專利名稱：以大腸桿菌不耐熱腸毒素b亞單位為載體的表位遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為載體的抗原表位遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與制備方法，涉及該系統(tǒng)在B細(xì)胞表位疫苗及T細(xì)胞表位疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇(antigenic determinant),它是 T 細(xì)胞抗原受體(Tcell receptor, TCR)和 B 細(xì)胞抗原受體(B cell receptor, BCR)及抗體特異結(jié)合的基本単位。在免疫應(yīng)答中，TCR和BCR所識(shí)別的抗原表位不同，分別稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibiIitycomplex, MHC)是高度多態(tài)性的細(xì)胞表面分子,它將多肽片段遞呈給T 細(xì)胞。與MHC I類分子結(jié)合的抗原肽為8 12個(gè)氨基酸，是來(lái)自內(nèi)源性抗原經(jīng)蛋白酶降解后的產(chǎn)物。蛋白酶水解片段通過抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter associated withantigen processing, TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與新合成的MHC I類分子相結(jié)合,MHC肽復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面被CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的TCR識(shí)別。MHCII類分子結(jié)合肽長(zhǎng)度變化較大，為9 25個(gè)氨基酸，主要由外源蛋白通過溶酶體中的蛋白酶降解而來(lái)。在內(nèi)體-溶酶體中與MHC II類分子結(jié)合后，MHC肽復(fù)合體也轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，被CD4+T細(xì)胞TCR識(shí)別。據(jù)此可設(shè)計(jì)出兩大類T細(xì)胞疫苗，即與相應(yīng)的MHC I及MHCII類分子相關(guān)的⑶8+T細(xì)胞疫苗和⑶4+T細(xì)胞疫苗。⑶4+輔助性T細(xì)胞(helperTCell，Th)又分為分泌不同細(xì)胞因子卻又交叉調(diào)節(jié)的兩群，即Thl和Th2。Thl亞群主要分泌白介素_2(IL_2)、Y干擾素(IFN-Y )和腫瘤壞死因素-β (TNF-β )，Th2亞群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。據(jù)此人們可設(shè)計(jì)出誘導(dǎo)Thl或Th2應(yīng)答的疫苗抗原分子。根據(jù)機(jī)體對(duì)病原體或腫瘤的免疫應(yīng)答特點(diǎn)，可以選擇特異性Th或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位以定向誘導(dǎo)宿主的Th應(yīng)答或CTL應(yīng)答，甚至通過選擇Thl表位或Th2表位，可誘導(dǎo)機(jī)體向Thl或Th2型免疫應(yīng)答定向發(fā)展。作為理想的免疫原，抗原分子中可同時(shí)包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)出度高特異性的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，因此可賦予較廣的保護(hù)性。通過設(shè)計(jì)隱藏于抗原分子內(nèi)部的表位可增強(qiáng)抗原的免疫原性，泛DR輔助 T 細(xì)胞表位(pan-DRhelperTcell epitopes, PADRE)或通用 T 表位(universalTepitope)以高親和力與人群常見人類白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)分子結(jié)合，較少受MHC限制。雖然表位疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)，并且其研究也取得了重大的進(jìn)展，但由于缺乏天然蛋白的三維結(jié)構(gòu)，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使機(jī)體無(wú)法產(chǎn)生免疫反應(yīng)，還可能引起免疫耐受。因此提高與抗體的親和力、増加免疫原性與穩(wěn)定性是近年來(lái)表位疫苗的研究熱點(diǎn)。目前用于解決這ー問題的途徑主要有氨基酸修飾、多表位串連展示到某個(gè)載體上。選擇包含無(wú)關(guān)Th表位的蛋白分子作為載體，可以避免慢性感染者普遍存在的HLA-II類限制性耐受，誘導(dǎo)Thl類細(xì)胞因子占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。BSA，GST，匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole Imipethemocyanin, KLH)和破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid, TT)均可成為載體蛋白。通過化學(xué)偶聯(lián)或融合表達(dá)的方法將表位與蛋白載體連在一起，免疫小鼠可誘導(dǎo)特異針對(duì)肽的免疫反應(yīng)出現(xiàn)。