豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法

專利名稱：豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獸用活疫苗的制備方法，尤其涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制 備方法以及由該方法制備得到的豬細(xì)小病毒滅活疫苗，屬于豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(Porcin印arvo viurs,PPV)可引起豬的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為胎兒和 胚胎的感染和死亡，而母體通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。血清學(xué)陰性母豬主要在妊娠的前半期 經(jīng)口鼻感染病毒，結(jié)果免疫機(jī)能不全的胎兒經(jīng)胎盤受到感染，從而導(dǎo)致發(fā)病。經(jīng)檢查得知在 世界各地的豬群中，該病毒是普遍存在的，在大多數(shù)豬場呈地方性流行。此病流行很廣，在 歐、美、亞及大洋洲很多國家均有報道。我國的各省市相繼分離到豬細(xì)小病毒，血清陽性率 很高。本病對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。由于PPV目前尚無有效的藥物治療方法，因此，該病的預(yù) 防免疫就顯得更為重要。體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞有兩種類型，一種是非貼壁性細(xì)胞，培養(yǎng)時不貼附于支持物 上，而呈懸浮狀態(tài)生長，胞體為圓形。來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，多數(shù)腫瘤細(xì)胞和部分轉(zhuǎn) 化細(xì)胞屬于這一類型，其培養(yǎng)方式類似微生物培養(yǎng)方式；另一種是貼壁依賴性細(xì)胞，培養(yǎng)時 能貼附在支持物表面生長。當(dāng)細(xì)胞貼附在支持物上后，會迅速鋪展，然后開始有絲分裂，進(jìn) 入對數(shù)生長期，數(shù)天后可長成致密的細(xì)胞單層。成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及Vero細(xì)胞、BHK 細(xì)胞、ST細(xì)胞等大多數(shù)動物細(xì)胞都屬于此類型。目前中國生物制品生產(chǎn)上培養(yǎng)貼壁依賴性 細(xì)胞如Vero、ST細(xì)胞等多采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)，該工藝因具有技術(shù)成熟投資量小 的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但其生產(chǎn)中細(xì)胞所能增殖的區(qū)域僅限于培養(yǎng)瓶的有限面積，培養(yǎng)的 環(huán)境條件難以監(jiān)測和控制，因此細(xì)胞密度低，而且勞動強(qiáng)度大，操作過程不易控制，發(fā)生污 染，疫苗產(chǎn)量及質(zhì)量受到極大限制。1967年，Van Wezal首次開發(fā)了微載體系統(tǒng)，創(chuàng)建了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)細(xì)胞 工藝，使動物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入高密度培養(yǎng)階段。微載體是直徑為60-50 μ m的微珠。由于微載 體本身所占體積和質(zhì)量不大，但有很大的有效面積可供細(xì)胞附著，大大提高了生產(chǎn)效率。微 載體最早使用的材料是離子交換凝膠(DEAE-S印hadexA-50)，輕微攪動即可懸浮于培養(yǎng)基 中。這種載體對細(xì)胞具有一定毒性，并且對培養(yǎng)液PH值也有一定影響。后來根據(jù)細(xì)胞生長 特點(diǎn)，對微載體進(jìn)行了改良，使其帶有電荷或其它介質(zhì)，更利于細(xì)胞的附著和生長。目前微 載體己有葡聚糖微載體、聚苯乙烯微載體、中空玻璃微載體、交聯(lián)明膠微載體、纖維素微載 體、聚苯烯酞胺微載體等多種不同制造材料類型。其中，使用較多的是Cyotdex型系列微載 體(Cytodexl，Cytodex2, CytodeX3)，它們都是帶有不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)而成的大分子。 Cytodexl整個載體帶有正電荷，用于傳代細(xì)胞如Vero、CH0細(xì)胞的培養(yǎng)；CytodeX2僅表面帶 有正電荷；CytodeX3不帶電荷，其外表被膠原層包裹，膠原是豚鼠皮膚的提取物，同樣適于 細(xì)胞的附著生長。第一個工業(yè)化應(yīng)用微載體的是1980年Meignier等用于口蹄疫病毒疫苗 的制造，及后來的小兒麻痹疫苗的生產(chǎn)制造。
采用生物反應(yīng)器/微載體系統(tǒng)培養(yǎng)動物細(xì)胞，細(xì)胞貼附于微載體上，懸浮于培養(yǎng) 基中，逐漸分裂生長成單層細(xì)胞。該培養(yǎng)模式把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)融合起來，具有以下優(yōu)
