專利名稱：仿松質(zhì)骨生物活性人工骨及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種仿松質(zhì)骨生物活性人工骨及其制備方法，用于修復骨缺損、骨壞 死、粉碎性骨折、骨不連和骨裂，屬于生物醫(yī)學工程及材料科學技術領域。
背景技術：
骨骼移植是僅次于輸血的需求量最大的移植物，由于事故或疾病造成骨缺損是臨 床常見病例。目前常用的修復材料有自體骨、異體骨及人工合成材料，這些材料均在不同程 度上存在不足，不能滿足臨床需要。如自體骨移植雖無免疫排斥反應，修復效果良好，但取 材十分有限，且造成供區(qū)的骨缺損；同種異體骨移植容易引起免疫排斥反應，修復效果差， 并有傳染病毒性疾病的危險，而且取樣、處理、存儲的成本高，其應用受到很大限制；人工合 成材料如聚甲丙烯酸甲酯、硫化硅橡膠等都是非降解材料，不能修復缺損區(qū)，且存在排異反 應。目前研究的重點是致力于找出具有良好的理化性質(zhì)、生物學特性的生物材料作為骨移 植物或骨誘導材料。利用磷酸鈣類物質(zhì)作為骨移植材料經(jīng)過近百年的歷史，目前仍有廣泛 的應用前景，但傳統(tǒng)的磷酸鈣類物質(zhì)如羥基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)等無孔或孔徑小， 孔隙交通達不到骨單位內(nèi)向生長的結構要求，且其存在脆性大、韌性低、可降解性差、修復 能力弱等缺點，只能作為骨科的填充材料。目前，市場上新出現(xiàn)的“納米人工骨”仍存在可 降解性差、誘導骨再生能力弱的缺點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種仿松質(zhì)骨生物活性人工骨及其制備方法，將低結晶度的磷酸氫鈣 與動物膠原復配，冷凍干燥制成高孔隙率、具有良好孔隙交通的復合人工骨，使其具有被徹 底降解和誘導大段骨缺損修復的性能。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是一種仿松質(zhì)骨生物活性人工骨由磷酸氫鈣粉體和膠原溶液復配而成。上述磷酸氫鈣粉體為CaHPO4. 2H20粉體和CaHPO4粉體中的一種或兩者任意配比的 混合物；優(yōu)選為CaHPO4. 2H20粉體和CaHPO4粉體任意配比的混合物。上述述膠原溶液的粘度優(yōu)選為700 lOOOcP。每毫升膠原溶液復配0. 6 1. Og 磷酸氫鈣粉體。上述仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法為在于在每毫升粘度為700 IOOOcP 的膠原溶液中，加入0. 6 1. Og磷酸氫鈣粉體，混勻、冷凍干燥。具體包括如下步驟a、制備磷酸氫鈣粉體將水溶性的含Ca2+的化合物和含PO43-的化合物充分溶于水 中，滴入堿性溶液至pH值為62 6. 9 (當pH值為6時即開始出現(xiàn)沉淀，隨著pH值的升高， 沉淀越來越多，溶液越來越渾濁，待PH值升至6. 2 6. 9時，停止堿性溶液的滴入)，收集沉 淀，干燥、研磨后得低結晶度的以CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體；b、制備膠原溶液取動物肌腱于酸溶液中，加入胃蛋白酶溶液，混勻、浸泡得膠原蛋白溶液；C、在上述制備的膠原溶液中加入磷酸氫鈣粉體，混勻；d、將上述磷酸氫鈣和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人工骨。e、將所得仿松質(zhì)骨生物活性人工骨用15 20kGy劑量6tlCo輻照滅菌。上述步驟a中所用水優(yōu)選為蒸餾水或去離子水；收集沉淀方法優(yōu)選為離心沉淀 法，所得沉淀物最好水洗3次以上；沉淀的干燥溫度優(yōu)選為80 100°C，干燥時間M 48 小時；水溶性的含Ca2+的化合物和含PO43-的化合物的用量可以為任意值，只要將它們充分 溶解即可，本發(fā)明主要是通過調(diào)節(jié)pH值來控制產(chǎn)物的生成。上述步驟b中所取肌腱一般為哺乳動物的肌腱，在置于酸溶液前，一般要先去 除油脂、用滅菌溶液浸泡消毒滅菌后，漂洗干凈；所用酸溶液的體積百分比濃度為0. 5 1. 0% ；每毫升酸溶液中胃蛋白酶的加入量為20 25國際活性單位；所得膠原蛋白溶液的 粘度為700 IOOOcP (厘泊)，且一般要過濾除渣，以去掉部分未溶解的肌腱。上述步驟c中每毫升膠原溶液中磷酸氫鈣粉體的加入量為0. 6 1. 0g。上述水溶性含Ca2+的化合物優(yōu)選為CaCl2、CaO、Ca (OH) 2或Ca (NO3) 2 · 4H20 ；含 PO43-的化合物優(yōu)選為(NH4)2HPCV Na2HPO4或H3PO4 ；堿性溶液優(yōu)選為NaOH溶液、Ca(OH)2溶 液、NaHCO3溶液、Na2CO3溶液、NH4HCO3溶液或氨水；酸溶液優(yōu)選為乙酸、磷酸、硫酸、硝酸或鹽 酸溶液；哺乳動物的肌腱優(yōu)選為豬腿肌腱、牛腿肌腱、羊腿肌腱、狗腿肌腱、驢腿肌腱、騾腿 肌腱、鹿腿肌腱、兔腿肌腱或馬腿肌腱。上述仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法的步驟d中，冷凍干燥的流程優(yōu)選為 經(jīng)1 3小時從室溫降至-40°c -50°c ；保溫2 4小時；凍實后抽真空升華12 M小 時；經(jīng)2 4小時升溫至0°C，0°C保溫4 12小時；經(jīng)1 3小時升溫至15°C，15°C保溫 4 8小時；經(jīng)1 3小時升溫至25°C，緊接著經(jīng)1 3小時升溫至，保溫2 4小時，