此外，表位肽的有效性不僅取決于自身，還與不同的載體蛋白相關(guān)，良好的載體有利于加強(qiáng)表位的免疫源。大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin, LT)是ー種能導(dǎo)致人畜腹灣的毒性因子，為產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia, ETEC)產(chǎn)生的六聚體蛋白，由含240個(gè)氨基酸的A亞單位和5個(gè)具103個(gè)氨基酸的B亞單位(LTB)形成的五聚體構(gòu)成。除了很強(qiáng)的毒性以外，LT具有很強(qiáng)的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過粘膜免疫途徑使機(jī)體產(chǎn)生特異抗體，因而LT，尤其是其無(wú)毒或低毒突變體、LTB作為粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為一同源五聚體，它與廣泛存在于真核細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)受體有特異的結(jié)合能力，能誘使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且LTB無(wú)毒，因而被廣泛用于免疫佐劑。當(dāng)從細(xì)菌細(xì)胞中釋放出來(lái)以后，毒素利用其B亞單位結(jié)合于小腸上皮細(xì)胞，在那 里它與靶細(xì)胞表面上存在的神經(jīng)節(jié)苷脂GMl作用，使毒素定位于細(xì)胞膜上。在體外對(duì)LTB免疫的小鼠進(jìn)行分析后掲示LTB顯著改變淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞亞類的分布，在第四天CD8+細(xì)胞幾乎全部缺失而B細(xì)胞比例卻升高。LTB與B細(xì)胞表面GMl作用后的免疫調(diào)節(jié)作用有如下特點(diǎn)(I)多克隆的；(2)并不伴隨顯著的増殖出現(xiàn)；(3)這ー過程包含ー些重要分子的上調(diào)作用-即主要組織相容性復(fù)合物II (MHC II)，B7,⑶40，胞間粘附分子I(ICAM-I)和IL-2Ra。進(jìn)ー步研究顯示增強(qiáng)的IL_2Ra和MHC II是發(fā)生GMl-LTB相互作用后的主要結(jié)果，而其他因子則可能是因CD4+T細(xì)胞相互作用増加后而增加的。通過化學(xué)耦聯(lián)的方法將抗原表位結(jié)合于LTB后，復(fù)合結(jié)合于細(xì)胞，再通過胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等內(nèi)的代謝后，可將其攜帯的表位遞呈給MHCI。因而LTB既可以作為B細(xì)胞表位載體，也可以作為T細(xì)胞表位載體。目前有人利用化學(xué)交聯(lián)的方法在進(jìn)行相關(guān)研究。通過化學(xué)交聯(lián)，雖然能形成免疫原性強(qiáng)的復(fù)合物。但化學(xué)交聯(lián)劑價(jià)格昂貴、也不能保持復(fù)合物質(zhì)量的均一性。本發(fā)明利用LTB作為載體，通過優(yōu)化連接肽的氨基酸組成，篩選到4種適合于攜帶B細(xì)胞及T細(xì)胞抗原表位的核心短肽。這些短肽及它們的組合前后分別連接LTB及表位，在重組大腸桿菌里能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，以保持LTB完整生物學(xué)活性的五聚體方式存在，即保證每ー個(gè)LTB単體的末尾連上一段表位，通過純化得到的融合蛋白能實(shí)現(xiàn)良好的質(zhì)量控制。融合蛋白更好地實(shí)現(xiàn)載體-表位復(fù)合物的遞呈，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答及T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供能在LTB的C末端攜帶不同抗原表位，在大腸桿菌中分泌表達(dá)，能低成本地形成具有生物學(xué)活性的五聚體融合蛋白，在免疫動(dòng)物的過程中，該蛋白具有很強(qiáng)的表位遞送能力。以LTB及連接肽構(gòu)成的表位遞送系統(tǒng)將為表位疫苗的研發(fā)提供新型載體。本發(fā)明的另ー目的在于提供該遞送系統(tǒng)的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供該遞送系統(tǒng)在表位疫苗研制中的應(yīng)用。技術(shù)方案13以重組質(zhì)粒pMD18T-LT為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出LTB-Linker片段，進(jìn)而構(gòu)建 pMD18T-LTB_Linker 重組質(zhì)粒。Linker 為 Seql，Seq2，Seq3，Seq4 及它們之間的組合。14以pMD18T-LTB-Linker重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建攜帶大鼠17肽胃泌素B細(xì)胞表位EEEE (Pepl)的重組質(zhì)粒 pMD18T-LTB-Linker_P印 I。15以pMD18T-LTB-Linker重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建攜帶卵清蛋白T細(xì)胞表位SIINFEKL (Pep2)的重組質(zhì)粒 pMD 18T-LTB-Linker_P印2。