點(diǎn)(1)表面積/體積比大，單位體積培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)率高。如Img Cytodexl微載體表 面積可達(dá)5-6cm2，較傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)面積大大增加。(2)改良后的微載體無毒性，其大小和表面性質(zhì)更適宜細(xì)胞生長，而且具有一定的 透明度，便于顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。(3)微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長環(huán)境均一，簡化了培養(yǎng)條件的監(jiān)測和控制， 同時培養(yǎng)基利用率高。(4)采樣重演性好，收獲過程不復(fù)雜，勞動強(qiáng)度小，占用空間小，操作簡便，所需人 員少，工藝容易放大生產(chǎn)。目前通過ST細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)增殖豬細(xì)小病毒(PPV)病毒液，已被廣泛應(yīng)用，然而目 前所用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的工藝，雖技術(shù)簡單，但勞動強(qiáng)度大，即使簡單的換 液都需付出巨大的勞動，且染菌風(fēng)險大。應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞具有 高比表面積、細(xì)胞產(chǎn)量高，懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)便于監(jiān)測、控制和取樣，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易染 菌等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)上被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)如狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等疫苗。但是，利用生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)PPV疫苗存在著豬細(xì)小病毒 液培養(yǎng)產(chǎn)量偏低、不易規(guī)模放大、成本過高、疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定等缺陷，這些缺陷嚴(yán)重影響或 制約了該方法在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法中所 存在的豬細(xì)小病毒液培養(yǎng)產(chǎn)量偏低、不易規(guī)模放大、成本過高、疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定等缺陷，提 供一種新的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，該制備方法利用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng) ST細(xì)胞高效生產(chǎn)豬細(xì)小病毒液，對生產(chǎn)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，該方法具有所生產(chǎn)的豬細(xì)小 病毒液病毒滴度高，能夠規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)、成本低、疫苗質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括(1)將豬細(xì)小病毒弱毒株接種ST細(xì) 胞，培養(yǎng)得到生產(chǎn)種毒；( 將處理后的微載體加入到生物反應(yīng)器的細(xì)胞生長液中，攪拌； (3)將ST細(xì)胞接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行攪拌，進(jìn)行細(xì)胞的繁殖培養(yǎng)；(4)將豬細(xì)小 病毒生產(chǎn)種毒感染生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞，進(jìn)行病毒的繁殖培養(yǎng)；(5)收獲繁殖 的病毒液，滅活，配苗，即得。本發(fā)明制備方法中，所述的豬細(xì)小病毒弱毒株可以是豬細(xì)小病毒弱毒L株，其微 生物保藏號是CGMCC No. 3352 ；其中，步驟⑵中所述的微載體可以是Cyotdex型系列微載體，更優(yōu)選為 Cytodex-I型微載體，所述的預(yù)處理方式包括硅化、水化和平衡；優(yōu)選的，步驟( 中將預(yù)處理后的微載體按照每升細(xì)胞生長液中含有5_7g的微載 體的配比比例加入到細(xì)胞生長液中；步驟( 中所述的攪拌速度優(yōu)選為40rpm;所述的攪拌 時間為20-40min，優(yōu)選為30min。
本發(fā)明考察了 ST細(xì)胞的不同培養(yǎng)方式對細(xì)胞密度的影響，實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用灌 注培養(yǎng)的細(xì)胞密度明顯高于批式培養(yǎng)的細(xì)胞密度，本發(fā)明在進(jìn)行ST細(xì)胞培養(yǎng)時優(yōu)選采用 灌注培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方式。此外，在灌注培養(yǎng)中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種濃度對于細(xì)胞的生長 速度和穩(wěn)定性等有顯著影響，本發(fā)明通過大量的實(shí)驗最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ST細(xì)胞以IXio5AiL濃 度接種到生物反應(yīng)器中的微載體上時，第7天細(xì)胞密度就可達(dá)1 X IOVmL,細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，維 持時間長，利于病毒繁殖。本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，攪拌速度對于細(xì)胞的貼壁影響非常大。本發(fā)明通 過大量的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，步驟(3)中所述的攪拌采用以下攪拌速度時最有利于細(xì)胞的貼壁首 先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為50-60rpm ；更優(yōu)選為首先在轉(zhuǎn) 速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為50rpm。其中，步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37°C，培養(yǎng)液的pH值優(yōu)選為7. O。