使用酸處理的乳清蛋白提取物水溶液治療過(guò)敏癥的制作方法

專利名稱：使用酸處理的乳清蛋白提取物水溶液治療過(guò)敏癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳清蛋白提取物的制造，涉及嬰兒配方奶粉并且涉及減少或預(yù)防食物過(guò)敏。
背景技術(shù)：
不用母乳喂養(yǎng)的嬰兒必須依靠嬰兒配方奶粉作為他們的營(yíng)養(yǎng)素來(lái)源，并且用來(lái)確保正常生長(zhǎng)和發(fā)育。嬰兒配方奶粉通?；谂Ｄ獭Ｈ欢蠹s2%至3%的嬰兒對(duì)于牛奶中的蛋白質(zhì)的具有過(guò)敏癥。雖然存在著許多調(diào)節(jié)針對(duì)過(guò)敏原的免疫應(yīng)答的因子，在嬰兒中的Thl/Th2平衡在免疫發(fā)育中是重要的，然而嬰兒配方奶粉在促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制并且驅(qū)動(dòng)Thl和Th2分化的細(xì)胞因子方面是缺乏的。同樣地，對(duì)于促進(jìn)適當(dāng)免疫應(yīng)答和發(fā)育的膳食補(bǔ)充劑、食品或嬰 兒配方奶粉存在著需要。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中提供了ー種用于從含乳清蛋白的組合物生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法，該方法包括使含乳清蛋白的組合物與ー種水溶液接觸，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一種樣品；從該樣品回收含可溶性蛋白的成分；酸化該含可溶性蛋白的成分；由此形成乳清蛋白提取物。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種用于從含乳清蛋白的溶液生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法，包括將在含乳清蛋白的溶液中的可溶性乳清蛋白從不溶性乳清蛋白分離出來(lái)；酸化該可溶性乳清蛋白；由此形成乳清蛋白提取物。在另ー實(shí)施方案中，提供了包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在某些實(shí)施方案中，該提取物是根據(jù)以上說(shuō)明的方法生產(chǎn)的。在其他實(shí)施方案中，提供了包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液用于制造嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品的用途。在相關(guān)實(shí)施方案中，提供了包括乳清蛋白提取物的嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品，該乳清蛋白提取物包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液。在另外的實(shí)施方案中，提供了包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物用于制造預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的藥物的用途。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的方法，包括以下步驟向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在另外的實(shí)施方案中，提供了ー種用于減少在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的TNF或IL-2釋放的方法，包括向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步驟。
仍然在另外的實(shí)施方案中，提供了ー種用于增加在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的IL-18釋放的方法，包括向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步驟。仍然在另外的實(shí)施方案中，提供了ー種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的腸上皮細(xì)胞屏障功能的方法，包括向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步驟。仍然在另外的實(shí)施方案中，提供了ー種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的Thl免疫應(yīng)答的方法，包括向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步驟。在另ー實(shí)施方案中，提供了一種用于使在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的Th2免疫應(yīng)答降至最低程度的方法，包括向個(gè)體提供包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步驟。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I.在用提取物(123)治療之后從RAW細(xì)胞的TNF-α釋放的抑制。圖2.在用提取物(123)治療之后從THP-I細(xì)胞的IL-18釋放的增強(qiáng)。圖3.在用提取物(123)治療之后從初級(jí)⑶4+Τ細(xì)胞的IL_2釋放的抑制。圖4.提取物(123)對(duì)CD4T細(xì)胞的IL_2釋放的影響。圖5.在⑶3和⑶28刺激作用之后提取物(123)(酸化的或中性的)對(duì)⑶4T細(xì)胞的IL-2釋放的影響。圖6.在用中性的或酸化的提取物(123)或乳鐵蛋白治療之后T84細(xì)胞的跨上皮電阻。圖7.在用中性的(123-中性的)或酸活化的(123-酸化的)的提取物治療之后T84細(xì)胞的跨上皮電阻。圖8.在用以1/8或1/12稀釋到配方中或作為3次/天的快速推注給藥的提取物(123)治療之后的血清IgE。圖9.在用以1/8或1/12稀釋到配方中或作為3次/天的快速推注給藥的提取物
(123)治療之后的BLG特異性IgGl濃度(包括離群值，用X表示)。

圖10.在用以1/8或1/12稀釋到配方中或作為3次/天的快速推注給藥的提取物(123)治療之后的血清RMCPII濃度。圖11.在用以1/8或1/12稀釋到配方中或作為3次/天的快速推注給藥的提取物(123)治療之后的肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)/mm2固有層。圖12.在用以1/8或1/12稀釋到配方中或作為3次/天的快速推注給藥的提取物(123)治療之后的在腸中的IL-IO(A)、IFN-Y (B)和IL_4(C)。圖13.斷奶研究血清BLG特異性IgGl (A)、IgE⑶和RMCPII (C)。在第4天開(kāi)始用提取物(123)并且在第14天開(kāi)始ロ服BLG的強(qiáng)飼法。實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明將會(huì)理解的是，在本說(shuō)明書(shū)中披露和限定的本發(fā)明涉及兩個(gè)或更多個(gè)從正文或附圖提到的或顯而易見(jiàn)的個(gè)體特征的所有可替代組合。所有這些不同組合都構(gòu)成本發(fā)明的不同替代方面?，F(xiàn)在將詳細(xì)地參考本發(fā)明的某些實(shí)施方案。