去真空。本發(fā)明所得的人工骨的結構和成分，類似天然松質(zhì)骨；其中低結晶度的磷酸氫鈣 更有利于人工骨的降解吸收和自體骨缺損的修復重建。該人工骨傳導作用強、孔隙率高、孔 隙交通好、生物相容性好，有利于骨細胞生長，且其中的膠原在被機體降解吸收的過程中， 為骨細胞的長入不斷騰出空間。與現(xiàn)有技術所使用的羥基磷灰石復合人工骨相比，無論是 可降解性還是誘導自體骨再生性能，本發(fā)明均具有突出的優(yōu)勢。
圖1為本發(fā)明掃描電鏡照片。圖2為本發(fā)明X射線衍射圖。圖3為本發(fā)明植入兔體后不同時間缺損處修復的動態(tài)變化的X線照片。圖4為本發(fā)明植入兔體76天顯微鏡下放大100倍的組織切片圖。圖5為本發(fā)明植入兔體92天X線照片。圖6為標準羥基磷灰石/膠原復合人工骨植入兔體92天X線照片。圖7為本發(fā)明植入兔體92天顯微鏡下放大100倍的組織切片圖。圖8為標準羥基磷灰石/膠原復合人工骨植入兔體92天顯微鏡下放大100倍的 組織切片圖。
具體實施例方式本發(fā)明提出的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法如下a、磷酸氫鈣粉體的制 備，將含Ca2+的化合物充分溶于去離子水中，邊攪拌邊加入含PO43-的化合物，待充分溶解、 溶液清亮后，邊攪拌邊滴入堿性溶液至PH值為6. 2 6. 9，當pH值為6時即開始出現(xiàn)沉淀， 隨著PH值的升高，沉淀越來越多，溶液越來越渾濁，待PH值升至6. 2 6. 9時，停止堿性溶 液的滴入，離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次以上，離心，沉淀置于干燥箱中80 100°C 下干燥M 48小時，研磨后得到低結晶度的磷酸氫鈣粉體；b、膠原溶液的制備過程，取豬 腿、牛腿、羊腿、狗腿、馬腿等的肌腱，仔細剔除脂肪和肌肉組織后用洗滌劑去除肌腱表面的 油脂，用滅菌溶液浸泡消毒滅菌，取出后漂洗干凈，然后將肌腱浸泡于體積百分比為0. 5 1.0%的酸溶液中，并加入胃蛋白酶溶液，使每毫升酸溶液中的胃蛋白酶為20 25國際活 性單位，不斷攪拌混勻，在室溫下浸泡至溶液粘度為700 IOOOcP (厘泊)，過濾除渣得高 濃度膠原蛋白溶液；C、在每毫升膠原溶液中加入0. 6 1. Og磷酸氫鈣粉體，充分攪拌混勻； d、灌裝入模具容器后冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人工骨；e、將凍干品密封包裝后用 15 20kGy劑量60Co輻照滅菌。下面介紹本發(fā)明的具體實施例實施例1a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取44g CaCl2. 2H20溶于1000ml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加入 17ml 30% H3PO4溶液，待充分溶解、溶液變清亮后邊攪拌邊加入lmol/L的NaOH溶液至pH 值為6. 8。離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中85°C下干燥48 小時，研磨后得CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫合格的豬腿肌腱25g，用洗潔精清洗以徹底去除油脂，然后用自來水漂洗 4次，用84消毒液浸泡15分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子水漂洗4次，將肌腱直 接浸泡于已滅菌的2000ml 0.5%的乙酸溶液中(容器事先經(jīng)滅菌處理)，并加入已除菌的 40000 U(國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中的胃蛋白酶為20國際活性單位， 置于無菌環(huán)境下不斷搖晃或攪拌混勻，在室溫下浸泡M小時至溶液粘度為700cP，過濾除 渣得膠原蛋白溶液。