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，步驟中豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒感染細(xì)胞的劑量對于病毒液的病 毒滴度有著一定的影響，本發(fā)明通過實(shí)驗篩選發(fā)現(xiàn)，將豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒以感染復(fù)數(shù)為 0. OOlMOI、0. OlMOI、0. 05M0I感染生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞有利于提高病毒液的病 毒滴度，尤其是將豬細(xì)小病毒毒生產(chǎn)種毒以感染復(fù)數(shù)為0. OlMOI感染生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)的ST細(xì)胞進(jìn)行灌注培養(yǎng)法培養(yǎng)可以有效提高病毒液的病毒滴度。其中，所述步驟(4)中 所述的灌注培養(yǎng)溫度優(yōu)選為35°C，培養(yǎng)液的pH值優(yōu)選為7. 4，所述的攪拌速度為50-60rpm。本發(fā)明根據(jù)ST細(xì)胞生長代謝及病毒增殖的特點(diǎn)，對攪拌式生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng) 技術(shù)應(yīng)用于豬細(xì)小病毒疫苗生產(chǎn)進(jìn)行研究，對各技術(shù)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和篩選，使細(xì)胞增殖時 培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，并在接種病毒后細(xì)胞仍能得到足夠的營養(yǎng)和平衡的環(huán)境；同時乳酸和氨 等有毒代謝產(chǎn)物得以不斷排除，本發(fā)明方法的細(xì)胞維持時間長，細(xì)胞活力高(> 90% )、 活細(xì)胞密度大(彡lX107cellS/mL)，有利于病毒的持續(xù)繁殖，所制備的豬細(xì)小病毒 TCID50 ^ 108_°。生產(chǎn)過程銜接緊密、順暢，規(guī)模放大容易，生產(chǎn)周期短，占用場地小，環(huán)境污 染少且易于處理，豬細(xì)小病毒的收獲方便質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定，可顯著降低生產(chǎn)成本、提 高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖1本發(fā)明生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬細(xì)小病毒病毒液的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗材料1.細(xì)胞ST細(xì)胞(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。2.毒種豬細(xì)小病毒L株，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，微生物保藏號CGMCC No. 3352。3.微載體Cytodex-l，Pharmacia 公司產(chǎn)品。
4.試劑活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)，日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。實(shí)施例1 微載體的處理1.硅化取數(shù)ml硅油，將攪拌瓶內(nèi)壁浸濕，回收多余的硅油，烘干攪拌瓶后，用自 來水洗九次，雙蒸水洗三次，烘干備用。2.水化按培養(yǎng)的終體積稱取微載體適量，使微載體Cytodexl的終濃度為^ig/ ml，放入攪拌瓶中，用無Ca2+、Mg+2-PBS 100ml/g，室溫浸泡過夜或37°C浸泡!3hr，棄去PBS， 再用無Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g洗一次，棄去，最后加入無Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g，高壓滅菌， 115°C,IOpsi,15min。3.平衡棄去攪拌瓶中的PBS，加入高糖細(xì)胞生長液100ml/g，室溫過夜，臨用前再 用上述培養(yǎng)液洗一次。實(shí)施例2 生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞1、細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出ST細(xì)胞凍存管，迅速放入盛有36°C -37°C水中，搖 動凍存管，盡快解凍；用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入無菌離心管中，補(bǔ)加IOmL細(xì)胞生長液(含 5%小牛血清的MEM培養(yǎng)液)，吹打使細(xì)胞懸浮；將細(xì)胞懸液離心，IOOOrpm離心10分鐘，棄 上清；加入細(xì)胞生長液適當(dāng)稀釋后，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6小時后更換 細(xì)胞生長液一次，再繼續(xù)培養(yǎng)。2、細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取生長良好的致密單層ST細(xì)胞，吸出細(xì)胞生長液，用PBS洗 滌1-2次；再加入濃度為0. 25%的胰酶消化液，37°C消化5分鐘，待細(xì)胞層松散、細(xì)胞圓縮 時，吸出細(xì)胞消化液，加入少量細(xì)胞生長液吹打細(xì)胞，制成均勻細(xì)胞懸液，將適量細(xì)胞懸液 移入滅菌細(xì)胞瓶，每瓶補(bǔ)加適量生長液，置37°C恒溫培養(yǎng)，形成良好細(xì)胞單層時，用于繼續(xù) 傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。