雖然將結(jié)合這些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，將會(huì)理解的是并不g在將本發(fā)明限制于那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明g在覆蓋所有替代方案、修改、和等效物，它們都可以包括在如通過(guò)權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到類似或等價(jià)于在此說(shuō)明的那些的許多方法和材料，這些都可以在實(shí)踐本發(fā)明中使用。絕非將本發(fā)明局限于所說(shuō)明的這些方法和材料。將會(huì)理解的是，在本說(shuō)明書(shū)中披露和限定的本發(fā)明涉及兩個(gè)或更多個(gè)從正文或附圖提到的或顯而易見(jiàn)的個(gè)體特征的所有可替代組合。所有這些不同組合都構(gòu)成本發(fā)明的不同替代方面。如在此所使用的，除非在上下文另外要求的地方，術(shù)語(yǔ)“包括”(comprise)和該術(shù)語(yǔ)的變化，例如“包括”(〃comprising〃)、“包括”(comprises)和“包括”("comprised")并不旨在排除其他添加劑、成分、整體或步驟。本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，處于酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的形式的乳清蛋白提取物具有免疫調(diào)節(jié)特性。特別是，在此說(shuō)明的體外研究顯示，提取物(另外稱為“123”)増加了是Thl應(yīng)答的特征的生物標(biāo)記，而使Th2應(yīng)答的標(biāo)記降至最低。具體地，這些體外研究顯示，該提取物減少了⑶4+T細(xì)胞的IL-2分泌，并且增加了 IL-18和TNF分泌。重要的是，這些研究顯示該提取物增強(qiáng)了腸的屏障功能。另外，針對(duì)以上情況，在此的體內(nèi)研究顯示，在配方奶喂養(yǎng)過(guò)敏癥傾向的個(gè)體中，該提取物使總血清IgE、抗BLG IgGl和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)降至最低。仍進(jìn)一歩地，在此的體內(nèi)研究顯示，在過(guò)敏癥傾向個(gè)體的斷奶期間，該提取物使總血清IgE降至最低。這些發(fā)現(xiàn)證明在過(guò)敏癥傾向個(gè)體中該提取物在配方奶喂養(yǎng)和斷奶期間在免疫調(diào)節(jié)中的效用?？梢酝ㄟ^(guò)ー種方法生產(chǎn)包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物，該方法涉及含乳清蛋白的組合物的溶解和該組合物的可溶性成分的水溶液的酸化。因此在某些實(shí)施方案中，提供了 ー種用于從含乳清蛋白的組合物生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法。該方法包括以下步驟使含乳清蛋白的組合物與ー種水溶液接觸，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一種樣品；從該樣品回收該含可溶性蛋白的成分； 酸化該含可溶性蛋白的成分；由此形成乳清蛋白提取物。在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)ー種方法生產(chǎn)乳清蛋白提取物，在該方法中將ー種可溶性乳清水溶液(例如液態(tài)乳清)酸化。因此在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種用于從含乳清蛋白的溶液生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法，包括將在含乳清蛋白的溶液中的可溶性乳清蛋白從不溶性乳清蛋白分離出來(lái)；酸化該可溶性乳清蛋白；由此形成乳清蛋白提取物。以上說(shuō)明的方法可以包括ー個(gè)另外的中和酸化的可溶性乳清蛋白的步驟。、
“乳清”通常是在奶凝固時(shí)與凝乳形成一起形成的漿液或水樣部分。典型地，乳清是在乳酪生產(chǎn)中當(dāng)形成凝乳時(shí)形成的。乳清富含乳糖、礦物和維生素，并且含有乳白蛋白和痕量的脂肪。乳清可以形成自哺乳動(dòng)物奶，優(yōu)選是牛奶、山羊奶或綿羊奶，更優(yōu)選是牛奶?！叭榍宓鞍住蓖ǔＪ窃谌榍逯邪l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。可以被提供為固體、液體或濃縮物的形式。一種“含乳清蛋白的組合物”通常是包括乳清蛋白的組合物。在一些實(shí)施方案中，含乳清蛋白的組合物由乳清蛋白組成。在這些實(shí)施方案中，雖然該組合物可以包括其他非蛋白成分，例如碳水化合物和脂肪，但是該組合物基本上缺乏未發(fā)現(xiàn)于乳清中的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括乳清蛋白濃縮物(WPC)和乳清蛋白分離物(WPI)。在此將進(jìn)一步說(shuō)明WPC和WPI以及用于生產(chǎn)這些組合物的方法。在其他實(shí)施方案中，含乳清蛋白的組合物包括通常未發(fā)現(xiàn)于乳清中的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括酪蛋白?？梢耘c乳清蛋白一起添加其他的這些蛋白質(zhì)以形成含乳清蛋白的組合物?？商娲兀?dāng)該組合物形成時(shí)，這些蛋白質(zhì)被可以被包括在含乳清蛋白的組合物中。隨后形成的組合物的實(shí)例包括奶和奶制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，含乳清蛋白的組合物可以富集乳清蛋白。例如，可以添加乳清蛋白至含乳清蛋白的組合物中以增加在該組合物中的乳清蛋白的相對(duì)豐度。在其他實(shí)施方案中，可以從含乳清蛋白的組合物中除去非乳清蛋白、或其他非蛋白成分，從而增加在該組合物中的乳清蛋白的相對(duì)豐度。在此進(jìn)ー步說(shuō)明了包括過(guò)濾在內(nèi)的用于富集乳清蛋白的方法的實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以針對(duì)含乳清蛋白的組合物中的特定蛋白種類進(jìn)行富集。感興趣的特定蛋白種類是具有在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用的那些，并且特別是對(duì)最小化或預(yù)防過(guò)敏癥有用的蛋白。實(shí)例包括傾向于優(yōu)先于Th2應(yīng)答而介導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。ー個(gè)實(shí)例是TGF-β。在一個(gè)實(shí)施方案中，含乳清蛋白的組合物可以包括誘導(dǎo)對(duì)哺乳動(dòng)物在斷奶時(shí)新引入的膳食蛋白的耐受性有用的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物的蛋白成分可以是部分或廣泛水解的。一種“含部分水解的乳清蛋白的組合物”通常含有具有通常小于5000d的分子量的寡肽。一種“含廣泛水解的乳清蛋白的組合物”通常含有具有小于3000d的分子量的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物可以含有生理學(xué)上可接受的鹽、pH緩沖劑、防腐劑或抗微生物劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物包括ー種或多種甜乳清、酸乳清、低乳糖乳清、脫礦物乳清(demineralised whey)、WPC 或 WPI。“甜乳清”可以源于乳酪的制造，例如已經(jīng)巴斯德滅菌的并且未添加防腐劑的切達(dá)干酪、莫扎里拉乳酪和瑞士乳酪。甜乳清粉通常含有新鮮乳清的所有成分，除了處于相同的相對(duì)比例的水以外。典型地，甜乳清粉含有大約11%_14. 