c、稱取600g磷酸氫鈣粉體加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)1小時從室溫降至-40°C，保溫2小時，凍實后抽真空升華12小 時，經(jīng)2小時升溫至0°C，0°C保溫4小時，經(jīng)1小時升溫至15°C，15°C保溫4小時，經(jīng)1小時 升溫至25°C，緊接著經(jīng)1小時升溫至35°C，保溫2小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用19kGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例2a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取112g CaO溶于IOOOml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加入^g磷酸氫二氨((NH4)2HPO4)，然后邊攪拌邊加入lmol/L的Ca(OH)2溶液至pH值為6. 9。離心收 集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中90°C下干燥38小時，研磨后得到 CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的牛腿的肌腱30g，用0. IN的NaOH溶液清洗以徹底去除油脂，然 后用自來水漂洗4次，用2%戊二醛溶液浸泡18分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子水 漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.6%的磷酸溶液中(容器事先經(jīng)滅 菌處理)，并加入已過濾除菌的44000 U(國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升磷酸溶液中的 胃蛋白酶為22國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡18小時至溶液 粘度為750cP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取650g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)3小時從室溫降至-45°C，保溫4小時，凍實后抽真空升華M小 時，經(jīng)4小時升溫至0°C，0°C保溫12小時，經(jīng)3小時升溫至15°C，15°C保溫8小時，經(jīng)3小 時升溫至25°C，緊接著經(jīng)3小時升溫至35°C，保溫4小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用15kGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例3a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取189g硝酸鈣(Ca (NO3) 2 · 4H20)溶于IOOOml去離子水中，攪拌使其充分溶解， 邊攪拌邊加入68g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，待充分溶解溶液變清亮后邊攪拌邊加入lmol/L的 Na2CO3溶液至pH值為6. 7。離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱 中95°C下干燥31小時，研磨后得到CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟 制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的馬腿的肌腱35g，用洗潔精清洗以徹底去除油脂，然后用自來水 漂洗4次，用0. 6%的過氧乙酸溶液浸泡20分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子水漂洗 4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.7%的鹽酸溶液中(容器事先經(jīng)滅菌處 理)，并加入已過濾除菌的48000 U(國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升鹽酸溶液中的胃蛋 白酶為M國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷攪拌混勻，在室溫下浸泡四小時至溶液粘度 為800cP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取700g上述磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模
具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)2小時從室溫降至-50°C，保溫3小時，凍實后抽真空升華20小 時，經(jīng)3小時升溫至0°C，0°C保溫5小時，經(jīng)2小時升溫至15°C，15°C保溫6小時，經(jīng)2小時 升溫至25°C，緊接著經(jīng)2小時升溫至35°C，保溫3小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用16kGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例4
