两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

抗人cxcr3分子單抗及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1206103閱讀:264來源:國(guó)知局
專利名稱:抗人cxcr3分子單抗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體,具體涉及一種抗人CXCR3分子單抗。
背景技術(shù)
CXCR3是CXC趨化因子受體3,在正常生理狀態(tài)下主要表達(dá)于活化/記憶T細(xì)胞、 NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等;其配體主要有CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC,通過受體-配體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與許多生物學(xué)行為相關(guān),例如淋巴細(xì)胞遷移/歸巢、造血祖/干細(xì)胞遷移、胚胎發(fā)育及血管發(fā)生等。近年研究發(fā)現(xiàn),在一些自身免疫性疾病、移植排異及HBV、HIV感染等病人外周血淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)CXCR3,且與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān);許多惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株表面也高表達(dá)CXCR3,如黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌及肺癌等,且與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管發(fā)生有著密切的關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)研究表明,利用CXCR3拮抗劑AMG487阻斷CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可抑制CXCR3+腫瘤細(xì)胞株的遷移和增殖。體內(nèi)研究表明,采用RNA干擾技術(shù)抑制CXCR3的表達(dá)或利用CXCR3拮抗劑 AMG487阻斷CXCR3與其配體的結(jié)合,可有效抑制結(jié)腸癌、黑色素瘤等向特異性器官的轉(zhuǎn)移。如果可以成功制備得到抗人CXCR3分子單克隆抗體,不僅可以更好的研究CXCR3 分子在細(xì)胞遷移過程中的作用及機(jī)制,更可以提供一種影響腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗人CXCR3分子單克隆抗體以及能產(chǎn)生所述抗人CXCR3 分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。為達(dá)到上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種雜交瘤細(xì)胞株,所述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟
1)利用已構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)人CXCR3分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L^9-huCXCR3作為免疫原免疫BALB/c小鼠;
2)獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆從免疫合格小鼠無菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B細(xì)胞, 按常規(guī)方法,將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0株融合,然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩選方法進(jìn)行篩選,進(jìn)而獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克??;
3)應(yīng)用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學(xué)技術(shù)篩選和鑒定后,挑選出高分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案制備得到的雜交瘤細(xì)胞株,所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏日期2011年01 月M日;保藏號(hào)CGMCC No. 4550 ;分類命名分泌抗人CXCR3分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。上述技術(shù)方案中,步驟1)中穩(wěn)定表達(dá)人CXCR3分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3具有較強(qiáng)的免疫原性,并且所表達(dá)的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細(xì)胞膜表面,從而可更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。另外,由于細(xì)胞是鼠源性的成纖維細(xì)胞,細(xì)胞表面其他分子具有相對(duì)較弱的抗原性,因此用該細(xì)胞作為免疫原將會(huì)減少非特異性抗體的產(chǎn)生,為特異性雜交瘤株的獲取提供了便利。上述技術(shù)方案中,步驟1)中,制備L^9_huCXCR3細(xì)胞的方法可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)進(jìn)行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng);具體地,可以參考文獻(xiàn)邱玉華等人.人CXCR3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建、鑒定及初步功能研究.《中國(guó)免疫學(xué)雜志》2010 年第沈卷第5期387-391頁(yè)。所述L^9-huCXCR3細(xì)胞由發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保藏和提供。 采用上述雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體的方法有以下兩種
1)在體外用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,收獲培養(yǎng)上清經(jīng)免疫親和層析法分離純化所需單克隆抗體;