5%的蛋白質(zhì)、大約63%至75%的乳 糖、大約1%至I. 5%的脂肪、大約8. 2%至8. 8%的灰分以及大約3. 5%至5%的水分?！八崛榍濉笨梢栽从谌槔业闹圃?，例如已經(jīng)巴斯德滅菌的并且未添加防腐劑的農(nóng)家干酪(cottage)、奶油干酪和瑞可達(dá)乳酪(ricotta)。酸乳清粉含有原酸乳清的所有成分，除了處于相同的相對(duì)比例的水以外。典型地，酸乳清粉含有大約11%-13. 5%的蛋白、大約61%至70%的乳糖、大約O. 5%至I. 5%的脂肪、大約9. 8%至12. 3%的灰分以及大約3. 5%至5%的水分。在此說(shuō)明的本發(fā)明中，可以在使用前中和酸乳清。可以通過(guò)從乳清中選擇性除去或水解乳糖而獲得“低乳糖乳清”。干產(chǎn)品的乳糖含量可以不超過(guò)60%?？梢酝ㄟ^(guò)物理分離技術(shù)(例如沉淀或過(guò)濾)或酶水解乳糖為葡萄糖和半乳糖來(lái)完成乳糖的降低。可以通過(guò)添加安全并且適合的成分來(lái)調(diào)整低乳糖乳清的酸性。典型地，低乳糖乳清粉含有大約18%-24. 0%的蛋白、大約52%至58%的乳糖、大約1%至4%的脂肪、大約11%至22%的灰分以及大約3%至4%的水分。通過(guò)從巴斯德滅菌的乳清中除去一部分的礦物而獲得“脫礦物乳清”(也稱為“低礦物乳清”)。典型的脫礦物水平為25%、50%和90%。干產(chǎn)品的灰分可以不超過(guò)7%。可以通過(guò)分離技術(shù)(例如離子交換、滲濾或電滲析)來(lái)生產(chǎn)脫礦物乳清?？梢酝ㄟ^(guò)添加安全并且適合的成分來(lái)調(diào)整脫礦物乳清的酸性。WPC是具有特定蛋白量的乳清的濃縮物。通常，WPC34指定ー種具有不小少于34% 的蛋白質(zhì)的濃縮物，WPC50指定ー種具有不少于50%的蛋白質(zhì)的濃縮物，WPC60指定ー種具有不少于60%的蛋白質(zhì)的濃縮物，WPC75指定ー種具有不少于75%的蛋白質(zhì)的濃縮物，并且WPC80指定ー種具有不少于80%的蛋白質(zhì)的濃縮物?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法形成這些濃縮物超濾巴斯德滅菌的乳清，回收滲余物，隨后噴霧干燥該滲余物以形成WPC34和WPC50粉；或者滲濾該滲余物，隨后濃縮和噴霧干燥以形成WPC50、WPC60、WPC75或WPC80。通過(guò)從乳清中除去足夠的非蛋白成分而獲得WPI，這樣干成品含有不少于90%的蛋白質(zhì)。通過(guò)膜分離過(guò)程或離子交換來(lái)生產(chǎn)WPI。在一個(gè)實(shí)例中，使巴斯德滅菌的流體乳清經(jīng)受微孔過(guò)濾，導(dǎo)致脂類的去除，然后施用滲濾以形成一種滲透物以及乳清蛋白分離物，進(jìn)而使后者濃縮和噴霧干燥以形成WPI粉。在另ー實(shí)例中，使巴斯德滅菌的的流體乳清經(jīng)受離子交換蛋白質(zhì)分離，生成脫蛋白乳清，并且然后使吸附的乳清蛋白解吸附，使其經(jīng)受超濾或進(jìn)ー步的離子交換，以除去礦物。然后使如此形成的乳清蛋白分離物經(jīng)受濃縮和噴霧干燥以形成WPI粉。在一個(gè)實(shí)施方案中，在含乳清蛋白的組合物中的蛋白質(zhì)的量是基于干重計(jì)至少大約 10%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量大約是10%至小于約90%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約11%至大約25%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約11%至大約18%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約18%至大約25%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約34%至大約80%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約50%至大約75%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約50%至大約60%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約60%至大約75%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的量是大約90%至大約95%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，含乳清蛋白的組合物包括碳水化合物(例如乳糖)和脂肪中的至少ー種。在一個(gè)實(shí)施方案中，在含乳清蛋白的組合物中的乳糖的量是基于干重計(jì)至少大約l%w/w0在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約1%至小于大約80%。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約63%至大約75%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約61%至大約70%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖量為約52%至約58%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約70%至大約80%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約48%至大約52%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約33%至大約37%w/w。
在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約25%至大約30%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約10%至大約15%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約4%至大約8%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳糖的量是大約O. 5%至大約I. 0%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，在含乳清蛋白的組合物中的脂肪的量是基于干重計(jì)至少大約O. 5%w/w0在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪的量是大約O. 5%至小于大約10%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪的量是大約1%至大約5%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪的量是大約5%至大約7%w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物包括大約80%w/w至82%w/w的蛋白質(zhì)、大約4%w/w至8%w/w的乳糖以及大約4%w/w至8%w/w的脂肪。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物是ー種WPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，該WPC是WPC80。其他WPC包括WPC34、WPC50、WPC60和 WPC75。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物被提供為ー種與水溶液接觸的粉末形式?！八芤骸?，也稱為“水溶剤”，是可以用于完全或部分溶解乳清蛋白的一種水基成分。該水溶液可以是水，包括純化的、蒸餾過(guò)的或殺菌的水。