨酸和尿素，在機(jī)體氮代謝方面起重要作用。人體內(nèi)精氨酸酶有兩種(I型稱肝精氨酸酶，II型稱肝外精氨酸酶)，I型精氨酸酶基因的表達(dá)受底物精氨酸和輔酶Mn2+的誘導(dǎo)(Brock，A.Aetal，Dietarymanganesedeiiciencydecreasesrathepaticarginaseactivity.J.Nutr.1994,124:340-344)，存在于肝外的II型精氨酸酶有著廣泛的組織分布，在不同組織和器官中發(fā)揮不同的作用，包括參與多胺代謝、NO合成等(Russel，D.H，etal,Polyammebiogenesisintheratmammaryglandduringpregnancyandlactation.Bilchem.1972,130:71-76)，與I型精氨酸酶相比，其活力較低。精氨酸酶通過分解精氨酸對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)剝奪，對正常組織影響較小，成為抗腫瘤治療的又一選擇。目前傳統(tǒng)的放化療方法已很難滿足患者對生命質(zhì)量的要求，而氨基酸剝奪的方法給癌癥治療注入新的活力。它雖然會(huì)引起生理和代謝方面的某些不平衡，但不像傳統(tǒng)的放化療等方式向體內(nèi)引入有毒物質(zhì)，使原本就不堪ー擊的病體雪上加霜。最早發(fā)現(xiàn)精氨酸酶有抑制腫瘤作用的是Bach和Lansitksi,他們用提純的牛肝精氨酸酶處理大鼠Walker256肉瘤四天，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長減慢了31%-71%(Bachbj,LasnitzkiI.borneaspectsoftheroleofarginineandarginaseinmousecarcinoma.Enzymologia.1947,12:198-205)。精氛酸酶體外抗腫瘤活性自1960年已有報(bào)道(BachSJ,HawkinsRA,SwaineD.Asnortmethodforthepurificationofarginasefromoxliver.BiochemJ1963;89:263-5),Curtie等報(bào)道精氨酸酶自脂多糖與酵母多糖刺激后的巨噬細(xì)胞釋放，可引起中國大鼠肺細(xì)胞V79、淋巴瘤細(xì)胞L5178Y、HSN大鼠肉瘤細(xì)胞的凋亡。Storr和Burto報(bào)道用鼠和牛肝臟來源的精氨酸酶處理，當(dāng)精氨酸水平降至低于8umol/L并持續(xù)24小時(shí)的情況下淋巴肉瘤細(xì)胞的生長受到抑制。Scott和Wheatley等對精氨酸耗竭的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究(Scott等，Singleaminoaacid(,arginine)deprivationrapidandselectivedeathofculturedtransformedandmalignantcells.Br.J.Cancer83,800-810),在測試的24種腫瘤細(xì)胞中，所有細(xì)胞株在精氨酸酶作用后5天內(nèi)死亡，受試細(xì)胞株包括乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等細(xì)胞。人肝癌(Humanhepatocellularcarcinoma,HCC)細(xì)胞與人黑色素瘤細(xì)胞屬于精氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，其精氨基琥拍酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,ASS)表達(dá)缺陷，可能與ASS基因的啟動(dòng)子被甲基化因而被抑制、在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)有關(guān)(DillonBJeta_L.incidenceanddistributionofargininosuccinatesynthetasedeiiciencyinhumancancersamethodforidentifyingcancerssensitivetoargininedeprivation.Cancer2004；100:826-33)。精氨酸轉(zhuǎn)亞氨酶(argininedeiminase，ADI)在治療ASS缺陷型腫瘤方面有明確療效，但許多非ASS缺陷型HCC細(xì)胞對ADI有抵抗(ShenLJetal.Resistancetotheanti-proliferativeactivityofrecombinantargininedeiminaseincellculturecorrelateswiththeendogenousenzyme,argininosuccinatesynthetase.CancerLett2003;191:165-70)。