a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取148g Ca(OH)2溶于IOOOml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加 入63g磷酸氫二氨((NH4)2HPO4),然后邊攪拌邊加入飽和氨水至pH值為6.6。離心收集 沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中98°C下干燥30小時，研磨后得到 CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的羊腿的肌腱50g，仔細剔除脂肪、肌肉組織后用洗潔精清洗以徹 底去除油脂，然后用自來水漂洗4次，用11倍稀釋的新潔爾滅溶液浸泡25分鐘消毒滅菌， 取出后用已滅菌的去離子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0. 8%的 硫酸溶液中(容器事先經(jīng)滅菌處理)，并加入已過濾除菌的50000 U(國際單位)胃蛋白 酶溶液，使每毫升硫酸溶液中的胃蛋白酶為25國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混 勻，在室溫下浸泡10小時至溶液粘度為850cP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取750g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容 器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)1.5小時從室溫降至-48°C，保溫2. 5小時，凍實后抽真空升華 12小時，經(jīng)2. 5小時升溫至0°C，0°C保溫7小時，經(jīng)1. 5小時升溫至15°C，15°C保溫7小時， 經(jīng)1. 5小時升溫至25°C，緊接著經(jīng)1. 5小時升溫至35°C，保溫2. 5小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用ISkGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例5a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取29. 4g CaCl2. 2H20溶于1000ml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加 入16g磷酸氫二氨((NH4)2HPO4)，然后邊攪拌邊加入lmol/L的NaHCO3溶液至pH值為6. 5。 離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，沉淀置于干燥箱中80°C下干燥48小時，研磨后 得到CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的狗腿的肌腱50g，用洗潔精清洗以徹底去除油脂，然后用自來水 漂洗4次，用0. 5%洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.9%的硝酸溶液中(容器事先經(jīng) 滅菌處理)，并加入已過濾除菌的46000 U(國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中 的胃蛋白酶為23國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡10小時至溶 液粘度為lOOOcP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取800g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)2. 5小時從室溫降至-49°C，保溫3. 5小時，凍實后抽真空升華 23小時，經(jīng)3. 5小時升溫至0°C，0°C保溫10小時，經(jīng)2. 5小時升溫至15°C，15°C保溫5小 時，經(jīng)2. 5小時升溫至25°C，緊接著經(jīng)2. 5小時升溫至35°C，保溫3小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用19kGy劑量6tlCo輻照滅菌。