該水溶液可以含有生理學(xué)上可接受的鹽。這些含鹽溶液的實(shí)例包括鹽水。該水溶液可以含有PH緩沖劑或防腐劑或抗微生物劑?！昂扇苄缘鞍壮煞值乃芤骸被颉安糠帧蓖ǔＪ呛型耆虿糠秩芙庠谠撍軇┲械牡鞍踪|(zhì)的樣品的成分或部分。這還可以稱為“含溶解的蛋白的成分的水溶液”或“含溶解的蛋白的部分的水溶液”。完全溶解于水溶劑中的蛋白質(zhì)傾向于是采取在溶液中的構(gòu)象的那些蛋白質(zhì)，由此疏水性或非極性側(cè)鏈和基團(tuán)被埋在不與溶液接觸的蛋白質(zhì)內(nèi)，而極性或親水性側(cè)鏈被暴露在蛋白質(zhì)表面用干與溶劑接觸。部分溶解于水溶劑中的蛋白質(zhì)可以采取在溶液中的構(gòu)象，由此ー些疏水性側(cè)鏈或基團(tuán)在蛋白質(zhì)表面上暴露于溶剤。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用于增強(qiáng)含溶解的蛋白的成分的形成的條件下，使該含乳清蛋白的組合物與水溶液接觸。例如，可以使用已知的方法攪拌或攪動(dòng)溶液與組合物的混合物。可以調(diào)節(jié)溫度以增強(qiáng)完全或部分溶解?？梢蕴砑萤`種或多種有助于溶解的試劑到該混合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該含乳清蛋白的組合物是以至少大約O. 5%w/w的含乳清蛋白的組合物的量提供的，用干與水溶液接觸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以大約O. 5%至10%w/w的量提供該含乳清蛋白的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，以大約O. 5%至7%w/w的量提供該含乳清蛋白的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，以大約5%至6%w/w的量提供該含乳清蛋白的組合物。雖然在該成分中還可以存在其他源于奶的蛋白質(zhì)，典型地完全或部分溶解于該成分中的蛋白質(zhì)是乳清蛋白，這取決于形成用于該方法的起始或進(jìn)料材料的含乳清蛋白的組合物。
在該方法中形成的“不溶性成分”成分通常含有蛋白質(zhì)、脂肪或灰分。通常，在攪拌、攪動(dòng)該水溶液或調(diào)節(jié)它的溫度吋，不溶性成分是不溶解的。通常，當(dāng)以每溶液量較大的組合物量提供該含乳清蛋白的組合物時(shí)，形成較大量的不溶性成分。通常，該不溶性成分具有膏狀質(zhì)地以及白色或帶白色的顔色。通常，該不溶性成分沉降在容器的底部，其中該含乳清蛋白的成分與水溶劑接觸。可以通過(guò)或不通過(guò)離心作用發(fā)生沉降。通過(guò)從不溶性固體分離含溶解的蛋白的成分，來(lái)回收含溶解的蛋白的成分。通常，基本上回收了所有的含溶解的蛋白的成分。在一些實(shí)施方案中，從不溶性固體分離了基本上所有含溶解的蛋白的成分。雖然不希望局限于假設(shè)，人們認(rèn)為從可溶性成分水溶液中分離不溶性成分是重要的，因?yàn)榍罢呖赡芎幸种芓hl免疫應(yīng)答或破壞屏障功能的分子。該分離過(guò)程可以是ー個(gè)單步或多步過(guò)程。在用于分離完全或部分可溶性部分(例如從固體分離上清液)的乳制品加工中已知的許多技術(shù)都可以用來(lái)從不溶性固體分離含溶解的蛋白的成分。實(shí)例包括傾析、離心、色譜法(離子交換、凝膠過(guò)濾、HPLC (高效液相色譜法)、RP-HPLC (反相高效液相色譜法)、親和色譜法)、電滲析、過(guò)濾或吸附。典型地，通過(guò)對(duì)含溶解的蛋白的成分提供至少大約2. 5、優(yōu)選大約3至6. O、更優(yōu)選大約3. O至5. 5、3. 5至5. O的pH來(lái)酸化該含溶解的蛋白的成分。同時(shí)不希望局限于假設(shè)，認(rèn)為該酸化步驟通過(guò)除去LAP肽，活化了在該水溶性成分中的TGF β。將會(huì)理解的是，該酸化步驟是在從樣品回收該含溶解的蛋白的成分之前進(jìn)行的，雖然典型地在將ー種酸提供至該含溶解的蛋白的成分的情況下該酸化步驟是在回收之后進(jìn)行的。因此，提供了ー種用于從含乳清蛋白的組合物生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法，依次包括以下步驟使含乳清蛋白的組合物與ー種水溶液接觸，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一種樣品；從該樣品回收含可溶性蛋白的成分；酸化該含可溶性蛋白的成分；由此產(chǎn)生乳清蛋白提取物。典型地，通過(guò)對(duì)該含溶解的蛋白的成分提供大約6. 5至7. 5、優(yōu)選大約7的pH來(lái)中和該含溶解的蛋白的成分。該中和步驟可以在從該樣品回收含溶解的蛋白的成分之前進(jìn)行，雖然通常該中和步驟是在已經(jīng)從該樣品回收含溶解的蛋白的成分并且將其酸化之后進(jìn)行的。可以按液體或固體形式提供以上說(shuō)明的乳清蛋白提取物。典型地，它被提供為固體形式例如粉末。因此在某些實(shí)施方案中，以上說(shuō)明的方法包括另外的干燥含溶解的蛋白的成分的步驟，從而獲得ー種粉末。適合的干燥方法對(duì)于技術(shù)人員而言是熟知的。例如蒸發(fā)，包括真空濃縮、噴霧干燥、滾筒干燥以及轉(zhuǎn)鼓式干燥。可以在使用之前進(jìn)ー步加工或改性包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物，包括通過(guò)如以上說(shuō)明的方法所形成的這種提取物?？梢詰?yīng)用以下過(guò)程或改性中的任何ー種□富集、濃縮或分級(jí)分離乳清蛋白，例如使用在此進(jìn)ー步討論的膜過(guò)濾技木；□酶水解，用來(lái)部分或廣泛水解包含在提取物中的蛋白質(zhì)?！醭サV物或灰分，例如使用在此進(jìn)ー步討論的電滲析技術(shù)；□使用在此進(jìn)ー步討論的色譜法或結(jié)晶技術(shù)除去非蛋白成分；□添加免疫調(diào)節(jié)分子，例如TGF-β ；□添加對(duì)誘導(dǎo)對(duì)斷奶期間新接收的膳食蛋白的耐受性有用的肽抗原；□進(jìn)一歩干燥；□顆粒的篩分。包括反滲透、納濾、超濾和微量過(guò)濾的膜技術(shù)可以涉及使用半透膜的壓カ驅(qū)動(dòng)分離，由此泵和閥的組合產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)乳清中的較小的分子跨過(guò)該膜的跨膜壓カ梯度，從而濃縮不能跨該膜的較大的分子和顆粒。使用具有不同孔徑大小或截留分子量的膜可以實(shí)現(xiàn)選擇性分離或濃縮。膜的實(shí)例包括在反滲透(RO)、納濾(NF)、超濾(UF)和微量過(guò)濾(MF)中使用的那些。FR膜具有最小的孔并且只允許水跨過(guò)該膜，同時(shí)保留乳清的所有其他成分。RO膜的一個(gè)常見(jiàn)用途是水的除鹽處理。通常根據(jù)它們截除鹽的能力將這些膜定級(jí)。就像真空濃縮一祥，RO系統(tǒng)并不改變?nèi)榍逯械墓腆w成分的比率，而是通過(guò)僅僅除去水來(lái)濃縮固體成分。隨著水被除去，通過(guò)增加粘度和滲透壓來(lái)限制根據(jù)RO的乳清濃度的范圍。納濾膜有時(shí)也被稱為“松散的” RO膜。NF膜允許ー些一價(jià)離子連同水一起跨膜，導(dǎo)致乳清的部分“脫鹽”。因?yàn)橹怀チ司哂袉坞姾傻牡V物，所以NF膜只是略微降低了乳清的礦物含量。NF膜可以用來(lái)減小一些類型的乳清的氯化鈉含量。超濾膜具有比RO或NF膜更大的孔。UF膜使乳糖和灰分滲過(guò)，同時(shí)保留乳清中的蛋白質(zhì)，由此使UF膜是用于生產(chǎn)WPC的標(biāo)準(zhǔn)工具。除去的乳糖和灰分的量越大，WPC的蛋白質(zhì)含量就越高。由于乳清的粘度隨著蛋白濃縮物的增加而增加，在一種被稱為滲濾的方法中，在生產(chǎn)具有大于50%蛋白質(zhì)的WPC時(shí)將水添加至滲余物中將另外的量的乳糖和礦物洗去是必需的。微量過(guò)濾膜具有膜分離過(guò)程中最大的孔。較小的可溶性蛋白、肽、乳糖、礦物、非蛋白氮成分、以及水都易于滲過(guò)MF膜。脂肪球被MF膜保留，因此這些膜可以用來(lái)除去少量的通過(guò)離心未回收的脂肪。必須除去痕量的脂肪來(lái)生產(chǎn)WPI。電滲析也使用半透膜，然而，電流取代了作為分離分離乳清成分的驅(qū)動(dòng)カ的壓力。電滲析膜只允許礦物滲透，同時(shí)保留乳糖和蛋白。電流將帶電荷的礦物離子拖過(guò)膜而進(jìn)入鹽水流。乳糖并不受電流影響，而蛋白不能跨膜。電滲析并不使乳清蛋白變性，同時(shí)除去了乳清中高達(dá)75%的礦物。、