2)在動(dòng)物腹腔內(nèi)接種上述雜交瘤細(xì)胞,收獲動(dòng)物腹水后分離純化所需單克隆抗體。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)上述抗人CXCR3分子單克隆抗體作為生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo),在腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)上述抗人CXCR3分子單克隆抗體抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的應(yīng)用,以及上述抗人CXCR3分子單克隆抗體在制備抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步的技術(shù)方案中,本發(fā)明同時(shí)提供一種抑制腫瘤細(xì)胞抑制的藥物,所述藥物的主要成分為上述人CXCR3分子單克隆抗體。本發(fā)明同時(shí)提供一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物,所述藥物的主要成分為上述人 CXCR3分子單克隆抗體。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用,本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.間接免疫熒光分析表明,本發(fā)明所述單克隆抗體可很好的識(shí)別L9^_huCXCR3細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的CXCR3分子,并且可以用于Wfestern blot檢測(cè)。2.本發(fā)明所述單克隆抗體可阻斷CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可抑制L9^_huCXCR3細(xì)胞由IP- ο和I-TAC介導(dǎo)的定向遷移,但對(duì)Mig介導(dǎo)的遷移效應(yīng)無抑制作用;可在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCTl 16及Η ^9在ΙΡ-10介導(dǎo)下的定向遷移,并且可抑制ΙΡ-10對(duì) Colo205的促增殖效應(yīng)。


圖1為實(shí)施例中FCM鑒定SQA-6對(duì)L^9_huCXCR3細(xì)胞表面CXCR3分子的識(shí)別,其中,A :L929 ;B :L929-mock ;C :L929_huCXCR3 ;
圖2為實(shí)施例中SQA-6的Ig亞類鑒定結(jié)果; 圖3為實(shí)施例中雜交瘤細(xì)胞株SQA-6的染色體數(shù)目(1000倍); 圖4為實(shí)施例中SQA-6效價(jià)的測(cè)定;
圖5 為實(shí)施例中SQA-6與CXCR3分子結(jié)合的Western blot分析;A:L929 ; B:L929-huCXCR3 ;C:L929-mock ;
圖6為實(shí)施例中CXCR3分子在T細(xì)胞上的表達(dá),其中,A 新鮮分離的T細(xì)胞組;B =PHA組;C :PHA+IL-2 組;
圖7為實(shí)施例中FCM分析SQA-6對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株表面C)(CR3分子的識(shí)別; 圖8為實(shí)施例中SQA-6對(duì)L^9-huCXCR3遷移能力的抑制效應(yīng);注>>0. 05 ; b、
c/7<0. 01 ;
圖9為實(shí)施例中SQA-6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株遷移能力的抑制效應(yīng);注廣b~e/7<0. 05 ; 圖10為實(shí)施例中SQA-6對(duì)Colo205細(xì)胞的增值抑制效應(yīng);注:卞0· 05 ■;p<Q. 01。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一特異性分泌鼠抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的建立 1)動(dòng)物免疫收集生長(zhǎng)良好的L^9-huCXCR3細(xì)胞,用PBS洗兩遍,加入絲裂霉素溶液 (50 mg/100 mL/ΙΧΙΟ7 個(gè)細(xì)胞)混勻,置于 37°C,45 min 后,PBS 洗 3 遍,再用 0. 3 0. 4 mL 的生理鹽水重懸細(xì)胞,加入等體積的福氏完全佐劑(CFA)充分乳化,分別于BALB/c小鼠頸后部皮下多點(diǎn)及腹腔注射;并于初次免疫后第3周、第5周進(jìn)行再次免疫,將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為8X IO6細(xì)胞/只,細(xì)胞的預(yù)處理及注射部位同上,于融合前3、d,再次腹腔注射5X IO6 細(xì)胞/只,以加強(qiáng)免疫。2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的復(fù)蘇及培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇后,用含15% FCS 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待擴(kuò)增至足夠數(shù)量后,以每只小鼠IXlO7的細(xì)胞量注射到預(yù)先用 Pristane致敏十天左右的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)。Iw后,根據(jù)小鼠的生存狀態(tài)無菌抽取腹水, 將含SP2/0細(xì)胞的腹水直接加入到含15% FCS的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、 形態(tài)良好(渾圓、透亮、大小均一),且細(xì)胞活力大于95%時(shí)用于融合。融合前M 36 h用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為3 X IO5個(gè)/mL。3)其它細(xì)胞的培養(yǎng)L^9-huCXCR3細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)采用含10% FCS 的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人CXCR3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L^9_huCXCR3,并定期用kocin加壓篩選,以保持目的基因產(chǎn)物的穩(wěn)定高表達(dá),傳代時(shí)用0. 25%的胰蛋白酶消化;腫瘤細(xì)胞 HCT116,HT29,Colo205等用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),傳代時(shí)同樣用0. 25%的胰
蛋白酶消化。4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備于融合前廣2 d,取BALB/c小鼠,摘除眼球放血,自來水沖洗干凈后置于75%酒精中3 min,然后固定于解剖架上,剪開腹部皮膚,用10 mL的注射器無菌吸取;Γ4 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,從小鼠下腹部進(jìn)針,注入到小鼠腹腔內(nèi),反復(fù)抽吸后吸出細(xì)胞,置于預(yù)冷的離心管中,離心收集腹腔細(xì)胞。然后沿胸骨無菌打開小鼠胸腔,取下胸腺,置于120目的鋼絲網(wǎng)中,研磨成單細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞。將胸腺細(xì)胞與腹腔細(xì)胞混合后, 基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗2遍。用含20% FCS的HAT選擇培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度為3、X IO5個(gè)/mL,細(xì)胞懸液滴加于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 mL (相當(dāng)于3、X IO4個(gè)/孔),37°C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5)免疫小鼠脾臟細(xì)胞的制備取加強(qiáng)免疫后3、d的BALB/c小鼠,按上述方法處死后,剪開小鼠腹部皮膚,無菌打開小鼠腹腔,在左后腹部取出脾臟,經(jīng)研磨獲取單細(xì)胞懸液。用苔盼藍(lán)染色作活細(xì)胞計(jì)數(shù),洗滌2遍后將細(xì)胞重懸于20 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中備用。
