專利名稱：一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法，屬于修復人體骨 組織支架材料的加工制作技術領域。
背景技術：
脫鈣骨基質是骨組織工程常用的生物衍生材料，它來源于骨組織，是一種自體降 解的抗原滅活的異種或同種異體骨質。1965年toist (美國科學家Marshall R. toist，骨科 基礎研究的奠基人)證實脫鈣骨具有誘導成骨作用。隨后，脫鈣骨的成骨誘導活性被大量 的試驗研究和臨床實踐所證實，脫鈣能使骨誘導蛋白得以暴露，并激活骨誘導蛋白的活力， 使異體骨產生活躍的骨誘導能力，有利于植入骨的吸收替代和新骨的形成。此外，脫鈣骨還 具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性，并且易于同周圍骨融合，支持新骨組織 的生長。脫鈣骨亦保留了天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，其結構和組成更加符合人的生理要求。然而 由于脫鈣骨固有的誘導蛋白較少，因此脫鈣骨本身的骨誘導活性是有限的。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是轉化生長因子 β 超家族成員之一，具有誘導未分化的間充質干細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向分化與增 殖的能力，促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發(fā)育及其重建過程，進而加速骨缺 損的修復。但骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的半衰期很短，因此限制了其作用的發(fā)揮。然而通過骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-2與聚合材料的結合可以延長骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的生物活性，并能控制其釋 放。目前，在支架材料中復合骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2，已被認為是組織工程可能的應用方法之
ο但目前在臨床上骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與脫鈣骨基質的附著方法一般為浸漬法和負 壓吸附法等物理固定的方法，這些方法雖然操作簡單，但是這些方法不但使骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2在脫鈣骨基質上附著量少，附著不均勻，而且附著不穩(wěn)定，達不到控制骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2的釋放量以及延長形態(tài)發(fā)生蛋白-2活性的目的，不利于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在臨床醫(yī) 學上作用的發(fā)揮。
發(fā)明內容
本發(fā)明公開了-種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法，其目的在于解決 目前骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與脫鈣骨基質固定不均勻、固定不穩(wěn)定從而達不到控制骨形態(tài)發(fā) 生蛋白-2的釋放量以及延長形態(tài)發(fā)生蛋白-2活性等問題。采用本發(fā)明一種骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2與脫鈣骨基質固定的方法，不但可以使骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2均勻穩(wěn)定的固定在脫鈣骨 基質上，而且能夠延緩骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放，同時延長了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的活性， 提高了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的利用率。一種骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法，按照如下步驟進行(1)以豬后腿骨干骺端的松質骨制備的脫鈣骨基質為對象；(2)將ΒΜΡ-2凍干粉用無菌水配制成濃度為1 μ g/ μ L的BMP-2溶液；
(3)將⑵中配置好的BMP-2溶液加載到(1)脫鈣骨基質(IcmX IcmX 3mm)上； 所BMP-2溶液的量為20 μ L0(4)在微波合成儀中，將(3)中負載了 ΒΜΡ-2的脫鈣骨基質處理30min ；(5)將(4)中固定了 BMP-2的脫鈣骨基質置于濃度為3 %的殼聚糖溶液中5min后 取出；(6)將(5)中得到的脫鈣骨基質干燥，干燥溫度為37°C。所述的微波處理條件為微波功率為500W，反應溫度為37°C。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是采用本發(fā)明一種骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定 的新方法，不但可以使骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2均勻穩(wěn)定地固定在脫鈣骨基質上，而且能夠延緩 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放，同時延長了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的活性，提高了骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2的利用率。