國外文獻(xiàn)報(bào)道重組人精氨酸酶I(recombinanthumanarginaseI,rhArgI)對非ASS缺陷型HCC細(xì)胞具有明確的抑制作用，所有五株HCC細(xì)胞均對rhArgI敏感，但ADI對這些細(xì)胞無抑制作用，這些細(xì)胞均表達(dá)ASS,但不表達(dá)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ornithinetranscarbamylase,OTC),rhArgI降解精氨酸產(chǎn)生鳥氨酸，OTC將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，瓜氨酸再經(jīng)ASS與精氨基琥拍酸裂解酶(argininosuccinatelyase,ASL)轉(zhuǎn)化成精氨酸,將OTC轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞可使該細(xì)胞對rhArg產(chǎn)生抵抗(PaulNing-ManChenget,PegylatedRecombinantHumanArginase(rhArg-peg5,OOOmw)InnibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCareinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(1)309-317)(尿素循環(huán)與相關(guān)酶作用節(jié)點(diǎn)示意圖見說明書附圖I)。在一些細(xì)胞中尿素循環(huán)是不完全的(機(jī)制不清)，代謝產(chǎn)物鳥氨酸不能再進(jìn)入循環(huán)而產(chǎn)生精氨酸(PaulNing-ManChengetal,PegylatedRecombinantHumanArginase、rhArg-peg5,OOOmwノInhibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCarcinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(I)309-317)，因而與精氨酸轉(zhuǎn)亞胺酶相比，精氨酸酶是降解血循環(huán)中精氨酸的更為有力的酶；從臨床治療效果看，將Arg開發(fā)成抗腫瘤藥物的價(jià)值較ADI更大。重組人精氨酸酶I已成功在大腸桿菌中獲得表達(dá)(MasakiIΚΕΜ0Τ0etal,ExpressionofhumanliverarginaseinEschericniacoli.Biochem,J.1990,(270)697-703)，但其短的體內(nèi)循環(huán)半衰期(短于30分鐘)使得在不能進(jìn)行頻繁大劑量給藥的情況下將其用于腫瘤患者以降低血中精氨酸水平很困難。另ー種牛肝來源的精氨酸酶作為治療人類腫瘤的候選藥物一直不被看好，原因是在生理?xiàng)l件下其與底物精氨酸的親和カ較低，最適PH9.6，半衰期只有幾分鐘。自二十世紀(jì)八十年代以來，這些都被認(rèn)為是牛肝精氨酸酶的嚴(yán)重缺陷。Savoca的研究表明牛精氨酸酶對移植Taper肝癌的小鼠無抗腫瘤活性(SavocaKVetal,Cancertherapywithchemicallymoditiedenzymes.II.Thetherapeuticettectivenessofarginase,andarginasemodifiedbytnecovalentattachmentofpolyethyleneglycol,onthetaperlivertumorandtheL5178Ymurineleukemia.CancerBiochemBiophysl984,7:261-268),其他一些研究者也認(rèn)為牛精氨酸酶無抗腫瘤活性。雖然精氨酸酶的體外抑瘤作用明確，但將其用于體內(nèi)試圖通過精氨酸耗竭治療癌癥的多項(xiàng)研究并沒有取得預(yù)期的效果(Storr等Br.J.Cancer,1974，V30:50-59)，這是因?yàn)闄C(jī)體應(yīng)對氨基酸缺乏時(shí)存在體內(nèi)氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制(aminoacidhomeostaticmechanism),氨基酸匱乏時(shí)通過激活蛋白質(zhì)分解途徑將精氨酸釋放到血液中參與循環(huán)，補(bǔ)充了精氨酸酶代謝造成的精氨酸耗竭。為克服機(jī)體的這種穩(wěn)態(tài)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)有治療意義的精氨酸耗竭就需精氨酸降解酶的持續(xù)作用，因而要對其進(jìn)行修飾改性，以達(dá)到長效作用。