16 用 NcoI 及 BamHI 雙酶切重組質(zhì)粒 pMD18T-LTB-Linker_P印I 及pMD18T-LTB-Linker-P印2，將目的片段連接至經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET22b，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2。 17 表達(dá)重組質(zhì)粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)，構(gòu)建表達(dá)重組工程菌pET22b-LTB-Linker_P印 1/E. coli BL21 (DE3)及 pET22b-LTB-Linker-P印2/E.coli BL21 (DE3)。18表達(dá)重組工程菌發(fā)酵，取其超聲破菌上清進(jìn)行純化以獲得目的蛋白LTB—Linker—PepI 及 LTB—Linker—Pep2。19LTB-Linker-PepI免疫SD大鼠，Elisa法測(cè)定抗體滴度，并檢測(cè)免疫后的大鼠對(duì)17肽胃泌素的胃酸分泌抑制作用。20LTB-Linker-Pep2 免疫 C57BL/6 小鼠，Y 干擾素(IFN- Y )Elispot 法測(cè)定其脾臟淋巴細(xì)胞中特異CD8+細(xì)胞含量。
附圖lpET22b-LTB-Linker-P印 1/E. coli BL21 (DE3)表達(dá)的 SDS-PAGE 圖I =LTB-Seql-Pepl (煮)2 =LTB-Seql-Pepl (不煮)3 LTB-Seq2-Pepl (煮)4 LTB-Seq2-Pepl (不煮)5 LTB-Seq3-Pepl (煮)6 LTB-Seq3-Pepl (不煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)11 LTB-Seq4-Pepl (煮)12 LTB-Seq4-Pepl (不煮)從圖中看出，超聲上清在煮后在12kD附近有ー濃的目的條帶(箭頭所示)，而未煮的樣品則無(wú)，表明在未煮的情況下目的蛋白主要以多聚體形式存在，煮后變?yōu)榱藚g體，與LTB的性質(zhì)吻合。附圖2pET22b-LTB-Linker-P印2/E. coli BL21 (DE3)表達(dá)的 SDS-PAGE 圖
I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮) 8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (煮)10 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)從圖中看出，超聲上清在煮后在12kD附近有ー濃的目的條帶(箭頭所示)，而未煮的樣品則無(wú)，表明在未煮的情況下目的蛋白主要以多聚體形式存在，煮后變?yōu)榱藚g體，與LTB的性質(zhì)吻合。附圖3 純化后 LTB-Linker-P印I 的 SDS-PAGEI :LTB-Seql_ (不煮)2 =LTB-Seql-Pepl (煮)M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)3 LTB-Seq2-Pepl (不煮)4 LTB-Seq2-Pepl (煮)5 LTB-Seq3-Pepl (不煮)6 :LTB_Seq3_Pepl (煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)11 LTB-Seq4-Pepl (不煮)12 LTB-Seq4-Pepl (煮)從圖看出，純化的工程菌表達(dá)的目的蛋白在未煮的情況下以五聚體的形式存在，在煮后以單體形式存在，與LTB的性質(zhì)一致。附圖4 純化后 LTB-Linker-P印2 的 SDS-PAGEM :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)
7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮)8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (煮)10 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)從圖看出，純化的工程菌表達(dá)的目的蛋白在未煮的情況下以五聚體的形式存在，在煮后以單體形式存在，與LTB的性質(zhì)一致。附圖5不同免疫組動(dòng)物的累積泌酸量由圖看出免疫LTB-Linker-P印I后，大鼠胃酸分泌量顯著減少P < 0.01。說明LTB-Linker-Pepl免疫后，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗胃泌素抗體，中和了胃泌素的泌酸作用。附圖6LTB-Linker-Pepl四次免疫大鼠后(每次100 μ g，間隔3周免疫一次)，血清稀釋至100倍時(shí)的抗體滴度。由圖看出免疫了 LTB-Linker-P印I的大鼠產(chǎn)生了特異抗G17抗體。附圖7小鼠免疫LTB-Linker-P印2后，脾淋巴細(xì)胞中⑶8+細(xì)胞的形成。由圖看出免疫了 LTB-Linker-P印2后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中抗原特異性的CD8+淋巴細(xì)胞顯著増加，表明復(fù)合物能顯著增強(qiáng)表位遞呈。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，pMD18T-LTB-Linker工程菌的構(gòu)建。以 pMD18T-LT 為模板，用 PCR 法分別構(gòu)建出 pMD18T-LTB-Seql，pMD18T-LTB_Seq2，pMD18T-LTB-Seq3, pMD18T_LTB_Seq4， pMD18T-LTB-Seq4_G， pMD18T-LTB-Seq4_Seq2，PMD18T-LTB-Seq4-Seq3重組質(zhì)粒，各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coli T0P10,酶切及測(cè)序鑒定后即構(gòu)建好 pMD18T-LTB-Linker 工程菌。