6)細(xì)胞的融合及選擇性培養(yǎng)將DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含20% FCS的HAT選擇培養(yǎng)基、50%的PEG溶液置于37°C的培養(yǎng)箱中預(yù)熱。收集2 X IO7個(gè)SP2/0細(xì)胞,DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗一遍,與IX IO8個(gè)脾臟細(xì)胞混合于50 mL離心管中(SP2/0細(xì)胞與脾臟細(xì)胞的比例為 1:5),預(yù)熱的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗兩遍,1200 rpm離心8 min,盡棄上清;用手指彈擊管底, 使兩種細(xì)胞充分混勻并成糊狀。將離心管置于37°C的保溫杯中,預(yù)熱半分鐘;吸取1 mL預(yù)熱的50%的PEG溶液,將吸管輕輕插入細(xì)胞懸液底部,在1 min內(nèi)勻速加完,且邊加邊輕輕攪拌,37°C水浴中靜置90 S。再加入40 mL預(yù)熱的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,室溫靜置5 min,離心 (800 rpm, 10 min),棄上清。將細(xì)胞重懸于100 mL含20% FCS的HAT選擇培養(yǎng)基中,滴入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中,100 mL/孔,置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日觀察有無污染;3、d后半量換液,10 d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。7)陽性雜交瘤的篩選待細(xì)胞克隆布滿1/3 1/4培養(yǎng)孔時(shí),即可吸取培養(yǎng)上清用間接免疫熒光法進(jìn)行篩選。將生長(zhǎng)良好的L^9-huCXCR3細(xì)胞用PBS洗2遍后,分加于流式管中(5X IO5/管),加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清(50mL/管)于4°C反應(yīng)30 min,用含洲FCS 的PBS洗2遍,加入PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗,4°C避光反應(yīng)30 min,洗滌后用流式細(xì)胞儀分析。發(fā)現(xiàn)陽性克隆后,次日重取上清用L^9-mock細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),排除非特異性結(jié)合。8)陽性雜交瘤的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法,將免疫熒光陽性孔細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后,用HAT選擇培養(yǎng)基梯度稀釋為50個(gè)/mL和10個(gè)/mL,加稀釋后的細(xì)胞懸液于含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔板中(100 mL/孔)。使每孔平均含有5個(gè)和1個(gè)細(xì)胞,37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適時(shí)換夜,并根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)按照已建立的陽性克隆的篩選方法進(jìn)行復(fù)篩。選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞繼續(xù)做亞克隆,直至抗體分泌陽性率大于95%,擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)液氮凍存。結(jié)果通過L9^_huCXCR3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞連續(xù)免疫小鼠3次,第4次加強(qiáng)免疫后的血清抗體效價(jià)達(dá)1:1000以上,免疫效果較好。采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與同種系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,融合率約為80%,檢測(cè)率在90%以上。 將復(fù)測(cè)的陽性孔連續(xù)3次克隆化,獲得了 1株持續(xù)分泌特異性抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為SQA-6 (圖1)。該雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng),液氮凍存半年后復(fù)蘇,仍生長(zhǎng)良好,穩(wěn)定分泌抗體。實(shí)施例二 雜交瘤染色體數(shù)目分析,單克隆抗體的亞類分析。1)取生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞,加入秋水仙素,使其終濃度為0. 04、. 08 mg/mL。培養(yǎng)2 h后離心收集細(xì)胞(1000 rpm ,10 min),逐滴加入0. 5 mL 37°C預(yù)熱的75 mmol/L的 KCl溶液后,隨即再補(bǔ)加5 10 mL,用吸管輕輕吹打均勻,37°C孵育20 min。向管中加入1 mL 新鮮配制的固定液(3份甲醇加1份冰醋酸,臨用前配制),離心(1000 rpm ,10 min),棄上清。再加入纊10 mL固定液,用吸管輕輕吹打混勻,固定15 20 min,離心棄上清。再加入5 mL固定液,固定30 min,離心棄上清。再加入1. 5 mL固定液,吹打均勻。取-10°C冰凍的載玻片,滴加廣2滴細(xì)胞懸液,用新鮮Giemsa溶液(1份Giemsa溶液原液加9份0. 075 mol/ L、pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液)染色1(T20 min,流水沖洗后晾干。二甲苯透明3次,中性樹脂封片。在普通顯微鏡下選擇染色體分散良好、不重疊、無散失的標(biāo)本,于油鏡下觀察記錄并進(jìn)行顯微攝影。染色體數(shù)目分析結(jié)果顯示,雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目在100條以上,超過小鼠正常細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù),由此表明該雜交瘤細(xì)胞株為融合體(圖3)。2)快速定性試紙法鑒定單克隆抗體的類型,結(jié)果顯示經(jīng)快速定性試紙法鑒定 SQA-6的重鏈為IgGl,輕鏈為k鏈(見圖2),具體方法為將雜交瘤的培養(yǎng)上清以1 50稀釋, 取0.2 mL稀釋液加入含有亞類定性試劑的小試管中,室溫靜置1 min,待其自然溶解后輕輕混勻,將亞類定性試紙條輕輕插入管中,5 10 min后,試紙條的一面出現(xiàn)與抗體重鏈亞類名稱相對(duì)應(yīng)的藍(lán)色蛋白顯色條帶,此即該抗體所屬的小鼠Ig亞類;另一面出現(xiàn)與小鼠輕鏈型別名稱相對(duì)應(yīng)的藍(lán)色蛋白條帶,此即該抗體的輕鏈型別。實(shí)施例三單克隆抗體的制備、純化及效價(jià)測(cè)定