Tepic在美國專利UP6，261，557中描述將精氨酸降解酶與蛋白質(zhì)分解抑制劑胰島素組合使用，以阻斷通過降解機(jī)體肌肉來補(bǔ)充精氨酸這一途徑，但胰島素的應(yīng)用受到患者血糖水平的限制，如果患者血糖水平不能保持在有限的正常范圍內(nèi)將導(dǎo)致危險(xiǎn)。1979年Savaca等使用2，4，6_三氯-S-三嗪(氰尿酰氯)作為偶聯(lián)劑，將牛肝臟來源的精氨酸酶與5KD的單甲氧基聚こニ醇共價(jià)連接(Savoca,K.V.等，1979,BiochimiedetBiophysicaActa578，47_53)，將精氨酸酶在小鼠的體內(nèi)半衰期由不到ー小時(shí)延長至12小時(shí)，雖然聚こニ醇修飾可以在一定程度上降低蛋白的免疫原性，牛精氨酸酶對人而言畢竟是異源蛋白；而且修飾后的分子只保留了原始酶活的65%，酶活損失較大。香港康達(dá)醫(yī)藥有限公司的PCT專利(PCT/CN2002/0006352002.9.9)，采用枯草芽孢桿菌表達(dá)帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的人精氨酸酶I，以分子量5KD的mPEG-SPA作為修飾劑，修飾位點(diǎn)是賴氨酸或N末端的氨基，修飾后產(chǎn)物分子的PEG與Arg摩爾比為10-12，是ー種結(jié)構(gòu)混合物，體內(nèi)半衰期延長至3天。這種修飾方式使Arg分子上連接數(shù)量不等的PEG分子,產(chǎn)物構(gòu)象不均一，產(chǎn)品質(zhì)量控制困難，制備エ藝過程對批間產(chǎn)物的質(zhì)量影響較大，エ藝控制困難。另ー種降解精氨酸的酶是精氨酸轉(zhuǎn)亞胺酶(ADI)，這是ー種源自支原體的酶。其長效分子是美國PhoenixPharmacologies,Inc研制的PEG修飾物，目前已進(jìn)入II期臨床石開(FrancescoIzzo等PegylatedArginineDeiminaseTreatmentofPatientsWithUnresectableHepatocellularCarcinomaResultsFromPhaseI/IIStudies.JournalofClinicalOncelogy2004(22):10，1815-1822)。研究結(jié)果表明其對某些HCC細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用，這些腫瘤細(xì)胞依賴外源性精氨酸來維持其生長，其精氨酸營養(yǎng)缺陷型的機(jī)理較復(fù)雜，根本原因是ASS基因的啟動(dòng)子被甲基化因而受到抑制。該藥用分子的缺點(diǎn)在于它是ー種支原體酶，雖然進(jìn)行了PEG修飾但其免疫原性仍是ー個(gè)問題。在其II期臨床研究中已有報(bào)道自身抗體在前5周即可檢測到，并且在以后其滴度繼續(xù)上升，這將導(dǎo)致后續(xù)治療的無效；其次ADI將精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼岷陀坞x氨基，在血氨水平高時(shí)會(huì)形成肝硬化和肝功能失代償，在ー些患者會(huì)出現(xiàn)肝性腦病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是研制出一種優(yōu)于上述幾種方案的藥用分子，使其具有體內(nèi)高比活、延長的半衰期、低免疫原性、結(jié)構(gòu)均一穩(wěn)定，并且易于進(jìn)行エ藝與質(zhì)量的控制；本發(fā)明的另一目的是提供該修飾分子在制備人類肝癌和黑色素瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下列技術(shù)實(shí)現(xiàn)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可以通過基因重組技術(shù)制備人精氨酸酶I(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270):697-703);而活化的聚こニ醇可以通過多種商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明采用單甲氧基聚こニ醇丙醛作為修飾劑，控制反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)聚こニ醇分子與重組人精氨酸酶I分子N末端氨基連接，經(jīng)分離純化后獲得的目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)均一，制備エ藝的批間可控性強(qiáng)，修飾前后比活下降幅度較小，達(dá)到增加藥用蛋白穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期、降低免疫原型、增強(qiáng)體內(nèi)藥效的目的。