Linker 因此具體為Seql, Seq2, Seq3, Seq4, Seq4_G, Seq4_Seq2 及 Seq4_Seq3。實(shí)施例2,表達(dá) LTB-Linker-Pepl 及 LTB-Linker_Pep2 工程菌的構(gòu)建。以實(shí)施例I中的pMD18T-LTB-Linker為模板，用PCR法將測(cè)試的P印I及P印2片段連于 pMD18T-LTB-Linker 之后構(gòu)建 pMD18T-LTB-Linker_P印I 及 pMD18T-LTB-Linker_Pep2重組質(zhì)粒，用內(nèi)切酶NcoI及BamHI進(jìn)行雙酶切，獲取目的片段，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET22b 連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒 pET22b-LTB-Linker-P印I 及 pET22b_LTB-Linker_P印2。LTB-Linker-Pepl 包括LTB-Seql-Pepl (LlPl)，LTB_Seq2_Pepl(L2P1)，LTB-Seq3_Pepl (L3P1)，LTB_Seq4_PepI (L4PI)，LTB-Seq4-G_PepI(L4GPI)及LTB-Seq4-Seq2-Pepl(L42P1)。LTB-Linker-Pep2 包括LTB_Seql_Pep2(L1P2)，LTB_Seq2_Pep2 (L2P2)，LTB-Seq3_Pep2 (L3P2)，LTB_Seq4_Pep2(L4P2)，LTB-Seq4-Seq2_Pep2 (L42P2)及LTB-Seq4-Seq3-Pep2(L43P2)。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)即構(gòu)建出重組工程菌pET22b-LTB-Linker-Pepl/E.coli BL21 (DE3)及 pET22b-LTB-Linker-Pep2/E.coliBL21(DE3)。
實(shí)施例3, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的表達(dá)。重組工程菌pET22b-LTB-Linker-Pepl/E. coli BL21 (DE3)及pET22b-LTB-Linker-Pep2/E. coliBL21 (DE3)分別進(jìn)行IL發(fā)酵表達(dá)，加入IPTG至終濃度為O. lmmol/L，在18°C誘導(dǎo)表達(dá)過夜。表達(dá)結(jié)果分別見附圖I及附圖2。實(shí)施例4, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的純化離心收取發(fā)酵細(xì)菌，用TF,AN(20mmo1 /T, Tris, 2mmol/L EDTA,3mmol Na3N,300mmol/LNaCl, pH 8.0)重懸，超聲破菌，離心收取上清。將上清上經(jīng)TEAN平衡的固相化半乳糖柱(Immobilised D-glactose),用TEAN復(fù)平衡,用含O. 3mmol/L半乳糖的TEAN洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。純化的LTB-Linker-P印I 及 LTB-Linker-P印2SDS-PAGE 分別見附圖 3 及附圖 4。實(shí)施例6，LTB-Linker-Pepl的免疫原性與生物活性測(cè)定(I)動(dòng)物免疫8-10周齡雌性SD大鼠皮下免疫七組(4只/組)分別用含LTB100 μ g的 200 μ L PBS (pH7. 4)，含 LTB-Linker-P印 1100 μ g 的 200 μ L PBS (ρΗ7. 4)進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫。間隔三3周免疫一次，總共免疫4次。第四次免疫后10天進(jìn)行胃泌酸實(shí)驗(yàn)。(2)急性胃瘺泌酸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24小時(shí)；戊巴比妥鈉麻醉；分離胃，結(jié)扎幽門端；胃上插入導(dǎo)管；用35°C生理鹽水洗去胃內(nèi)容物。動(dòng)物保溫半小時(shí)后尾靜脈注射50μ!7只(200yg/mL)的大鼠胃泌素(IOOng/只)；注射后結(jié)扎賁門端；收集導(dǎo)管流出的胃液，45分鐘后取胃，0. 9% NaCl溶液0. 5mL沖洗胃內(nèi)分泌物，堿滴定測(cè)定計(jì)算胃酸總量。結(jié)果見附圖5。(3)Elisa法測(cè)定特異抗體用大鼠十七肽胃泌素包被96孔板，將進(jìn)行胃泌酸實(shí)驗(yàn)當(dāng)天采集的耦聯(lián)蛋白免疫組與PBS對(duì)照組動(dòng)物血清均稀釋至100倍作一杭，山羊抗大鼠IgG-HRP作ニ抗，OPD作底物顯示，讀取492nm處光吸收值，用表位疫苗免疫組讀數(shù)減去對(duì)照組讀數(shù)作圖見附圖6。