離子交換是色譜法的ー種類型。例如，在生產(chǎn)脫礦物的乳清時(shí)，使乳清通過(guò)含有結(jié)合乳清中的離子(帶電荷的礦物)的吸收珠粒的柱子。使乳清成分的剩余物(例如蛋白質(zhì)和乳糖)不受阻礙地通過(guò)該柱子。因此，與未處理的乳清相比，生成的乳清具有降低量的礦物。離子交換并不使蛋白質(zhì)變性，并且可以除去乳清中高達(dá)98%的礦物。
色譜法使用帶電荷的樹(shù)脂將乳清中的蛋白質(zhì)從其他成分中分離出來(lái)。這些蛋白質(zhì)與相反電荷的樹(shù)脂結(jié)合，同時(shí)像乳糖這樣的成分并不結(jié)合并且因此直接通過(guò)該系統(tǒng)。在乳清已經(jīng)通過(guò)含有樹(shù)脂的柱子或槽之后，驅(qū)使ー種緩沖劑通過(guò)該系統(tǒng)，以釋放結(jié)合的蛋白質(zhì)。可以進(jìn)ー步通過(guò)UF來(lái)純化這些蛋白質(zhì),進(jìn)而噴霧干燥。色譜法還可以用來(lái)將特殊蛋白質(zhì)從乳清中的其他蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。在針對(duì)甜乳清的典型PH下，乳鐵蛋白和乳過(guò)氧化物酶是帶正電荷的。在相同pH下，乳清的主要蛋白質(zhì)，α-乳清蛋白、β_乳球蛋白和牛血清白蛋白是帶負(fù)電荷的。在乳清通過(guò)含負(fù)電荷樹(shù)脂的槽吋，帶正電的乳鐵蛋白和乳過(guò)氧化物酶與樹(shù)脂結(jié)合，同時(shí)其他蛋白質(zhì)和乳清組合物通過(guò)該柱子。然后驅(qū)使一種堿性溶液通過(guò)該柱子，用來(lái)從樹(shù)脂釋放結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后可以洗滌和噴霧干燥回收的蛋白質(zhì)。使用結(jié)晶來(lái)生產(chǎn)乳糖或非吸濕性乳清/滲透物粉。通過(guò)蒸發(fā)將乳清或滲透物濃縮到至少50%的總固體，其中乳糖是過(guò)飽和的，這樣使得隨著濃縮的乳清/滲透物冷卻，乳糖將易于結(jié)晶。在乳清/滲透物已經(jīng)充分冷卻之后，可以除去乳糖晶體，用于進(jìn)一歩加工成高質(zhì)量乳糖，或者可以干燥具有結(jié)晶乳糖的乳清/滲透物溶液，是產(chǎn)生非吸濕乳清/滲透物粉。一種酶，β_半乳糖苷酶，可以被添加至乳清，用來(lái)水解ニ糖乳糖為它的單糖成分，葡萄糖和半乳糖。時(shí)間和溫度被用來(lái)控制乳糖水解的程度。蛋白酶是被添加至乳清用來(lái)水解這些蛋白質(zhì)的酶。添加的蛋白酶的類型、時(shí)間和溫度被用來(lái)控制蛋白質(zhì)水解的類型和程度。原則上，通過(guò)水解的蛋白質(zhì)修飾與聚合反應(yīng)是相反的。蛋白酶是用來(lái)切割蛋白質(zhì)分子的肽鍵從而生成更小的肽和多肽的最常見(jiàn)的酶組。水解度，即乳清蛋白被水解達(dá)到的程度，將影響作為食品成分的水解產(chǎn)物的功能特性。可以通過(guò)加熱使乳清蛋白變性，以改變它們的功能特性。時(shí)間和溫度的組合被用來(lái)控制乳清蛋白變性的量。通常在預(yù)加熱處理過(guò)程中完成控制變性?？梢酝ㄟ^(guò)乳清蛋白氮指數(shù)來(lái)測(cè)量未變性的乳清蛋白的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了以上說(shuō)明的提取物用于制造嬰兒配方奶粉、后續(xù)配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品的用途。嬰兒配方奶粉通常是代替母乳的給予新生個(gè)體的營(yíng)養(yǎng)組合物?？梢越o予嬰兒配方奶粉到大約4至6月齡。后續(xù)配方奶粉通常是給予從大約6個(gè)月齡或更大的個(gè)體的營(yíng)養(yǎng)組合物?？梢允褂萌魏芜m合的方式制備該配方。例如，它可以通過(guò)將在此說(shuō)明的乳清蛋白提取物與其他營(yíng)養(yǎng)成分(例如碳水化合物源、或脂肪源)一起以適當(dāng)比例共混在一起來(lái)制備。如果使用，在這一點(diǎn)上可以包括乳化剤。在這一點(diǎn)上，可以添加其他成分(例如免疫調(diào)節(jié)分子、維生素和礦物質(zhì))，但是通常稍后添加以避免熱降解。在共混之前，可以將任何親脂性維生素、乳化劑以及類似物溶解在脂肪源中。然后可以混入水(優(yōu)選是已經(jīng)經(jīng)受反滲透的水)來(lái)形成液體混合物。合宜地水的溫度是大約50°C至大約80°C，用來(lái)輔助這些成分的分散。可以使用可商購(gòu)的液化劑來(lái)形成該液體混合物。然后使液體混合物均質(zhì)化，例如分兩個(gè)階段。然后可以熱處理該液體混合物以減少細(xì)菌負(fù)荷，例如通過(guò)在大約80°C至大約1500C的范圍內(nèi)的溫度迅速加熱該液體混合物持續(xù)大約5秒至大約5分鐘。這可以通過(guò)蒸汽噴射、高壓釜或通過(guò)熱交換器(例如板式熱交換器)來(lái)進(jìn)行。然后可以冷卻該液體混合物至大約60°C至大約85°C，例如通過(guò)閃蒸冷卻。然后可以再次使該液體混合物均質(zhì)化，例如分兩個(gè)階段，在第一階段在大約IOMPa至大約30MPa，在第二階段在大約2MPa至大約lOMPa。然后進(jìn)ー步冷卻該均質(zhì)化的混合物，以添加任何熱敏成分，例如維生素和礦物質(zhì)。在這一點(diǎn)上，合宜地調(diào)整均質(zhì)化的混合物的PH和固體含量。將均質(zhì)化的混合物轉(zhuǎn)移至適合的干燥器中，例如噴霧干燥器或冷凍干燥器，并且將其轉(zhuǎn)化為粉末。該粉末應(yīng)當(dāng)具有按重量計(jì)小于大約5%的含濕量。
如果優(yōu)選液體產(chǎn)品，可以將均質(zhì)化的混合物殺菌，然后無(wú)菌地填充到適合的容器中。在其他實(shí)施方案中，可以用ー種方式處理產(chǎn)品來(lái)延長(zhǎng)保質(zhì)期，例如通過(guò)熱處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括以上說(shuō)明的提取物的嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品。配方奶粉可以含有碳水化合物源。雖然優(yōu)選的碳水化合物源是乳糖，但是可以使用常規(guī)發(fā)現(xiàn)于嬰兒配方奶粉中的任何碳水化合物源，例如乳糖、蔗糖、麥芽糊精、淀粉和它們的混合物。優(yōu)選地，碳水化合物源構(gòu)成了在35%與65%之間的配方的總能量。根據(jù)本發(fā)明的后續(xù)配方奶粉可以含有脂質(zhì)源。該脂質(zhì)源可以是適合在嬰兒配方奶粉中使用的任何脂質(zhì)或脂肪。優(yōu)選的脂肪源包括棕櫚油精、高油酸葵花子油和高油酸紅花油。還可以添加必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸，如可能是少量含有大量預(yù)形成的花生四烯酸和二十ニ碳六烯酸的油，例如魚(yú)油或微生物油。總體上，含脂量?jī)?yōu)選例如構(gòu)成30%至55%的配方的總能量。