圖IBradford蛋白檢測法標準曲線；圖2浸漬法對BMP-2與脫鈣骨基質的固定效果；圖3負壓吸附法對BMP-2與脫鈣骨基質的固定效果；圖4微波功率對BMP-2與脫鈣骨基質的固定效果；圖5微波固定法(500W)對BMP-2與脫鈣骨基質的固定效果；圖6微波固定-殼聚糖涂膜法對BMP-2與脫鈣骨基質的固定效果。
具體實施例方式以下對浸漬法、負壓吸附法、微波固定法和微波固定-殼聚糖涂膜法四種方法，對 不同來源的脫鈣骨支架與BMP-2的固定效果作實施例，并結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細 描述，但本實施例并不用于限制本發(fā)明，凡是采用本發(fā)明的相似方法及其相似變化，均應列 入本發(fā)明的保護范圍。實施例1 浸漬固定法一、豬后腿骨干骺端的松質骨制備脫鈣骨基質，具體制備過程包括如下步驟(1)去除松質骨表面的軟骨、皮質骨及附著組織；(2)將(1)中得到的松質骨切片、沖洗；(3)將O)中得到的松質骨切割成IcmX IcmX 3mm的骨塊；(4)將(3)中得到的松質骨用Triton X_100處理48小時以脫除松質骨上的細胞；(5)將中得到的松質骨用無水乙醚處理48小時以脫除松質骨上的脂肪油脂；(6)將(5)中得到的松質骨置于0. 6mol/L鹽酸中處理12小時。(7)將(6)中得到的脫鈣松質骨用蒸餾水沖洗30min，得到脫鈣骨支架；(8)將(7)中得到的脫鈣骨支架置于無水乙醇保存。二、骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質的浸漬固定方法，具體實施步驟如下(1)利用豬后腿骨干骺端的松質骨制備出的脫鈣骨基質；(2)將BMP-2凍干粉用無菌水配制成溶液的濃度為1 μ g/ μ L的BMP-2溶液；(3)將⑵中配置好的ΒΜΡ-2溶液加載到(1)制備的脫鈣骨基質上；加載到脫鈣骨基質(IcmX IcmX 3mm)上的BMP-2溶液的量為20 μ L ；(4)將(3)中負載了 ΒΜΡ-2的脫鈣骨基質在37°C下干燥。三、骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定效果的測定A)骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定效果測定的具體過程如下將固定了骨形態(tài)蛋白-2的脫鈣骨基質放入離心管中，在離心管中加入2ml蒸餾 水。將離心管置于搖床上進行振動搖蕩，振動速度為150r/min，振動時間為1_5天，每天檢 測離心管中釋放出骨形態(tài)蛋白-2的含量，分別對浸漬固定法、負壓吸附固定法和本發(fā)明的 固定方法每天釋放骨形態(tài)蛋白-2的含量進行測定分析，以對比固定的效果。B)骨形態(tài)蛋白-2含量的測定方法采用Bradford蛋白檢測法來測定骨形態(tài)蛋白_2的含量。該方法的測定原理是基 于考馬斯亮藍，在95%的乙醇及酸性條件下，可以配成淡藍色溶液，當與蛋白質結合后，產 生藍色化合物，此反應迅速而穩(wěn)定。反應化合物在465 595nm處有最大的光吸收值，化合 物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系，因此可以通過檢測595nm的光吸收值的大 小計算蛋白的含量。具體方法如下(1) Bradford工作液的配制(見表1. 1)表1. 1 500ml的Bradford工作液的配制
權利要求
1. 一種骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法，以豬后腿骨干骺端的松質骨制備的 脫鈣骨基質為對象，將配置好的BMP-2溶液加載到脫鈣骨基質上，其特征在于按照如下步 驟進行(1)將負載了BMP-2的脫鈣骨基質放入微波合成儀，微波功率為500W，反應溫度為 37°C，處理時間30min ；(2)將(1)中固定了BMP-2的脫鈣骨基質置于濃度為3%的殼聚糖溶液中5min后取出；(3)將O)中得到的脫鈣骨基質干燥，干燥溫度為37°C。
全文摘要
一種骨形態(tài)蛋白-2與脫鈣骨基質固定的方法，以豬后腿骨干骺端制備的脫鈣骨基質為對象；將濃度為1μg/μL的BMP-2溶液加載到脫鈣骨基質上，置于微波合成儀中，在微波功率為500W，反應溫度為37℃的條件下處理30min。使BMP-2固定在脫鈣骨基質上；再將脫鈣骨基質置于3％的殼聚糖溶液中5min后取出，在37℃下干燥。采用本發(fā)明方法使BMP-2與脫鈣骨基質固定結合穩(wěn)定、固定效果好、延緩了BMP-2的釋放速度，提高了BMP-2的利用率，在醫(yī)學領域具有較高的實際應用價值。
文檔編號A61L27/54GK102133431SQ201110066829
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權日2011年3月18日
發(fā)明者任智超, 劉寶林, 周春梅, 王欣 申請人:上海理工大學