1)采用本室建立的小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6、周齡的雌性 BALB/c小鼠,腹腔注射Pristane 0. 5 mL/只。1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1 X IO7/只,同時(shí)另一側(cè)再次注射I^istane和福氏不完全佐劑的等體積混合物0. 2 mL/只,輕輕按摩小鼠腹部,使雜交瘤細(xì)胞分散于腹腔中。一周后,視小鼠生存狀態(tài)抽取腹水,離心去除懸浮物,分裝后于-80°C保存。采用上述方法生產(chǎn)抗體的結(jié)果為腹水形成率在95%以上,腹水的產(chǎn)量平均為3. 5 mL/ 只。2) Protein G免疫親和層析法純化IgG亞類抗體將腹水解凍,4 °C離心 (12000 rpm,20min)去除凝集塊、脂肪和纖維蛋白。腹水按1 10稀釋后,依次用0.60mm、 0.45 mm、0. 30mm、0.22mm的濾膜過濾后,上ftOtein G親和層析純化柱。收集純化的抗體,用紫外分光光度法測(cè)定抗體蛋白的濃度,其計(jì)算公式為抗體蛋白濃度(mg/mL) =OD280X 1. 55-OD260 XO. 76。產(chǎn)品無菌過濾后,分裝后于_80°C保存。采用上述方法分離純化的結(jié)果為純化所得抗體的蛋白含量在3. 5 mg/mL以上。3)采用間接免疫熒光法,將生長(zhǎng)良好的L^9_huCXCR3細(xì)胞,用含1小牛血清的 PBS洗滌后加到流式管中,1 X IO6細(xì)胞/50mL/管。將腹水純化獲得的抗體蛋白按濃度梯度稀釋后,按 lmg/test、0. 5mg/test、0. 25mg/test 及0. lmg/test 的量分加于各管,4°C反應(yīng)30 min,用含H小牛血清的PBS洗兩遍,加入PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗,于4°C避光反應(yīng)30 min。 洗滌后用FCM分析,以出現(xiàn)最大陽性率及熒光強(qiáng)度時(shí)的最少抗體用量作為抗體的效價(jià)。采用上述間接免疫熒光法分析表明SQA_6用于間接免疫熒光分析的最小用量約為 0. 25 mg/ΙΧΙΟ6 個(gè)細(xì)胞(圖 4)。實(shí)施例四單克隆抗體的特異性鑒定
收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L^9-huCXCR3和L^9-mock細(xì)胞各1 X IO7個(gè),用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍,依次加入細(xì)胞膜裂解液(RIPA) 0.5 mL和蛋白酶抑制劑(PMSF) 100 mL,充分混勻, 在冰上用1 mL注射器針筒抽吸3、次,15 min后再重復(fù)3、次,靜置15 20 min,移入1. 5 mL離心管中,12000 rpm離心10 min ;取上清液30 mL,經(jīng)12% SDS-PAGE電泳,并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用1% TBST封閉液4°C封閉過夜;次日加入純化的鼠抗人CXCR3的mAb室溫孵育1 h,用TBST洗去未結(jié)合的抗體,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,孵育30 min,洗滌后加入ECL顯色試劑,在暗室用X光片曝光數(shù)分鐘,進(jìn)行顯影后再定影。Western Blot結(jié)果顯示,SQA-6能與L^9_huCXCR3細(xì)胞裂解提取的CXCR3蛋白特異性結(jié)合,在40kD左右形成明顯的特異性條帶;而和L^9-moCk泳道則無特異性條帶出現(xiàn),表明SQA-6可以特異性識(shí)別CXCR3分子(圖5)。
實(shí)施例五單克隆抗體檢測(cè)CXCR3分子在T細(xì)胞表面的表達(dá)
無菌抽取正常人外周血(肝素抗凝)100 mL,常規(guī)Ficoll密度梯度離心分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗2遍后,用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL,37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,離心收集細(xì)胞。用含PHA 濃度為5 mg/mL的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,再用IL-2濃度為400 U/mL的RPMI1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,離心收集細(xì)胞,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗2遍。加入抗人CXCR3單克隆抗體孵育(0. 5mg/ 5X IO5細(xì)胞/50 mL) 30 min,洗滌后,加入PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育30 min, 洗滌后用FCM檢測(cè)細(xì)胞表面CXCR3分子的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)CXCR3在新鮮分離的T細(xì)胞和經(jīng) PHA活化但未用IL-2誘導(dǎo)培養(yǎng)的T細(xì)胞表面的表達(dá)。FCM結(jié)果顯示,CXCR3在新鮮分離的T淋巴細(xì)胞表面幾乎不表達(dá);在僅用5 mg/mL PHA活化3 d的T細(xì)胞表面有較高表達(dá),陽性率為63. 7% ;在經(jīng)5 mg/mL的PHA活化3 d再用400 U/mL的IL-2誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d的T細(xì)胞表面的陽性表達(dá)率達(dá)95%以上(見圖6)。實(shí)施例六CXCR3在腫瘤細(xì)胞膜表面的表達(dá)
把結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116、HI^9及SW480,以及其它腫瘤細(xì)胞82^、XG6、U266、 Raji, Daudi和XGl等分加于流式管中,5 X IO5細(xì)胞/50 mL/管,加入鼠抗人CXCR3單克隆抗體0. 5mg/10 mL/管,4°C反應(yīng)30 min,PBS洗2遍,加入PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗,4°C避光反應(yīng)30 min,洗滌后用FCM分析。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,CXCR3在結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCTl 16及Η ^9膜表面有較高表達(dá),陽性率分別為95. 1%、91. 6及90. 4% ;在SW480細(xì)胞膜表面不表達(dá)。在82沈、 XG6及U266細(xì)胞膜表面表達(dá)較低,陽性率分別為37. 7%,23. 1%及19. 8% ;在Raji, Daudi及 XGl細(xì)胞膜表面不表達(dá)(見圖7)。實(shí)施例七單克隆抗體對(duì)L9^_huCXCR3遷移能力的影響
收集L^9-huCXCR3細(xì)胞與抗人CXCR3單克隆抗體SQA-6按1 X IO6個(gè)細(xì)胞/0. 5mg mAb 的量4°C反應(yīng)30 min, PBS洗2遍,用小鼠IgG同步作陰性對(duì)照,選用8 mm孔徑的M孔 Transwell板,上孔中加入抗體孵育過的L^9_huCXCR3細(xì)胞400 mL (1 X IO5個(gè)),下孔中加入含50 ng/mL的Mig或IP-10或I-TAC的趨化液600 mL,每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。37°C、5% CO2 孵育5 h,用FCM對(duì)下室中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。(細(xì)胞遷移率)%=(遷入下室中的細(xì)胞數(shù)/加入上室中的細(xì)胞總數(shù))X 100%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,L929-huCXCR3經(jīng)SQA-6處理后,在50 ng/mL的Mig誘導(dǎo)下的遷移率為3. 35%,對(duì)照組的遷移率為3. 67%,兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(/7>0. 05); L929-huCXCR3經(jīng)SQA-6處理后,由50 ng/mL的IP-10介導(dǎo)的遷移率為4.沘%,對(duì)照組的遷移率為2. 14%,兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0. 01);L929-huCXCR3經(jīng)SQA-6處理后,由50 ng/mL 的I-TAC介導(dǎo)的遷移率為6. 49%,對(duì)照組的遷移率為2. 02%,兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(/7<0. 01)。 可見,單抗SQA-6可抑制由IP-10和I-TAC介導(dǎo)的遷移,但對(duì)Mig介導(dǎo)的遷移無抑制效應(yīng)(見圖8)。實(shí)施例八單克隆抗體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株遷移能力的影響
