非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙組織再生方法

專利名稱：非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙組織再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種填充在非拔牙的根管中的非拔牙根管填充材料，以及使用該非拔牙根管填充材料的非拔牙的牙組織再生方法。
背景技術(shù)：
目前，牙齒缺失的原因包括牙折在內(nèi)大約一半是由齲齒造成的，如果摘除牙髓則牙齒缺失的可能性劇增這一情況為人所知。牙齒的平均壽命據(jù)說現(xiàn)在是57歲，如果想要一生都用自己的牙齒咀嚼，則牙齒的壽命需要提高20年以上。雖然進(jìn)行了 8020運(yùn)動(dòng)(即使到了 80歲自己的牙齒也能殘留20顆以上的運(yùn)動(dòng))，但是現(xiàn)在80歲的人牙齒的平均顆數(shù)為大約8顆，老年人殘存的牙齒數(shù)量幾乎沒有增加，需要對(duì)齲齒治療進(jìn)行徹底改革。如果將牙髓除去(摘除牙髓)，則修復(fù)性牙本質(zhì)形成能力和感染防御機(jī)制喪失，由于疼痛這一警告信號(hào)的喪失導(dǎo)致齲齒擴(kuò)大的危險(xiǎn)性增加。而且，在牙髓摘除治療中沒有完美無缺的方法，在進(jìn)行牙髓摘除、根管填充后，可能會(huì)因填充材料從牙冠側(cè)露出而產(chǎn)生根尖病灶、垂直性牙折或?qū)徝佬韵?、或者術(shù)后疼痛。因此，在超老齡化社會(huì)中，以避免輕易摘除牙髓、延長牙齒壽命為目標(biāo)，開發(fā)出由利用了牙齒再生醫(yī)療技術(shù)的牙本質(zhì)/牙髓再生所得到的新的齲齒/牙髓炎療法非常重要。關(guān)于牙本質(zhì)再生，作為細(xì)胞療法或基因療法，在生體外向牙髓干細(xì)胞/前體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP，Bone Morphogenetic Proteins，成骨因子)等蛋白質(zhì)或基因，再將進(jìn)行了三維培養(yǎng)而分化后的成牙本質(zhì)細(xì)胞與其胞外基質(zhì)一起自體移植到活髓切斷面上，能夠使大量牙本質(zhì)再生(非專利文獻(xiàn)1、2)。但是，在產(chǎn)生牙髓炎的情況下，除了牙本質(zhì)以外還需要使牙髓組織本身再生。另一方面，牙髓組織是血管和神經(jīng)極其豐富的組織。在牙髓組織中存在一種自然治愈機(jī)制，即在牙髓受到創(chuàng)傷時(shí)會(huì)從局部釋放出趨化因子，干細(xì)胞從牙髓深部血管周圍遷移到創(chuàng)傷部位，進(jìn)行增殖、分化，產(chǎn)生新生血管，形成修復(fù)性牙本質(zhì)。特別是，牙髓的血管系統(tǒng)對(duì)營養(yǎng)或氧的供給源、代謝產(chǎn)物的排泄路徑、牙髓的恒常性維持很重要。而且，牙髓神經(jīng)對(duì)血流、牙本質(zhì)小管內(nèi)溶液的液流、牙髓內(nèi)壓的調(diào)節(jié)具有重要的作用，對(duì)血管新生、免疫應(yīng)答細(xì)胞或炎性細(xì)胞的浸潤進(jìn)行干預(yù)并調(diào)節(jié)炎癥，有助于維持牙髓的恒常性、強(qiáng)化牙髓防御反應(yīng)。因此，在牙本質(zhì)/牙髓再生過程中，需要考慮血管和神經(jīng)的相互作用以及血管新生、神經(jīng)再生。側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)以大致各占一半的比例含有⑶31-/⑶146-SP細(xì)胞和⑶31-/CD146+SP細(xì)胞。與CD31-/CD146+SP細(xì)胞相比，CD31-/CD146-SP細(xì)胞極顯著地促進(jìn)血管新生、神經(jīng)再生以及牙髓再生，并且顯著地對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-I)的趨化因子受體即C)(CR4mRNA進(jìn)行表達(dá)。從皮膚等創(chuàng)傷部位分泌出SDF-1，由SDF-I引起的人干細(xì)胞的遷移依賴于CXCR4的表達(dá)這一情況為人所知。CXCR4也被稱為干細(xì)胞的標(biāo)記物，從人臍帶血分選出胚胎干細(xì)胞樣
4細(xì)胞作為CXCR4+/SSEA-4+/0ct-4+(非專利文獻(xiàn)3)。作為神經(jīng)干細(xì)胞，從小鼠胎鼠腦部分選出遷移到中樞神經(jīng)部位且具有顯著的神經(jīng)分化能力的CXCR4+/SSEA-1+細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)4)。據(jù)報(bào)告在人胰臟內(nèi)，CXCR4陽性細(xì)胞具有多能性，能夠用于對(duì)可分化成胰島素分泌細(xì)胞的干細(xì)胞、前體細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)幻進(jìn)行分選。另一方面，關(guān)于牙髓再生，迄今為止還有以下報(bào)告在牙根未發(fā)育完全的牙齒中，如果在拔牙并進(jìn)行牙髓摘除、根管治療后再次移植，則牙髓可再生。而且，還有以下報(bào)告即使是在根尖部發(fā)生病變的牙根未發(fā)育完全的牙齒，通過在拔牙后進(jìn)行徹底的根管擴(kuò)大、清創(chuàng)，并將血塊填充至牙骨質(zhì)-牙本質(zhì)界，再用三氧化礦物凝聚體(Mineral TrioxideAggregate, MTA)將窩洞完全封閉，也能使牙髓樣組織再生。據(jù)報(bào)告，在犬的牙根發(fā)育完全的牙齒中，如果拔牙后摘除牙髓，切斷根尖部或者將根尖部擴(kuò)大1. Imm以上后再進(jìn)行移植，然后填充血塊，則會(huì)出現(xiàn)牙髓樣組織的再生(非專利文獻(xiàn)6)。上述根管內(nèi)牙髓再生大部分都是關(guān)于牙根未發(fā)育完全的牙齒的報(bào)告，無法證明已在根管內(nèi)再生的組織是帶有血管、神經(jīng)的牙髓固有的組織。