脂肪源優(yōu)選具有大約5:1至大約15:1的η-6與η_3脂肪酸的比率，例如大約8:1至大約10:1。后續(xù)配方奶粉還可以含有被了解為在日常飲食中必需的并且處于營(yíng)養(yǎng)顯著量的所有維生素和礦物質(zhì)。已經(jīng)確立了對(duì)于某些維生素和礦物質(zhì)的最低需求。任選地存在于嬰兒配方奶粉中的礦物質(zhì)、微生物和其他營(yíng)養(yǎng)素的實(shí)例包括維生素Α、維生素BI、維生素Β2、維生素Β6、維生素Β12、維生素Ε、維生素K、維生素C、維生素D、葉酸、肌醇、煙酸、生物素、泛酸、膽堿、 丐、磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、猛、氯、鉀、鈉、硒、鉻、鑰、?；撬?、和L-肉毒堿。通?？梢蕴砑犹幱邴}形式的礦物質(zhì)。具體的礦物質(zhì)和其他維生素的存在和量將取決于預(yù)期的嬰兒群體而變化。如果必要，該配方奶粉可以含有乳化劑和穩(wěn)定劑，例如大豆卵磷脂、單和雙甘油酯的檸檬酸酷、以及類似物。該配方奶粉可以任選地含有可能具有有益效果的其他物質(zhì)，例如乳鐵蛋白、核苷酸、核苷等。最終，該配方奶粉可以含有不消化的低聚糖，例如低聚半乳糖，例如以從O. 3%至
7%的量。在Koletzko (克萊茨克)B 等人，2005 J. Pediatric GastroenterolMed. 41:584-599中討論了配方奶粉的實(shí)例。在某些實(shí)施方案中，向個(gè)體以2. 3g/kg個(gè)體體重的量提供該提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了酸乳清用于制造嬰兒配方奶粉、后續(xù)配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品，以及含酸乳清的配方奶粉、增補(bǔ)劑或食品的用途。在這些實(shí)施方案中，酸乳清有效地取代了在此說(shuō)明的包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在這些實(shí)施方案中，可以在使用之前中和酸乳清。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在此說(shuō)明的提取物用于制造預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的方法，包括給向個(gè)體提供在此說(shuō)明的提取物的步驟。典型地，該個(gè)體是人。典型地，這個(gè)人易于過(guò)敏癥。典型地，人是指新生兒。典型地，該新生兒年齡小于大約2歲。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種用于減少在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的TNF或IL-2釋放的方法，包括向個(gè)體如提供權(quán)利要求48所述的提取物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種用于增加在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的IL-18釋放的方法，包括向個(gè)體提供如權(quán)利要求48所述的提取物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的腸上皮細(xì)胞屏障功能的方法，包括向個(gè)體提供在此說(shuō)明的提取物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的Thl免疫應(yīng)答的方法，包括向個(gè)體提供在此說(shuō)明的提取物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于使易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的Th2免疫應(yīng)答降至最低限度的方法，包括向個(gè)體提供在此說(shuō)明的提取物的步驟。在以上說(shuō)明的方法中，酸乳清有效地取代了在此說(shuō)明的包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。以下實(shí)例g在說(shuō)明而決非限制本發(fā)明。實(shí)例實(shí)例I包括酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的生產(chǎn)將200ml H2O添加至12g的WPC 80中，并且在室溫孵育30min直至溶解。在16000g離心該溶液IOmin以除去不溶固體。移開(kāi)上清液并且通過(guò)添加I. 335ml ION HCl酸化30min。通過(guò)添加I. 555ml IOM NaOH中和該酸化的溶液，并且測(cè)量pH，pH約為7. O。最終的溶液過(guò)濾通過(guò)O. 45 μ m過(guò)濾器，進(jìn)而通過(guò)O. 2 μ m過(guò)濾器來(lái)滅菌。將6%溶液用作用于試驗(yàn)的儲(chǔ)備溶液(即按1/8或1/12將儲(chǔ)備溶液稀釋到配方中)。實(shí)例2酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的體外免疫調(diào)節(jié)活性在多個(gè)基于細(xì)胞的測(cè)定中，測(cè)試了在實(shí)例I中形成的提取物(123)的體外免疫調(diào)節(jié)活性。將該提取物等分到96孔板中，然后在快速基于細(xì)胞的篩選測(cè)定中篩選。圖I中的數(shù)據(jù)顯示在由一種巨噬細(xì)胞系的RAW細(xì)胞釋放的體外TNFa (—種Thl細(xì)胞因子)。123刺激RAW細(xì)胞中的TNF-a生產(chǎn)(參見(jiàn)在圖I中的部分號(hào)碼3)。取決于周圍細(xì)胞因子環(huán)境，IL-18是驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞發(fā)育成Thl (炎癥)亦或Th2 (過(guò)敏癥)方向的主要早期免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。我們還評(píng)定了在用具有或不具有脂多糖(LPS)的佛波醇12-十四酸酷13-こ酸酯刺激THPl細(xì)胞(一種單核細(xì)胞系)之后的IL-18分泌。對(duì)照細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。部分123刺激從THPl細(xì)胞產(chǎn)生IL-18 (參見(jiàn)圖2中的部分號(hào)碼3)。IL-2是對(duì)于T細(xì)胞活化所必需的細(xì)胞因子，并且在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中是關(guān)鍵性的。我們?cè)u(píng)定了在TGR Biosciences的初始T細(xì)胞測(cè)定中影響IL-2釋放的能力。使用MACS磁珠技術(shù)(Miltenyi Pty. Ltd)從外周血(來(lái)自紅十字血庫(kù)，Adelaide (阿德萊德)獲得含血沉棕黃層的白細(xì)胞)純化T細(xì)胞。進(jìn)行CD4+T細(xì)胞的間接純化。首先用結(jié)合有針對(duì)相關(guān)細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體的磁珠標(biāo)記 不想要的細(xì)胞(即CD 8+淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等)。然后使標(biāo)記的細(xì)胞向下流過(guò)MACS磁柱，不想要的細(xì)胞結(jié)合到該柱子上，留下CD4+T細(xì)胞在柱子的流出液中。