將表達(dá)CXCR3分子的結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116及Η ^9與抗人CXCR3分子單克隆抗體按IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. 5mg mAb的量4°C反應(yīng)30 min,PBS洗2遍,并用小鼠IgG作陰性對(duì)照。選用8 mm孔徑的M孔Transwell板,上室中分別加入抗體孵育過的三種細(xì)胞400mL (IX IO5個(gè)),下室中加入含50 ng/mL IP-10的趨化液600 mL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C、 5% CO2孵育5 h,用FCM對(duì)下室中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算遷移率。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116及HT20經(jīng)mAb SQA-6處理后, 在50 ng/mL的IP-10誘導(dǎo)下的遷移率分別為2. 28%、2. 29%及2. 28%,各自對(duì)照組的遷移率分別為3. 92%、3. 63%及3. 52%,與各自的對(duì)照組相比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(/7<0. 05)(圖9)。實(shí)施例九IP-10對(duì)Colo205的促增殖作用及單抗對(duì)增殖效應(yīng)的影響
實(shí)驗(yàn)分組抗人CXCR3 mAb組、小鼠IgG對(duì)照組和未加趨化因子組。具體方法如下用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整Colo205細(xì)胞的濃度為lX105/mL,接種于96孔板中 (IOOmL),抗人CXCR3 mAb組分別加入終濃度依次為5 mg/mLUO mg/mL、20 mg/mL的抗人 CXCR3 mAb,對(duì)照組加入小鼠IgG;30 min后加入IP-10,使其終濃度為50 ng/mL。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,37°C、5% CO2培養(yǎng)。48 h后,每孔加入20 mL的MTT溶液(5 mg/mL),再培養(yǎng)5 h,離心棄上清,加入150 mL的DMSO溶液終止反應(yīng),酶聯(lián)檢測(cè)儀570 nm處測(cè)定OD值。MTT結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明,IP-IO對(duì)Colo205細(xì)胞具有較強(qiáng)的促增值作用,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義OX0. 05)。SQA-6可以抑制IP-IO的促增值效應(yīng),并且具有濃度依賴性;抗體濃度為10 mg/mL時(shí)已具有明顯的抑制效應(yīng)(/XO. 05);抗體濃度為20 mg/mL時(shí)抑制效應(yīng)更為顯著(/7<0.01)(見圖 10)。以上實(shí)施例中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為禾Ij用SPSS17. O統(tǒng)計(jì)軟件,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株,其特征在于,所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏日期2011年01月M日;保藏號(hào)CGMCC No. 4550 ;分類命名分泌抗人CXCR3分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
2.一種抗人CXCR3分子單抗,所述單克隆抗體由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株制備得到。
3.權(quán)利要求2所述抗人CXCR3分子單克隆抗在制備抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述抗人CXCR3分子單克隆抗在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
5.一種抑制腫瘤細(xì)胞抑制的藥物,其特征在于,所述藥物的主要成分為權(quán)利要求2所述人CXCR3分子單克隆抗體。
6.一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物,其特征在于,所述藥物的主要成分為權(quán)利要求2所述人CXCR3分子單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞株以及由該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的一種抗人CXCR3分子單抗,所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏日期2011年01月24日;保藏號(hào)CGMCCNo.4550;分類命名分泌抗人CXCR3分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明所述抗人CXCR3分子單抗可以用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102161982SQ20111005645
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者孫杰, 朱華亭, 邱玉華, 陳永井 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