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)從人肝臟中獲得人精氨酸酶I的mRNA，再將人精氨酸酶I基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，篩選獲得高表達(dá)菌株，經(jīng)發(fā)酵、純化后獲得純度大于95%的重組人精氨酸酶I;選擇單甲氧基聚こニ醇丙醛作為修飾劑，控制反應(yīng)條件，對重組人精氨酸酶I的N末端氨基進(jìn)行定點(diǎn)修飾，修飾物經(jīng)凝膠排阻層析和離子交換層析后獲得結(jié)構(gòu)均一的目標(biāo)分子，體外精氨酸降解法檢測酶活在修飾后下降幅度為20-30%。聚こニ醇修飾是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的蛋白修飾技術(shù)。將活化的聚こニ醇上蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)，通過影響蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)各種性質(zhì)發(fā)生改變化學(xué)穩(wěn)定性増加、抵抗蛋白酶水解的能力提高、體內(nèi)藥效更強(qiáng)、免疫原性和毒性降低、血漿清除率降低、體內(nèi)半衰期延長等。在20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾。常用的反應(yīng)氨基酸包括賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。這些氨基酸殘基上的反應(yīng)基團(tuán)多呈親核性，其親核活性按下列順序依次遞減巰基>α氨基>ε氨基>羧基>羥基。根據(jù)化學(xué)修飾劑與蛋白質(zhì)之間反應(yīng)性質(zhì)的不同，修飾反應(yīng)主要分為?；磻?yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等類型。巰基通常存在于蛋白質(zhì)的ニ硫鍵和活性位點(diǎn)上，而羧基如果不與蛋白質(zhì)上的氨基發(fā)生分子間或分子內(nèi)中和反應(yīng)，很難活化。因此，蛋白質(zhì)或多肽分子最容易與修飾劑發(fā)生反應(yīng)的位點(diǎn)是暴露于分子表面的氨基酸殘基上的氨基，包括α氨基或ε氣基。蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基具有較高的親核反應(yīng)活性，一般不處于活性中心部位，因而成為化學(xué)修飾中最常用的被修飾基團(tuán)。主要被修飾的氨基是賴氨酸的ε氨基、α氨基和末端氨基。游離氨基在蛋白質(zhì)分子中含量較高，聚こニ醇與氨基酸的游離氨基反應(yīng)時(shí)，多為隨機(jī)修飾，常有幾個(gè)氨基被修飾，導(dǎo)致多態(tài)混合物的產(chǎn)生，即使只結(jié)合一個(gè)聚こニ醇，也可能結(jié)合在不同的氨基位點(diǎn)上，產(chǎn)生位點(diǎn)異構(gòu)體。氨基修飾最常用的修飾劑包括SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG,NHS-PEG和ALD-PEG等。由于蛋白質(zhì)只有ー個(gè)末端氨基，因此對它的修飾可以避免多態(tài)混合物和位點(diǎn)異構(gòu)體的產(chǎn)生。通過還原性烷基化作用生成一種單聚こニ醇產(chǎn)物的衍生化作用利用了賴氨酸上的ε氨基與蛋白分子N末端氨基不同的反應(yīng)性能，在控制反應(yīng)pH，有特定還原劑存在的條件下，可實(shí)現(xiàn)蛋白分子的定點(diǎn)修飾。本發(fā)明選擇的修飾劑其一端被單甲氧基封閉，另一端為活化醛基，分子量范圍5KD-40KD，最優(yōu)選分子量為20KD。此種活化PEG目前已有市售產(chǎn)品，也可按參考文獻(xiàn)進(jìn)行制備，經(jīng)質(zhì)量檢測各指標(biāo)達(dá)標(biāo)即可用于修飾。本發(fā)明選擇的反應(yīng)pH條件為4-7，該pH值可以提供賴氨酸殘基上ε氨基與N末端ct氨基間ρΚ值的差異,PEG與Arg的結(jié)合作用主要發(fā)生在Arg的N末端,其他具有反應(yīng)活性的集団如賴氨酸側(cè)鏈氨基不發(fā)生明顯的改性作用。PH值也影響反應(yīng)體系中蛋白與修飾劑的投料比，如果PH值過低，N末端α氨基的反應(yīng)活性較差，需要更多的PEG以實(shí)現(xiàn)更高的反應(yīng)率。本發(fā)明選擇的反應(yīng)pH為4-7，優(yōu)選4.5-6.0。