而且，都是先拔牙再在生體外進(jìn)行根管擴(kuò)大、清創(chuàng)，然后進(jìn)行再移植并填充血塊。非專利文獻(xiàn)1 =Nakashima 和 Reddi，2003 (PMID12949568 doilO. 1038/nbt864)非專利文獻(xiàn)2 =Nakashima 和 Akamine，2006 (PMID 16186748)非專利文獻(xiàn)3 :KuciaM 等，2007(PMID 17136117doi :10. 1038/sj. leu. 2404470)非專禾Ij文獻(xiàn) 4 :CortiS 等，2005 (PMID 16150803doi 10· 2478/V10042-008-0045-0)非專利文獻(xiàn)5 =KoblasT 等，2007 (PMID :17328838)非專利文獻(xiàn)6 :Laureys 等 2001，(PMID 11298308doi 10. 1067/mod. 2001. 113259)

發(fā)明內(nèi)容
-發(fā)明所要解決的技術(shù)問題-但是，在先拔牙再在生體外進(jìn)行根管擴(kuò)大、清創(chuàng)，然后進(jìn)行再移植并填充血塊的方法中，有時(shí)會(huì)在牙髓腔、根管內(nèi)的牙本質(zhì)發(fā)生特發(fā)性牙質(zhì)吸收(內(nèi)部吸收)，如果該內(nèi)部吸收增加則會(huì)在牙本質(zhì)上發(fā)生穿孔。而且，對(duì)于臨床上通常進(jìn)行的將牙根已發(fā)育完全的正常智齒等再植入其它牙齒缺失部位的療法，有可能在再植牙數(shù)年后發(fā)生由內(nèi)部吸收或外部吸收引起的牙齒松動(dòng)或脫落。并且，對(duì)于在牙根發(fā)育完全牙齒的情況下，摘除牙髓或治療受感染根管的牙髓組織再生方法以及用于牙髓組織再生的根管填充材料的開發(fā)則完全沒有確立。本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供一種新型獨(dú)創(chuàng)且適當(dāng)?shù)母芴畛洳牧弦约笆褂迷摳芴畛洳牧系难澜M織再生方法。該根管填充材料對(duì)牙根發(fā)育完全的牙齒能夠?qū)崿F(xiàn)不發(fā)生內(nèi)部吸收或外部吸收，不出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上的牙組織再生。-用以解決技術(shù)問題的技術(shù)方案-
本發(fā)明的第一觀點(diǎn)所涉及的非拔牙根管填充材料，該非拔牙根管填充材料含有向摘除牙髓后或者在對(duì)受感染根管進(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后，插入非拔牙根管的根尖側(cè)的牙髓干細(xì)胞和胞外基質(zhì)。優(yōu)選上述牙髓干細(xì)胞包含牙髓CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、牙髓SP細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶對(duì)陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、CD^陽性細(xì)胞、CD34陽性細(xì)胞、CD44陽性細(xì)胞、CD73陽性細(xì)胞以及CD90陽性細(xì)胞中的至少任一種。優(yōu)選上述牙髓SP細(xì)胞為CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、CD31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶M陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞或者⑶90陽性細(xì)胞中的任一種。優(yōu)選上述非拔牙根管填充材料使牙髓干細(xì)胞附著在根管的根尖側(cè)，并且使含有細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)。優(yōu)選上述細(xì)胞趨化因子為SDF-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、Slit以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)中的至少任一種。優(yōu)選上述細(xì)胞增殖因子為胰島素樣生長因子(IGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)以及血小板衍生生長因子(PDGF)中的至少一種。優(yōu)選上述神經(jīng)營養(yǎng)因子為膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)肽Y(Neurop^tideY)以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3 (Neurotrophin 3)中的至少一種。優(yōu)選上述胞外基質(zhì)由生體親和性材料組成，該生體親和性材料包含膠原蛋白、人工蛋白聚糖、明膠、水凝膠、血纖蛋白、二乙氧磷酰硫膽堿、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、纖連蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚內(nèi)消旋乳酸(PDLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、羥基磷灰石、β-磷酸三鈣(β -TCP)、碳酸鈣、鈦以及金中的至少一種。優(yōu)選上述牙髓干細(xì)胞在上述胞外基質(zhì)中的含有率在lX103cell/yl以上1 X IO6Cell/μ 1 以下。