實(shí)施例7，LTB-Linker-P印2的免疫原性與生物活性測(cè)定(I)動(dòng)物免疫6周齡雌性C57BL/6小鼠皮下免疫八組(4只/組)分別用100 μ L PBS (ρΗ7· 4)、含 LTB50 μ g 的 100 μ L PBS (ρΗ7· 4)，含 LTB-Linker-P印250 μ g 的100 μ LPBS (ρΗ7. 4)進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫。間隔2周免疫一次，總共免疫3次。(2)Elispot :最后一次免疫后10天處死動(dòng)物，無(wú)菌條件下取脾臟，研磨、過濾得到脾細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，脾淋巴細(xì)胞用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液清洗及重懸至濃度為2X107cells/mL。Elispot檢測(cè)用BD公司的Y干擾素(IFN-Y )Elispot試劑盒參照廠家指示進(jìn)行。Elispot板以用PBS稀釋到終濃度為5 μ g/ml抗鼠IFN- Y抗體在4°C包被過夜，R-10洗滌一次，然后用R-10封閉2小吋。每孔加入2. 5X IO5脾淋巴細(xì)胞，加入或不加入表位肽在37°C，5% CO2刺激16小時(shí)，用去離子水5分鐘裂解2次。用含0. 05% Tween-20的PBS洗孔三次。用含2% FCS PBS稀釋生物素化的抗IFN- Y抗體至終濃度2 μ g/ml，加入孔內(nèi)孵育2小時(shí)，用含0. 005% Tween-20的PBS洗板3次，然后用含2% FCS的PBS溶解的濃度為50mg/ml的親合素耦聯(lián)辣根過氧物酶孵育。用含0. 005% Tween-20的PBS洗板4次,PBS洗板2次,用AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole (Sigma))底物溶液孵育。底物溶液配制AEC 用ニ甲基甲醒(Dimethyl formaldehyde)溶至 10mg/ml,其后用含 0. 005% H2O2的0. IM醋酸鹽緩沖液(148ml 0. 2M醋酸和352ml 0. 2M醋酸鈉加水至IL pH 5. 0)稀釋至O. 333mg/ml。5-10分鐘后，用自來(lái)水洗板，晾干，讀取斑點(diǎn)數(shù)(SFU)。有抗原刺激組為無(wú)抗原組斑點(diǎn)數(shù)4倍以上，背景不多于100SFU/106即為陽(yáng)性。結(jié)果見附圖7。SEQUENCE LISTING〈110〉馮強(qiáng)Feng, Qiang<120>以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為載體的表位遞送系統(tǒng)<130>a<140>a<141>2011-03-05<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3<212>PRT〈213〉人工合成<400>1Gly Pro GlyI<210>2<211>4<212>PRT〈213〉人工合成<400>2Gly Ser Gly SerI<210>3<211>5<212>PRT〈213〉人工合成<400>3Gly Gly Gly Ser SerI5<210>4<211>6<212>PRT〈213〉人工合成<400>4Tyr Ala Pro Val Asp ValI權(quán)利要求
1.抗原表位遞送系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)為用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的融合蛋白，在重組大腸桿菌表達(dá)過程中，該融合蛋白連同其攜帶的抗原表位被分泌表達(dá)并形成具高免疫原性的多聚體。
2.權(quán)利要求I所述的融合蛋白為一載體與連接肽(Linker)構(gòu)成。
3.權(quán)利要求2所述的載體為大腸桿菌不耐熱腸毒素，大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位,霍亂毒素及霍亂毒素B亞單位之一。
4.權(quán)利要求2所述的載體，優(yōu)選為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)。
5.權(quán)利要求2所述的Linker為Seql,Seq2, Seq3, Seq4及它們不同形式的組合。
6.權(quán)利要求I所述的融合蛋白在大腸桿菌，酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等不同宿主的表達(dá)。
7.權(quán)利要求6中的表達(dá)宿主，優(yōu)選為大腸桿菌。
8.權(quán)利要求I所述的抗原表位遞送系統(tǒng)在制備疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗原表位遞送系統(tǒng)的的設(shè)計(jì)技術(shù)及制備純化技術(shù)，涉及該系統(tǒng)在表位疫苗研制中的應(yīng)用。本發(fā)明的特征在于將大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)與特定的連接肽通過DNA重組技術(shù)連接起來(lái)，再將相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞表位或T淋巴細(xì)胞表位連于其后。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的表位遞送系統(tǒng)攜帶B淋巴細(xì)胞表位能有效促使動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該表位的抗體；而攜帶的T淋巴細(xì)胞表位則能有效促使動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該表位的CD8淋巴細(xì)胞。這提示所發(fā)明的抗原表位遞送系統(tǒng)可在表位疫苗的研制中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)A61P39/00GK102675466SQ20111005653
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者馮強(qiáng) 申請(qǐng)人:馮強(qiáng)