通常反應(yīng)體系中PEG與蛋白分子的摩爾比越低，可以連接到蛋白分子上的PEG分子數(shù)越少，本發(fā)明選擇反應(yīng)時(shí)Arg與PEG的摩爾比為I:1-110，優(yōu)選I:3至I:6。對還原性烷基化作用而言，優(yōu)選還原劑能夠僅還原在還原性烷基化作用的初期步驟，可用的還原劑包括氫化鈉、氰硼氫化鈉、ニ甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷、吡啶甲硼烷，優(yōu)選還原劑為氰硼氫化鈉。本發(fā)明所用的被修飾分子為重組人精氨酸酶I，由322個(gè)氨基酸組成，理論分子量34734.94道爾頓，等電點(diǎn)7.09，肽鏈中有3個(gè)半胱氨酸，制備得到純度大于95%的重組人精氨酸酶I即可用于修飾反應(yīng)。Arg的蛋白濃度控制在2-5mg/ml,調(diào)節(jié)pH值至4-6mg/ml,加入氰硼氫化鈉至終濃度為20mM，PEG的加入量是Arg摩爾數(shù)的3_6倍，整個(gè)體系在室溫下攪拌反應(yīng)10-15小時(shí)，加入甘氨酸終止反應(yīng)。PEG修飾后的混合物其分子量差異較明顯，適宜用凝膠層析介質(zhì)進(jìn)行分離，選用SephacrylS200層析作為修飾混合物分離的第一歩,用對Arg酶活有利的pH9.8的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液作為平衡與洗脫緩沖液，經(jīng)此步操作可除去反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的Arg,使PEG-Arg得以初步純化，純度可達(dá)90%左右。此步驟的另ー個(gè)作用是對反應(yīng)混合物中未參與反應(yīng)的PEG和還原劑進(jìn)行有效去除。所用PEG是分子量為20KD的中性分子，還原劑為無機(jī)小分子物質(zhì)，它們都不與填料產(chǎn)生吸附作用；而目標(biāo)修飾物的分子量為55KD，其在S200柱層析的洗脫行為與PEG、還原劑差別較大，可一步達(dá)到PEG和還原劑的有效去除。PEG的多修飾物與單修飾物在表面電荷效應(yīng)上存在一定差異，利用這一點(diǎn)可以將S200樣品中不能被完全分離的PEG多修飾物成分有效去除，達(dá)到對樣品的精制。根據(jù)Arg在弱堿性條件下較穩(wěn)定的特點(diǎn)，選擇適用于弱堿條件的DEAE作為結(jié)合目的蛋白的固相介質(zhì)，用pH8.O的PB平衡后，以O(shè).05MNaCl洗脫多修飾組分，O.2MNaCl洗脫目的分子，經(jīng)此步驟樣品純度可達(dá)95%以上。經(jīng)以上各步獲得符合藥學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修飾蛋白原液后，即可用于半成品的配制。對于治療用途而言，本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物可以配制于無菌的生物相容的藥用載體中使用，我們研制了注射液與凍干粉針兩種劑型。液體劑型組成為(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸鹽緩沖液，0·01%吐溫80，O.IM氯化鈉，ρΗ8·O。凍干劑型組成為(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸鹽緩沖液，O.IM氯化鈉，5%甘露醇，pH8.O。配液之后經(jīng)冷凍干燥法制成凍干粉針,使用前加注射用水溶解后使用。本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物可用于人肝癌和黑色素瘤的治療，給藥頻率為每7天一次。治療中發(fā)揮效用的PEG-Arg的用量通過臨床試驗(yàn)確定，首先應(yīng)在適用的動(dòng)物模型中測定療效并確定安全有效劑量，給藥方式為肌肉內(nèi)注射。圖I尿素循環(huán)與相關(guān)酶作用節(jié)點(diǎn)示意圖部分人肝癌細(xì)胞表達(dá)尿素循環(huán)中的精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)，但不表達(dá)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)。血中PEG-Arg降解精氨酸產(chǎn)生的鳥氨酸再次進(jìn)入細(xì)胞，但由于缺乏鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)而不能通過尿素循環(huán)進(jìn)行再利用；精氨酸轉(zhuǎn)亞胺酶(ADI)降解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸，瓜氨酸進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)再轉(zhuǎn)變成精氨酸被細(xì)胞利用，因而產(chǎn)生臨床研究中部分患者對ADI的治療產(chǎn)生抵抗。