欧美午夜高清在线| 欧美日韩av久久| 欧美久久黑人一区二区| 高清av免费在线| 99国产精品一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频 | 精品久久久久久久毛片微露脸| av有码第一页| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 久久亚洲精品不卡| avwww免费| 午夜免费成人在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 不卡一级毛片| 一区二区三区国产精品乱码| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产97色在线日韩免费| 性少妇av在线| av福利片在线| 99精品久久久久人妻精品| 波多野结衣一区麻豆| 久久九九热精品免费| 国产色视频综合| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看免费午夜福利视频| 操出白浆在线播放| 操出白浆在线播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一进一出抽搐动态| 午夜老司机福利片| 国产麻豆69| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久视频综合| 免费不卡黄色视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产麻豆69| 热99re8久久精品国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产黄频视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美精品一区二区免费开放| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲国产av新网站| 成人国语在线视频| 91麻豆av在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲综合色网址| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品一区二区免费欧美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 777米奇影视久久| 国产男女内射视频| 国产精品欧美亚洲77777| 最新在线观看一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲免费av在线视频| 极品人妻少妇av视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 老司机午夜福利在线观看视频 | 日日爽夜夜爽网站| 国产1区2区3区精品| 黄色毛片三级朝国网站| 一区二区三区乱码不卡18| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 狠狠狠狠99中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 午夜福利免费观看在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲av电影在线进入| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产熟女午夜一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 成人三级做爰电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av国产精品久久久久影院| 一级毛片精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 婷婷成人精品国产| www.自偷自拍.com| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久狼人影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 99国产精品免费福利视频| 免费高清在线观看日韩| 大型av网站在线播放| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精华国产精华精| 波多野结衣一区麻豆| 99久久国产精品久久久| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费在线观看日本一区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 少妇 在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 丝袜喷水一区| 久久久欧美国产精品| 1024香蕉在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲黑人精品在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产黄频视频在线观看| 三级毛片av免费| 国产精品 欧美亚洲| 青青草视频在线视频观看| 丝袜美足系列| 国产精品久久久久久精品电影小说| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久久免费高清国产稀缺| av天堂在线播放| 搡老岳熟女国产| 国产三级黄色录像| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 女人精品久久久久毛片| 国产片内射在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 窝窝影院91人妻| 美女福利国产在线| 亚洲专区字幕在线| 97人妻天天添夜夜摸| 国产一区二区三区视频了| 极品少妇高潮喷水抽搐| 蜜桃在线观看..| 免费看a级黄色片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 女警被强在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 美女主播在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产亚洲精品一区二区www | 在线观看免费高清a一片| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看www视频免费| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲第一av免费看| 在线永久观看黄色视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成人手机av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 999久久久国产精品视频| 精品一区二区三卡| 国产精品电影一区二区三区 | 日本av手机在线免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久精品国产a三级三级三级| 一区二区日韩欧美中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 久久人妻熟女aⅴ| 超色免费av| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲avbb在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 99九九在线精品视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| videosex国产| 久久精品91无色码中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 一级毛片电影观看| 色综合婷婷激情| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜福利视频在线观看免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲av日韩在线播放| 午夜老司机福利片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一本久久精品| 亚洲熟女毛片儿| 国产在线一区二区三区精| 十八禁网站免费在线| 久久亚洲真实| e午夜精品久久久久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美日韩精品网址| 久久婷婷成人综合色麻豆| 波多野结衣av一区二区av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 一夜夜www| 操出白浆在线播放| 搡老乐熟女国产| av不卡在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 正在播放国产对白刺激| 国产在视频线精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 99在线人妻在线中文字幕 | 久久中文字幕一级| 一区二区三区精品91| 