然后用PMA洗滌和孵育這些CD4+T細(xì)胞，以刺激細(xì)胞用于產(chǎn)生細(xì)胞因子連同文庫(kù)中的奶部分。用ELISA評(píng)定了 IL-2釋放(參見(jiàn)圖3)。如通過(guò)人⑶4+T細(xì)胞的有絲分裂活化證明，123 (圖3中的部分3)抑制了 IL_2細(xì)胞因子體外釋放。在PMA刺激之后，IL-2釋放是劑量依賴性的。通過(guò)使用過(guò)夜(0/N)孵育或脈沖I小時(shí)(參見(jiàn)圖4)評(píng)定了 123對(duì)IL-2產(chǎn)生的短期或長(zhǎng)期抑制。我們鑒定了具有體外免疫調(diào)節(jié)活性的4個(gè)潛在部分。如通過(guò)IL-2釋放所測(cè)量的，圖4中的123部分誘導(dǎo)了 T細(xì)胞活化的劑量反應(yīng)抑制。用這些部分孵育24小時(shí)以及在短的I小時(shí)脈沖之后，發(fā)生了 T細(xì)胞中的IL-2的抑制。在123存在下，用PHA和PMA刺激純化的人⑶4+T細(xì)胞過(guò)夜。在劑量范圍研究中，123清楚地抑制IL-2分泌，如同123濃度的降低導(dǎo)致IL-2分泌的増加一祥明顯。最大抑制水平和未受刺激的細(xì)胞以及ー種已知的免疫抑制劑地塞米松(DEX)的最大抑制水平是可比較的。對(duì)于在體內(nèi)將被活化的T細(xì)胞，抗原被提呈給T細(xì)胞受體并且活化共刺激分子，從而導(dǎo)致T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放。為了進(jìn)一步證實(shí)免疫調(diào)節(jié)活性，我們?cè)u(píng)定了在經(jīng)由使用抗CD3抗體、和抗CD28 (針對(duì)ー種共刺激分子的抗體)的T細(xì)胞受體刺激CD4+T細(xì)胞之后的IL-2釋放的抑制。建立這種活化方案來(lái)模擬體內(nèi)天然發(fā)生的情況，作為與使用PHA/PMA的⑶4+T細(xì)胞的非特異性促有絲分裂刺激的比較。123抑制了已經(jīng)用抗⑶3和抗⑶28抗體活化的⑶4+T細(xì)胞的IL-2分泌(參見(jiàn)圖5)。體外使用T84細(xì)胞上皮屏障功能測(cè)定，我們?cè)u(píng)定了奶部分123的效果。123顯示體外免疫抑制活性，我們?cè)谠撈琳瞎δ軠y(cè)定中包括了酸活化的和中性的123和129。測(cè)量了在用和不用酸活化的和中性的123培養(yǎng)的T84腸上皮細(xì)胞中的跨上皮電阻(TER)(參見(jiàn)圖6)。在圖7中顯示了 123的更詳細(xì)的圖以及它對(duì)TER的影響。TER的降低代表細(xì)胞屏障功能的降低。圖6中的數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)I或2天之后，處于中性形式處于酸化形式的123對(duì)上皮細(xì)胞屏障完整性不具有不利作用(參見(jiàn)圖6和圖7)。然而，它確實(shí)顯著増加了 TER測(cè)定中的細(xì)胞的屏障功能。在從Th2轉(zhuǎn)換為Thl型免疫應(yīng)答時(shí)，過(guò)敏癥的消退發(fā)生在患有牛奶過(guò)敏的嬰兒中。123也促進(jìn)了從THPl細(xì)胞產(chǎn)生Thl細(xì)胞因子IL-18 (參見(jiàn)圖2，部分3)。因此我們?cè)谟啄曜厣餐笫笾欣^續(xù)進(jìn)行使用123的體內(nèi)試驗(yàn)。實(shí)例3酸處理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性使用棕色挪威過(guò)敏傾向幼年大鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。給予酸活化的123，作為混合在配方中的連續(xù)輸注，或作為一日三次給予到胃的O. Iml的快速推注。用n=8/組完成試驗(yàn)并且進(jìn)行血清分析。當(dāng)用作進(jìn)入配方中的補(bǔ)充劑(6%起始溶液的1/8)時(shí)，或當(dāng)作為3次/日給予配方飼養(yǎng)的幼年大鼠的快速推注時(shí)，123具有免疫調(diào)節(jié)活性。當(dāng)與只接受配方的幼年大鼠中的IgE水平相比時(shí),獲得了顯著的IgE減少。使用具有杜奇事后檢驗(yàn)(Tukey’s post - hoctest)的單因素方差分析(One Way AN0VA)來(lái)評(píng)定組間顯著性，*=與配方飼養(yǎng)組相比，處理組 Ρ〈0·05。與配方飼養(yǎng)的幼年大鼠相比，以1/8稀釋度或按一日3次給予的強(qiáng)飼法，配方的123補(bǔ)充降低了血清IgE水平(參見(jiàn)圖8)。在以1/8或作為一日3次的快速推注的123補(bǔ)充之后，BLG特異性IgGl與配方飼養(yǎng)組并沒(méi)有顯著差異。然而在8個(gè)幼年大鼠中的6個(gè)中，在1/12稀釋度獲得了 IgGl滴度的降低，有兩個(gè)大鼠在1/12試驗(yàn)中具有異常高的血清滴度，如果除去這些離群值，那么該滴度會(huì)顯著降低。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在圖9中，其中包括離群值的血清數(shù)據(jù)在內(nèi)，在圖上用(X)標(biāo)識(shí)離群值。通過(guò)123處理，RMCPII水平并未降低(參見(jiàn)圖10)。在123增補(bǔ)配方后，還在固有層中計(jì)量肥大細(xì)胞數(shù)。在以1/12稀釋度的配方補(bǔ)充 之后，在給予123的幼年大鼠中，固有層中的肥大細(xì)胞數(shù)減少了。在123補(bǔ)充飲食之后，還測(cè)定了在腸勻漿中的細(xì)胞因子IL-10、干擾素Y和IL_4(分別參見(jiàn)圖12(A)、(B)和(C))。在各組之間，沒(méi)有檢測(cè)到在IL-10和IL-4水平方面的顯著差異。以1/8或1/12稀釋度的配方的123補(bǔ)充增強(qiáng)了腸中的IFN-Y濃度。與繼續(xù)具有持續(xù)性過(guò)敏癥的嬰兒相比，繼續(xù)消退他們的牛奶過(guò)敏癥的嬰兒具有增加的IFN-Y水平。123顯得促進(jìn)了從Th2應(yīng)答轉(zhuǎn)移并且增加平衡免疫系統(tǒng)所需的Thl應(yīng)答。我們已經(jīng)鑒定了具有免疫調(diào)節(jié)活性的奶生物活性。與只接受配方的幼年大鼠相t匕，當(dāng)用作進(jìn)入配方中的補(bǔ)充劑(6%起始溶液的1/8稀釋度)時(shí)，或作為3次/日的快速推注給予配方飼養(yǎng)的幼年大鼠時(shí)，123導(dǎo)致了 IgE (與過(guò)敏癥發(fā)展相關(guān)聯(lián)的抗體)的顯著降低。我們還進(jìn)行了斷奶試驗(yàn)，并且評(píng)定了強(qiáng)飼123、酸活化的和非酸活化的123的幼年大鼠的血清抗體應(yīng)答。進(jìn)行該試驗(yàn)以確定在斷奶時(shí)，123是否也調(diào)節(jié)對(duì)食品抗原的免疫應(yīng)答。在試驗(yàn)中的第14天，我們開(kāi)始用123強(qiáng)飼。我們最近的來(lái)自個(gè)體發(fā)育研究的數(shù)據(jù)提示嬰兒飲食的補(bǔ)充需要發(fā)生在更早的年齡。為了確定在斷奶時(shí)用123預(yù)處理是否影響對(duì)食品抗原的免疫應(yīng)答，我們進(jìn)行了一個(gè)第二試驗(yàn)，其中在第4天開(kāi)始喂123，并且在第14天開(kāi)始喂BLG (參見(jiàn)圖13A、B和C)。在缺乏BLG激發(fā)的情況下，123降低了血清中總IgE的總體濃度。正如通過(guò)我們的個(gè)體發(fā)育研究確定的，如果在生命早期(即在哺乳期)用特異性抗原激發(fā)開(kāi)始，通過(guò)膳食補(bǔ)充劑的免疫調(diào)節(jié)會(huì)顯得更有效。
權(quán)利要求