相比之下，精氨酸酶(Arg)較精氨酸轉(zhuǎn)亞胺酶(ADI)對人肝癌細(xì)胞的治療譜更廣。圖2精氨酸酶對大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000,4000IU/只)重組人精氨酸酶(Arg)后，檢測血中精氨酸水平的變化，結(jié)果表明Arg只有最高劑量組(4000IU/只)可使血中精氨酸水平在注射后5小時(shí)降至20uM，隨后血中精氨酸水平逐漸回升，至注射2天后恢復(fù)到正常水平。圖3聚こニ醇精氨酸酶對大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000，4000IU/只)聚こニ醇化重組人精氨酸酶(PEG-Arg)后，檢測血中精氨酸水平的變化，結(jié)果表明PEG-Arg較低劑量組(1000IU/只)即可使血中精氨酸水平降至檢測不到的水平并可持續(xù)6天。與圖2結(jié)果相比，說明重組人精氨酸酶經(jīng)過聚こニ醇修飾達(dá)到了增強(qiáng)體內(nèi)藥效、延長體內(nèi)半衰期的目的。實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明，PEG-Arg的制備與其活性驗(yàn)證顯示在下文中，實(shí)施例更為詳盡地描述了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明，實(shí)施例中的Arg均為大腸桿菌表達(dá)的重組人精氨酸酶I。實(shí)施例I.重組人精氨酸酶I的制備PCR擴(kuò)增人I型精氨酸酶基因(hAI)，插入大腸桿菌表達(dá)載體pET30a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-hAI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)，構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAI)，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá).SDS-PAGE分析表明，誘導(dǎo)后的BL21(DE3)(pET30a-hAI)在約35kD處有明顯的蛋白表達(dá)。經(jīng)過發(fā)酵、純化后最終純度為95%以上。詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270):697-703)實(shí)施例2.修飾位點(diǎn)在ArgN末端α氨基處的PEG(20KD)-Arg的制備調(diào)節(jié)Arg的蛋白濃度至4.0mg/ml,調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值在5.2,加入氰硼氫化鈉使其終濃度為20mM，充分溶解后加入相當(dāng)于Arg摩爾數(shù)4倍量mPEG_ALD(20KD)，室溫下攪拌反應(yīng)12小吋，加入甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)中修飾效率用SDS-PAGE法檢測，反應(yīng)12小時(shí)候，SDS-PAGE結(jié)果表明70%的Arg被修飾，被修飾的組分中單修飾組分占80-90%，時(shí)間進(jìn)一步延長，修飾率不再提高。反應(yīng)終止后離心棄沉淀，上清部分直接上Sephacryl-S2citl柱，以50mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH9.8)緩沖液加0.15M氯化鈉作為洗脫液，經(jīng)此步可將未被修飾的Arg分子去除。根據(jù)電泳純度情況合并經(jīng)Sephacryl-S2tltl柱后的分部收集樣，以50mM甘氨酸-氫氧化鈉(PH9.8)緩沖液經(jīng)S印hadexG25脫鹽后，再上已用pH8.O的PB平衡過的DEAESepharoseFF柱，以0.05MNaCl洗脫多修飾組分，0.2MNaCl洗脫目的分子，經(jīng)此步驟樣品純度可達(dá)95%以上。實(shí)施例3.PEG-Arg注射液的制備經(jīng)由實(shí)施例I獲得的PEG-Arg原液用Lowry法測定蛋白濃度后，將5000mgPEG_Arg加入含有以下物質(zhì)的液體中磷酸氫ニ鈉6.78g，磷酸ニ氫鈉0.17g，0.Iml吐溫80，氯化鈉5.844g。無菌過濾后分裝入2ml的西林瓶中，姆支灌裝量lml。實(shí)施例4.