從掃描電鏡(JSM-6460LV，Electron，Japan)照片(圖1)，可知所得人工骨空隙直 徑在100 μ m至400 μ m,孔隙率為83. 8士5%，即人工骨具有類似天然松質(zhì)骨的內(nèi)連孔結構 和孔徑。從X射線衍射圖(圖2)可知人工骨的無機成分為CaHPO4. 2H20。實施例6a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取118g硝酸鈣(Ca(NO3)2 · 4H20)溶于IOOOml去離子水中，攪拌使其充分溶解， 邊攪拌邊加入^ml 30% H3PO4溶液，然后邊攪拌邊加IN NH4HCO3溶液至pH值為6. 4。離心 收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中100°C下干燥觀小時，研磨后得 到CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的驢腿的肌腱45g，用0. IN NaOH溶液清洗以徹底去除油脂，然后 用自來水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子水 漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 1.0%的磷酸溶液中(容器事先經(jīng)滅 菌處理)，并加入已過濾除菌的50000 U(國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升磷酸溶液中的 胃蛋白酶為25國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡10小時至溶液 粘度為900cP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取850g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)3小時從室溫降至-41°C，保溫4小時，凍實后抽真空升華18小 時，經(jīng)4小時升溫至0°C，0°C保溫9小時，經(jīng)3小時升溫至15°C，15°C保溫4. 5小時，經(jīng)3小 時升溫至25°C，緊接著經(jīng)1小時升溫至35°C，保溫4小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用70kGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例7a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取44g CaCl2. 2H20溶于1000ml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加入 17ml 30 ^H3PO4溶液，然后邊攪拌邊加入lmol/L的NaHCO3液至pH值為6. 3。離心收 集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中100°C下干燥M小時，研磨后得 CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的騾腿的肌腱45g，用0. IN的NaoH溶液清洗以徹底去除油脂，然 后用自來水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.8%的乙酸溶液中(容器事先經(jīng) 滅菌處理)，并加入已過濾除菌的50000U (國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中 的胃蛋白酶為25國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡10小時至溶 液粘度為900cP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。C、稱取900g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人工骨。溫度控制流程為經(jīng)2小時從室溫降至-46°C，保溫4小時，凍實后抽真空升華20小 時，經(jīng)3小時升溫至0°C，0°C保溫11小時，經(jīng)2小時升溫至15°C，15°C保溫5小時，經(jīng)2小 時升溫至25°C，緊接著經(jīng)3小時升溫至35°C，保溫2小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用20kGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例8a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取118g硝酸鈣(Ca(NO3)2 · 4H20)溶于IOOOml去離子水中，攪拌使其充分溶解， 邊攪拌邊加入^ml 301^H3PO4溶液，然后邊攪拌邊加入lmol/L的NaOH溶液至pH值為6. 2。 