3、細(xì)胞毒種的繁殖用維持液(1%小牛血清的MEM培養(yǎng)液)將豬細(xì)小病毒L株毒 種按1-5%比例接種到步驟2形成的細(xì)胞單層培養(yǎng)，細(xì)胞70-100%病變時收獲病毒液；再將 此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上繼續(xù)進(jìn)行傳代復(fù)壯，作為生產(chǎn)種子。4、ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器(B. Braun公司， BiostatUD50生物反應(yīng)器)按總體積的50-70%加入無菌細(xì)胞生長液(5%小牛血清的MEM 培養(yǎng)液)，且每升無菌細(xì)胞生長液中按5-7g/L濃度加入微載體，啟動生物反應(yīng)器，40rpm攪 拌30min后，取步驟2中培養(yǎng)好的ST細(xì)胞單層，用EDTA-胰酶細(xì)胞消化液制備細(xì)胞懸液，細(xì) 胞計數(shù)后按IX IO5個/ml的密度接種到生物反應(yīng)器中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為SOrpm攪拌1_3分鐘， 再將轉(zhuǎn)速保持為50rpm，反應(yīng)器溫度逐步調(diào)整至37°C，反應(yīng)液的pH值控制為7. 0，一直保持 該條件進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。應(yīng)用活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)測定細(xì)胞活力，經(jīng)測定活細(xì)胞密度 彡lX107cells/mL，細(xì)胞活力彡90%。5、制苗毒液的繁殖接種后的第7天，微載體上的細(xì)胞長滿80-90%，空球率低于 5 %，滿球率大于85%，培養(yǎng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，且細(xì)胞計數(shù)達(dá)到IX Kfcells/mL以上； 此時，將罐體溫度調(diào)整為35°C，用正壓排出罐中液體，加入2L PBS洗滌細(xì)胞，攪拌10分鐘后 排出，重復(fù)洗滌2次。再用蠕動泵加入適量毒種，并補(bǔ)足維持液至工作體積。將步驟3中獲得的豬細(xì)小病毒病毒液以感染復(fù)數(shù)為0. 01M0I直接感染ST細(xì)胞，控 制攪拌速度為50-60rpm。接毒后每隔一定時間取生物反應(yīng)器中的微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測樣品TCID50 ；當(dāng)為載體上的細(xì)胞全部脫落，且OD值呈明顯上升趨勢，停 止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清和微載體。經(jīng)檢測，本實(shí)施收獲 的豬細(xì)小病毒TCID50彡IO8 0 ；作為對照，應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)豬細(xì)小病毒TCID50 ( 107_°。6、收獲病毒液的處理病毒液和微載體經(jīng)3次凍融后，離心去除細(xì)胞碎片， 置-20°C保存?zhèn)溆?。上述方案中，生物反?yīng)器參數(shù)調(diào)節(jié)1)溫度ST細(xì)胞增殖培養(yǎng)時控制溫度設(shè)定為37°C，接種PPV后控制溫度設(shè)定為 35 "C。2)pH值ST細(xì)胞增殖培養(yǎng)時控制pH設(shè)定為7. 0，接種病毒液后控制pH設(shè)定為7. 4。 PH波動為士0. 1。3)溶氧培養(yǎng)初期使用壓縮空氣調(diào)節(jié)溶氧值，控制溶氧設(shè)定為60%。溶氧波動為 士 10%;培養(yǎng)中后期，當(dāng)細(xì)胞密度大于IO6ceIlsAiL時，使用氧氣和氮?dú)庹{(diào)節(jié)溶氧值，控制溶 氧設(shè)定為50%。溶氧波動范圍為30%-80%。4)灌流量每天取樣測定罐體收集液的葡萄糖濃度，以葡萄糖殘余濃度為參考調(diào) 整液體的灌流量。實(shí)施例3 豬細(xì)小病毒病滅活苗的制備1、收獲病毒液毒價測定將實(shí)施例2中收獲的細(xì)胞病毒液混合后取樣，測定 毒價，收獲的豬細(xì)小病毒TCID50彡108_°;而應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)(對照)豬細(xì)小病毒 TCID50 ( IO7 002、滅活按病毒液總量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亞胺溶液，充分振蕩后， 于30°C、100r/min搖床上滅活72h，然后加入1 %硫代硫酸鈉溶液，終止滅活。并作無菌檢 驗及滅活檢驗。3、油佐劑滅活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁1. 5 份的比例配制油相；按照96ml抗原加入吐溫-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水 相；水相和油相按照1 1. 5比例進(jìn)行乳化，制成油包水單相苗。試驗例1生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬細(xì)小病毒病毒液的各工藝參數(shù)的 優(yōu)化試驗(1)攪拌速度對細(xì)胞貼壁的影響設(shè)置了 6組試驗試驗1組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為40rpm ；試驗2組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為50rpm ；試驗3組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為60rpm ；試驗4組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為SOrpm ；試驗5組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為IOOrpm ；