成人国语在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看66精品国产| 国产xxxxx性猛交| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜老司机福利片| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩免费av在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 交换朋友夫妻互换小说| 中文字幕色久视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久欧美国产精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产欧美网| 中文字幕制服av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| a级毛片在线看网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 日本五十路高清| 捣出白浆h1v1| 两性夫妻黄色片| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 色在线成人网| 久久精品人人爽人人爽视色| 波多野结衣一区麻豆| 久久午夜综合久久蜜桃| 女性被躁到高潮视频| 欧美在线黄色| 国产亚洲精品久久久久5区| 成年人黄色毛片网站| 大码成人一级视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成在线人永久免费视频| 热99re8久久精品国产| 日日夜夜操网爽| 亚洲中文字幕日韩| 他把我摸到了高潮在线观看 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av视频免费观看在线观看| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩成人在线一区二区| 91麻豆av在线| 高清欧美精品videossex| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人免费观看视频高清| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av有码第一页| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 又紧又爽又黄一区二区| 国产av一区二区精品久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 岛国在线观看网站| av在线播放免费不卡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美一级毛片孕妇| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产福利在线免费观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 水蜜桃什么品种好| 精品国产一区二区三区四区第35| 电影成人av| 91大片在线观看| 不卡一级毛片| 岛国毛片在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日本欧美视频一区| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久国产一区二区| 97人妻天天添夜夜摸| 久久天堂一区二区三区四区| 一级,二级,三级黄色视频| 久久人妻av系列| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99国产精品免费福利视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲少妇的诱惑av| 国产免费福利视频在线观看| 成人18禁在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一级毛片女人18水好多| 国产精品影院久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久电影中文字幕 | 两个人看的免费小视频| 悠悠久久av| 视频区欧美日本亚洲| 777米奇影视久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久天堂一区二区三区四区| 成年人黄色毛片网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美在线精品| 中国美女看黄片| 色视频在线一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 少妇 在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 热re99久久精品国产66热6| 日韩三级视频一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 激情在线观看视频在线高清 | 欧美黄色片欧美黄色片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 精品久久蜜臀av无| 久热爱精品视频在线9| 91精品三级在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 精品久久久精品久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 一区二区三区精品91| 啦啦啦在线免费观看视频4| videos熟女内射| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜免费鲁丝| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品欧美亚洲77777| 国产成人欧美| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美中文综合在线视频| 精品国产亚洲在线| 亚洲人成77777在线视频| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲专区国产一区二区| 老汉色av国产亚洲站长工具| e午夜精品久久久久久久| 九色亚洲精品在线播放| 天堂动漫精品| 99热网站在线观看| 黄色成人免费大全| 久久精品人人爽人人爽视色| 91麻豆av在线| 国产一区二区三区视频了| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日本黄色视频三级网站网址 | 99re6热这里在线精品视频| 黄色片一级片一级黄色片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜福利乱码中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲午夜理论影院| 国产主播在线观看一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产伦理片在线播放av一区| 99久久国产精品久久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| 日本vs欧美在线观看视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本黄色视频三级网站网址 | 天堂中文最新版在线下载| 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产99久久九九免费精品| 99re在线观看精品视频| 香蕉国产在线看| 国产精品久久久久成人av| 丁香欧美五月| 两性夫妻黄色片| 免费日韩欧美在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品免费视频内射| 国产成人精品在线电影| √禁漫天堂资源中文www| 黄色 视频免费看| 久久99一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 日韩有码中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 