注射用PEG-Arg凍干粉針的制備經(jīng)由實(shí)施例I獲得的PEG-Arg原液用Lowry法測定蛋白濃度后,將5000mgPEG_Arg加入含有以下物質(zhì)的液體中磷酸氫ニ鈉6.78g，磷酸ニ氫鈉0.17g，氯化鈉5.844g，甘露醇50g。無菌過濾后分裝入2ml的西林瓶中，經(jīng)冷凍干燥后即得。實(shí)施例5.PEG-Arg對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的抑制試驗(yàn)選用小鼠肝癌細(xì)胞MH134、小鼠纖維瘤細(xì)胞MethA、人肝癌細(xì)胞7402、7721、H印G2，人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-28進(jìn)行體外細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)。細(xì)胞濃度為I.OXIO4/孔，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基，分試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組培養(yǎng)板分別加入終濃度為O.2,0.4,0.6,0.8、I.0,1.2IU/ml的受試樣品(ADI、Arg、PEG_Arg)，于37°C、5%ニ氧化碳條件下孵育3-7天，之后每孔加入O.02mlMTS試劑,再孵育4小時(shí)，于490nm檢測光吸收值，殺死50%細(xì)胞所需的樣品比活單位被定義為IC5Q。權(quán)利要求1.一種聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其主要特征在于每個(gè)重組人精氨酸酶I分子與單ー聚こニ醇分子偶聯(lián)，并且連接位點(diǎn)是精氨酸酶I分子的N末端α氨基。2.如權(quán)利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其又ー個(gè)特征是所述聚こニ醇其一端用單甲氧基封閉，另一端帶有ー個(gè)具有反應(yīng)活性的醛基且分子量為10KD-40KD。3.如權(quán)利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其又ー個(gè)特征是所述重組人精氨酸酶I是通過基因重組技術(shù)制備的人精氨酸酶I或者具有相同活性的突變體。4.一種制備如權(quán)利要求I所述聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I的方法，其主要步驟是(1)燒基化反應(yīng)在室溫、ΡΗ4-6、有還原劑存在的條件下，將重組人精氨酸酶I與活化的聚こニ醇醛混合，重組人精氨酸酶I與聚こニ醇的投料比(摩爾比)為I:1-110，聚こニ醇的分子量為10KD-40KD，反應(yīng)10-15小時(shí)，加甘氨酸終止反應(yīng)(2)反應(yīng)混合物的分離與純化經(jīng)凝膠排阻層析去除未修飾的重組人精氨酸酶I分子與未反應(yīng)的聚こニ醇分子，再經(jīng)離子交換層析去除多修飾組分后即可獲得聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I目標(biāo)產(chǎn)物。5.ー種藥物組合物，其特征在于該組合物以權(quán)利要求I所述的分子為主要活性物質(zhì)。6.權(quán)利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I和權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備用于治療人類肝癌或黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一種聚乙二醇修飾的人精氨酸酶I。新制備的人工分子具有體內(nèi)高比活、延長的半衰期、低免疫原性、結(jié)構(gòu)均一穩(wěn)定的特點(diǎn)，并且易于進(jìn)行工藝與質(zhì)量的控制。發(fā)明還提供了目標(biāo)分子的制備方法。該種聚乙二醇修飾的人精氨酸酶I在人類腫瘤治療領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K38/50GK102690804SQ20111006755公開日2012年9月26日申請日期2011年3月21日優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日發(fā)明者吳彥卓,徐川,徐明波,楊仲璠,梁果義,王俊玲,王喜鶴,連治國申請人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司,北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司