離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中90°C下干燥36小時，研磨 后得到CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的鹿腿的肌腱40g，用0. IN的NaoH溶液清洗以徹底去除油脂，然 后用自來水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.7%的乙酸溶液中(容器事先經(jīng) 滅菌處理)，并加入已過濾除菌的48000U (國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中 的胃蛋白酶為M國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡10小時至溶 液粘度為lOOOcP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。c、稱取950g磷酸氫鈣干粉加入IOOOml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)1. 5小時從室溫降至_46°C，保溫3小時，凍實后抽真空升華21 小時，經(jīng)4小時升溫至0°C，0°C保溫6小時，經(jīng)1小時升溫至15°C，15°C保溫6小時，經(jīng)1小 時升溫至25°C，緊接著經(jīng)2小時升溫至35°C，保溫3. 5小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用ISkGy劑量6tlCo輻照滅菌。實施例9a、低結晶度磷酸氫鈣粉體的制備稱取29. 4g CaCl2. 2H20溶于1000ml去離子水中，攪拌使其充分溶解，邊攪拌邊加 入16g磷酸氫二氨((NH4)2HPO4),然后邊攪拌邊加入lmol/L的NH4HCO3至pH值為6. 9。離 心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，離心，將沉淀置于干燥箱中85°C下干燥47小時，研磨后 得到CaHPO4. 2H20為主混有少量CaHPO4的粉體。重復該步驟制備IOOOg粉體。b、膠原溶液的制備取經(jīng)檢疫后合格的兔腿的肌腱50g，用洗潔精清洗以徹底去除油脂，然后用自來水 漂洗4次，用0. 5%洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分鐘消毒滅菌，取出后用已滅菌的去離子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已滅菌的2000ml 0.6%的硝酸溶液中(容器事先經(jīng) 滅菌處理)，并加入已過濾除菌的46000U (國際單位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中 的胃蛋白酶為23國際活性單位，置于無菌環(huán)境下不斷搖晃混勻，在室溫下浸泡10小時至溶 液粘度為lOOOcP，過濾除渣得膠原蛋白溶液。C、稱取IOOOg磷酸氫鈣干粉加入1000ml膠原溶液，充分攪拌混勻后灌裝入模具容器中。
d、將上述磷酸氫鈣粉體和膠原的混合膏狀物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人 工骨。溫度控制流程為經(jīng)2. 5小時從室溫降至-50°C，保溫2小時，凍實后抽真空升華18 小時，經(jīng)3小時升溫至0°C，0°C保溫7小時，經(jīng)1小時升溫至15°C，15°C保溫6小時，經(jīng)2小 時升溫至25°C，緊接著經(jīng)3小時升溫至35°C，保溫3. 5小時，去真空。e、然后將凍干品密封包裝后用15kGy劑量6tlCo輻照滅菌。應用實施例1方法使用5只新西蘭大白兔(1. 5-2. Okg，南京安利默實驗動物有限公司)作為 實驗動物，所有動物被戊巴比妥鈉溶液局部麻醉后在一側尺骨造成Icm全缺損，在缺損處 植入上述實施例5所得人工骨。術后1周每天按體重給動物注射青霉素消炎。并在術后 0、7、14、21、35、42、49、55、62、69、76天拍X線照片，最后處死動物進行解剖觀察及組織學觀察。結果從術后X線照片(圖3)可看出，術后7天可見缺損處骨組織大量增生，至 術后49天可見缺損處合攏但尚未完全愈合，術后49至55天出現(xiàn)明顯的過度增生及與橈骨 粘連，此后經(jīng)歷增生與吸收的過程直至完全愈合，術后76天可見完全愈合。處死動物進行 解剖得知缺損處修復后與未手術部位外觀接近，且人造骨已被完全降解吸收。由組織切片 (圖4)可見，缺損處形成骨板并完全骨化、骨單位明顯、尚未形成明顯的層狀骨板，散布的 骨窩中有骨細胞、中央管可見新生血管，未見人工骨殘留，人工骨被徹底降解吸收。本發(fā)明分別將上述其它實施例所得的人工骨植入兔體后，均得到與應用實施例1 接近的結果。比較實施例1方法使用10只新西蘭大白兔(1. 5-2. 0kg，南京安利默實驗動物有限公司)作為 實驗動物，隨機分為2組，每組5只，所有動物被戊巴比妥鈉溶液局部麻醉后在一側尺骨造 成Icm全缺損，將第一組在缺損處植入上述實施例4所得人工骨，將第二組在缺損處植入標 準羥基磷灰石/膠原復合人工骨(羥基磷灰石標準品購自南京南奧科技有限公司)。術后 1周每天按體重給動物注射青霉素消炎。在術后92天拍X線照片后，處死動物進行解剖觀 察及組織學觀察。結果第一組大白兔由術后92天的X線照片(圖5)顯示，缺損處完全愈合；處 死動物進行解剖得知，缺損處修復與未手術部位外觀接近；由組織切片(圖7)可見，缺損處 形成骨板并完全骨化、骨單位明顯、尚未形成明顯的層狀骨板，散布的骨窩中有骨細胞、中 央管可見新生血管，未見人工骨殘留，人工骨被徹底降解吸收。第二組大白兔由術后92天的X線照片(圖6)顯示，缺損處部分愈合；處死動物 進行解剖得知，缺損處成骨較差，易折斷，其中一只兔子因手術部位骨折死亡；由組織切片 (圖8)可見，缺損處雖有組織再生，但由結締組織和軟骨組織構成，基本未骨化。