啦啦啦 在线观看视频| 一级片'在线观看视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 电影成人av| 在线观看舔阴道视频| h视频一区二区三区| 青草久久国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人国语在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品av久久久久免费| 天堂8中文在线网| 老熟女久久久| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美午夜高清在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 悠悠久久av| 日韩欧美免费精品| 青青草视频在线视频观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜激情久久久久久久| 精品国产亚洲在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 制服人妻中文乱码| 丁香六月天网| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩av久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲九九香蕉| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 国产黄频视频在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 黄色视频不卡| 成人18禁在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 视频区图区小说| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品国内亚洲2022精品成人 | 女同久久另类99精品国产91| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产日韩欧美视频二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美精品av麻豆av| 日韩视频在线欧美| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲欧美激情在线| 天堂中文最新版在线下载| 国产免费视频播放在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 黄色 视频免费看| 国产黄色免费在线视频| a级毛片黄视频| 国产精品av久久久久免费| 一区二区三区国产精品乱码| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 性少妇av在线| 不卡一级毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 超碰成人久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 91老司机精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久久久久国产电影| 国产黄频视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产有黄有色有爽视频| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲国产看品久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费看十八禁软件| 无限看片的www在线观看| 国产精品九九99| 9色porny在线观看| 在线永久观看黄色视频| 午夜久久久在线观看| 男女午夜视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品免费视频内射| 日本a在线网址| 一本久久精品| 国产精品.久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲第一av免费看| 大码成人一级视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久午夜亚洲精品久久| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av成人一区二区三| 成人免费观看视频高清| 搡老乐熟女国产| 他把我摸到了高潮在线观看 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久久久国产电影| 制服诱惑二区| 美女视频免费永久观看网站| 欧美乱妇无乱码| 黄色 视频免费看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 波多野结衣一区麻豆| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲黑人精品在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲精品一二三| 国产人伦9x9x在线观看| 宅男免费午夜| av天堂久久9| 蜜桃在线观看..| 制服人妻中文乱码| 人妻一区二区av| xxxhd国产人妻xxx| 99在线人妻在线中文字幕 | 午夜免费鲁丝| 国产一卡二卡三卡精品| 国产高清videossex| 蜜桃在线观看..| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美精品av麻豆av| 亚洲成人国产一区在线观看| 一级毛片电影观看| 精品人妻在线不人妻| 久久ye,这里只有精品| 亚洲男人天堂网一区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产av一区二区精品久久| 国产成人啪精品午夜网站| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 色尼玛亚洲综合影院| 久久久欧美国产精品| 9色porny在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日本av手机在线免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久精品人妻al黑| 看免费av毛片| 大香蕉久久网| 成人精品一区二区免费| 色94色欧美一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久中文字幕一级| 热99国产精品久久久久久7| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲七黄色美女视频| 9热在线视频观看99| 亚洲av国产av综合av卡| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 在线观看免费日韩欧美大片| 麻豆乱淫一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产一区二区三区视频了| 日本一区二区免费在线视频| 韩国精品一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一区二区三区激情视频| 精品福利永久在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本欧美视频一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 人妻久久中文字幕网| 在线观看免费视频日本深夜| 国产欧美亚洲国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产国语露脸激情在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人三级做爰电影| 久久久精品免费免费高清| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲午夜理论影院| 男女免费视频国产|