試驗6組將ST細(xì)胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應(yīng)器的微載體中進(jìn)行培 養(yǎng)，首先在轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為150rpm ；對6組的細(xì)胞貼壁情況進(jìn)行監(jiān)測，取樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果顯示，攪拌速度對細(xì)胞 貼壁影響很大，試驗2組(50rpm)最有利于細(xì)胞貼壁，當(dāng)攪拌速度達(dá)150rpm左右時，細(xì)胞幾 乎不貼壁。表1不同轉(zhuǎn)速的游離細(xì)胞數(shù)比較
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括(1)將豬細(xì)小病毒(Porcin印arvo viurs)弱毒株接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)得到生產(chǎn)種毒；(2)將處理后的微載體加入到生物反應(yīng)器 的細(xì)胞生長液中，攪拌；C3)將ST細(xì)胞接入到生物反應(yīng)器的微載體中，攪拌，進(jìn)行細(xì)胞的繁 殖培養(yǎng)；(4)將豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒感染生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞，進(jìn)行病毒的繁 殖培養(yǎng)；( 收獲繁殖的病毒液，滅活，配苗，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的豬細(xì)小病毒弱毒株是豬細(xì)小 病毒弱毒L株，其微生物保藏號是CGMCC No. 3352。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的微載體是Cyotdex 型系列微載體，優(yōu)選為Cytodex-I型微載體；所述的預(yù)處理方式包括硅化、水化和平衡。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟中將預(yù)處理后的微載體按 照每升細(xì)胞生長液中含有5_7g的微載體的配比比例加入到細(xì)胞生長液中。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟中所述的攪拌速度為 40rpm ；所述的攪拌時間為20_40min，優(yōu)選為30min。
6.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟⑶中所述的攪拌包括首先在 轉(zhuǎn)速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為50_60rpm ；優(yōu)選的，在轉(zhuǎn)速為SOrpm 的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉(zhuǎn)速調(diào)整為50rpm。
7.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)采用灌注培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞 的繁殖培養(yǎng)，包括將培養(yǎng)溫度逐步調(diào)整至37°C，培養(yǎng)液的pH值控制為7. O。
8.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟中將豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒 以感染復(fù)數(shù)為0. 001M0I、0. 01M0I、0. 05M0I感染生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)；優(yōu)選的，步驟(4)中將豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒以感染復(fù)數(shù)為0. OlMOI感染生物反應(yīng)器中懸 浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞，攪拌，采用灌注培養(yǎng)法進(jìn)行病毒的繁殖培養(yǎng)。
9.按照權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟中所述的灌注培養(yǎng)溫度為 350C，培養(yǎng)液的pH值為7. 4，所述的攪拌速度為50-60rpm。
10.權(quán)利要求1-9任何一項制備方法制備得到的豬細(xì)小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括(1)將豬細(xì)小病毒弱毒株接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)得到生產(chǎn)種毒；(2)將處理后的微載體加入到生物反應(yīng)器中的細(xì)胞生長液中，攪拌；(3)將ST細(xì)胞接入到生物反應(yīng)器中的微載體中進(jìn)行細(xì)胞的繁殖培養(yǎng)；(4)將豬細(xì)小病毒生產(chǎn)種毒感染生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖培養(yǎng)；(5)收獲繁殖的病毒液，滅活，配苗，即得。本發(fā)明方法細(xì)胞維持時間長，細(xì)胞活力高、活細(xì)胞密度大，有利于病毒的持續(xù)繁殖，所制備的病毒液病毒滴度高。本發(fā)明方法的生產(chǎn)過程銜接緊密、順暢，規(guī)模放大容易，豬細(xì)小病毒的收獲方便，質(zhì)量穩(wěn)定，可顯著降低生產(chǎn)成本、有效提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號A61P31/20GK102091329SQ201110032529
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者任德強(qiáng), 姜力, 張婷婷, 張明艷, 張智明, 戴秀莉, 柴華, 武佳斌, 王彬, 王琪, 藏玉婷 申請人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司