權利要求
1.一種仿松質(zhì)骨生物活性人工骨，其特征在于由磷酸氫鈣粉體和膠原溶液復配而成。
2.如權利要求1所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨，其特征在于所述磷酸氫鈣粉體為 CaHPO4. 2H20粉體和CaHPO4粉體中的一種或兩者任意配比的混合物。
3.如權利要求1或2所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨，其特征在于所述膠原溶液的粘 度為 700 IOOOcP。
4.如權利要求1或2所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨，其特征在于每毫升膠原溶液復 配0.6 l.Og磷酸氫鈣粉體。
5.如權利要求1至4任意一項所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法，其特征在 于包括如下步驟a、將水溶性的含Ca2+的化合物和含PO43-的化合物充分溶于水中，滴入堿性溶液至pH 值為6. 2 6. 9，收集沉淀，干燥、研磨后得低結晶度的以CaHPO4.2H20為主混有少量CaHPO4 的粉體；b、取動物肌腱于酸溶液中，加入胃蛋白酶溶液，混勻、浸泡得膠原蛋白溶液；C、在上述制備的膠原溶液中加入磷酸氫鈣粉體，混勻；d、將上述磷酸氫鈣和膠原的混合物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人工骨。
6.如權利要求5所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法，其特征在于還包括步驟 e 將所得仿松質(zhì)骨生物活性人工骨用15 20kGy劑量6tlCo輻照滅菌。
7.如權利要求5或6所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法，其特征在于步驟a 中的干燥溫度為80 100°C，干燥時間為M 48小時；步驟b中酸溶液的體積百分比濃 度為0. 5 1. 0%，每毫升酸溶液中胃蛋白酶的加入量為20 25國際活性單位，所得膠原 蛋白溶液的粘度為700 IOOOcP ；步驟c中每毫升膠原溶液中磷酸氫鈣粉體的加入量為 0. 6 1. Og0
8.如權利要求5或6所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法，其特征在于所述 水溶性含Ca2+的化合物為CaCl2、CaO, Ca(OH)2或Ca(NO3)2 · 4H20 ；所述含P043_的化合物為 (NH4) 2HP04、Na2HPO4 或 H3PO4 ；所述堿性溶液為 NaOH 溶液、Ca (OH) 2 溶液、NaHCO3 溶液、Na2CO3 溶液、NH4HCO3溶液或氨水；所述酸溶液為乙酸、磷酸、硫酸、硝酸或鹽酸；所述動物肌腱為豬 腿肌腱、牛腿肌腱、羊腿肌腱、狗腿肌腱、驢腿肌腱、騾腿肌腱、鹿腿肌腱、兔腿肌腱或馬腿肌 腱。
9.如權利要求5或6所述的仿松質(zhì)骨生物活性人工骨的制備方法，其特征在于步驟d 中冷凍干燥的流程為經(jīng)1 3小時從室溫降至-40°C -50°C ；保溫2 4小時；凍實后 抽真空升華12 M小時；經(jīng)2 4小時升溫至0°C，0°C保溫4 12小時；經(jīng)1 3小時 升溫至15°C，15°C保溫4 8小時；經(jīng)1 3小時升溫至25°C，緊接著經(jīng)1 3小時升溫至 35 °C,保溫2 4小時，去真空。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種仿松質(zhì)骨生物活性人工骨及其制備方法，所述仿松質(zhì)骨生物活性人工骨由磷酸氫鈣粉體和膠原溶液復配而成；其制備方法為將制備好的磷酸氫鈣粉體和膠原溶液混勻，再將上述混合物冷凍干燥成為仿松質(zhì)骨生物活性人工骨。本發(fā)明所得的人工骨的結構和成分，類似天然松質(zhì)骨；其中低結晶度的磷酸氫鈣更有利于人工骨的降解吸收和自體骨缺損的修復重建。該人工骨傳導作用強、孔隙率高、孔隙交通好、生物相容性好，有利于骨細胞生長，且其中的膠原在被機體降解吸收的過程中，為骨細胞的長入不斷騰出空間。
文檔編號A61L27/12GK102133426SQ201110053458
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權日2011年3月7日
發(fā)明者胡慶柳 申請人:胡慶柳