1.一種用于從含乳清蛋白的組合物生產(chǎn)乳清蛋白提取物的方法，該方法包括 使一種含乳清蛋白的組合物與一種水溶液接觸，由此形成一種樣品，該樣品包括一種含可溶性蛋白的成分和一種不溶性成分； 從該樣品回收該含可溶性蛋白的成分； 使該含可溶性蛋白的成分酸化； 由此形成該乳清蛋白提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物包括甜乳清、酸乳清、低乳糖乳清、脫礦物乳清、乳清蛋白濃縮物(WPC)或乳清蛋白分離物(WPI)的一種或多種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中在該含乳清蛋白的組合物中的蛋白質(zhì)的量是基于干重計(jì)至少大約10%至大約95%w/w。
4.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物包括碳水化合物和脂肪中的至少一種。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中在該含乳清蛋白的組合物中的碳水化合物的量是基于干重計(jì)至少大約1%至小于大約80%w/w。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中在該含乳清蛋白的組合物中的脂肪的量是基于干重計(jì)至少大約O. 5%至小于大約10%w/w。
7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物包括基于干重計(jì)大約80%至82%w/w的蛋白質(zhì)、大約4%至8%w/w的乳糖以及大約4%至8%w/w的脂肪。
8.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物是一種WPC。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該WPC是WPC80。
10.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物被提供為一種與水溶液接觸的粉末形式。
11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該水溶液是水。
12.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含乳清蛋白的組合物以至少大約O.5%至10%w/w的含乳清蛋白的組合物的量被提供為與該水溶液接觸。
13.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含可溶性蛋白的成分是通過(guò)將該含可溶性蛋白的成分從不溶性固體中分離來(lái)回收的。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中通過(guò)使該樣品經(jīng)受離心、色譜法、離子交換、電滲析、過(guò)濾或吸附的一項(xiàng)或多項(xiàng)將該含可溶性蛋白的成分從該不溶性固體中分離出來(lái)。
15.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含可溶性蛋白的成分是通過(guò)對(duì)該含可溶性蛋白的成分提供至少大約2. 5的pH來(lái)酸化的。
16.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含可溶性蛋白的成分是在該含可溶性蛋白的成分已經(jīng)被酸化之后從該樣品中回收的。
17.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，包括以下另外的步驟 將所酸化的含可溶性蛋白的成分中和。
18.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含可溶性蛋白的成分是通過(guò)對(duì)該含可 溶性蛋白的成分提供大約為7的pH來(lái)中和的。
19.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該含可溶性蛋白的成分是在該含可溶性蛋白的成分已經(jīng)被中和之后從該樣品中回收的。
20.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，包括將該含可溶性蛋白的成分干燥以形成一種粉末的步驟。
21.一種乳清蛋白提取物，包括一種酸處理的含可溶性乳清蛋白的成分的水溶液。
22.如權(quán)利要求21所述的提取物，其中該提取物是通過(guò)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)生產(chǎn)的。
23.如權(quán)利要求21所述的提取物，其中形成該酸處理的含可溶性乳清蛋白的成分的水溶液的蛋白質(zhì)是基本上未水解的。
24.如權(quán)利要求21所述的提取物用于制造一種嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品的用途。
25.一種嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充劑或食品，包括如權(quán)利要求21所述的提取物。
26.如權(quán)利要求21所述的提取物用于制造一種預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的藥物的用途。
27.一種預(yù)防食物過(guò)敏或使其減輕至最低程度的方法，包括向一位個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
28.一種用于減少在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的IL-2釋放的方法，包括向該個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
29.一種用于增加在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中TNF或IL-18釋放的方法，包括向該個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
30.一種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中腸上皮細(xì)胞屏障功能的方法，包括向該個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
31.一種用于增強(qiáng)在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中Thl免疫應(yīng)答的方法，包括向該個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
32.一種用于使在易于食物過(guò)敏的個(gè)體中的Th2免疫應(yīng)答降至最低程度的方法，包括向該個(gè)體提供如權(quán)利要求21所述的提取物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及乳清蛋白提取物的制造、涉及嬰兒配方奶粉并涉及減少或預(yù)防食物過(guò)敏。這種乳清蛋白提取物是從一種含乳清蛋白的組合物通過(guò)以下步驟生產(chǎn)的使一種含乳清蛋白的組合物與一種水溶液接觸以形成一種樣品，這種樣品包括一種含可溶性蛋白的成分和一種不溶性成分；從該樣品回收這種含可溶性蛋白的成分；并且將這種含可溶性蛋白的成分酸化，由此產(chǎn)生這種乳清蛋白提取物。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的提取物可以用在作為膳食補(bǔ)充劑或食品的嬰兒配方奶粉中。
文檔編號(hào)A61K35/20GK102638996SQ201080055545
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者伊爾梅利·奧利·潘提拉, 伊恩·羅伯特·米切爾 申請(qǐng)人:婦女兒童健康研究所, 澳大利亞乳品有限公司