本發(fā)明的第二觀點(diǎn)所涉及的非拔牙的牙組織再生方法，是通過在摘除牙髓后或?qū)κ芨腥靖苓M(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后的非拔牙根管的根尖側(cè)注入含有牙髓干細(xì)胞和胞外基質(zhì)的非拔牙根管填充材料，使根管內(nèi)的牙組織再生。優(yōu)選上述牙髓干細(xì)胞包含牙髓CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、牙髓SP細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶對(duì)陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、CD^陽性細(xì)胞、CD34陽性細(xì)胞、CD44陽性細(xì)胞、CD73陽性細(xì)胞以及CD90陽性細(xì)胞中的至少一種。優(yōu)選上述牙髓SP細(xì)胞為CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、CD31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶M陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞⑶90陽性細(xì)胞中的任一種。優(yōu)選上述非拔牙根管填充材料使牙髓干細(xì)胞附著在根管的根尖側(cè)，并且使含有細(xì)
6胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)。優(yōu)選上述細(xì)胞趨化因子為SDF-I、VEGF、G-CSF, SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一種。優(yōu)選上述細(xì)胞增殖因子為IGF、bFGF以及PDGF中的至少一種。優(yōu)選上述神經(jīng)營養(yǎng)因子為⑶NF、BDNF, NGF、神經(jīng)肽Y以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3中的至少一種。優(yōu)選上述胞外基質(zhì)由生體親和性材料組成，該生體親和性材料包含膠原蛋白、人工蛋白聚糖、明膠、水凝膠、血纖蛋白、二乙氧磷酰硫膽堿、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、纖連蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼多糖、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羥基磷灰石、β -TCP、碳酸鈣、鈦以及金中的至少一種。優(yōu)選在將上述根管填充材料注入上述根管的根尖側(cè)之前，通過對(duì)上述根管進(jìn)行擴(kuò)大，使根尖部的根管的粗細(xì)達(dá)到規(guī)定大小。優(yōu)選上述牙髓干細(xì)胞在上述胞外基質(zhì)中的含有率在lX103Cell/l·! 1以上1 X IO6Cell/μ 1 以下。-發(fā)明的效果-根據(jù)本發(fā)明，對(duì)牙根發(fā)育完全的牙齒能夠?qū)崿F(xiàn)不發(fā)生內(nèi)部吸收或外部吸收，不出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上的牙組織再生。


圖1是第一實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的說明圖。圖2是對(duì)第一實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制備工序進(jìn)行說明的說明圖。圖3Α是患有牙髓炎的牙齒的說明圖。圖;3Β是說明已進(jìn)行了摘除牙髓后的根管擴(kuò)大處置之處的示意圖。圖3C是對(duì)填充非拔牙根管填充材料之處進(jìn)行說明的示意圖。圖3D是對(duì)已注入明膠(spongel)和樹脂之處進(jìn)行說明的示意圖。圖3E是表示牙髓再生和血管再生的示意圖。圖3F是對(duì)已注入形態(tài)發(fā)生因子和樹脂之處進(jìn)行說明的示意圖。圖3G是表示牙本質(zhì)再生的示意圖。圖;3H是細(xì)菌到達(dá)根管壁的牙本質(zhì)和根尖牙周組織的根尖性牙周炎的示意圖。圖4A是使趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)的非拔牙根管填充材料的說明圖。圖4B是使趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)，并且在牙冠部側(cè)殘留有胞外基質(zhì)的非拔牙根管填充材料的說明圖。圖5是對(duì)第二實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制備工序進(jìn)行說明的說明圖。圖6A是拔牙后在生體外進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CD105陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，對(duì)將吸附有SDF-I和⑶105陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)并進(jìn)行再移植14天后的情況進(jìn)行說明的圖。
圖6B是拔牙后在生體外進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CD105陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，將吸附有SDF-I和⑶105陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)并進(jìn)行再移植14天后根管內(nèi)部牙本質(zhì)壁的高倍率圖像。圖6C是拔牙后在生體外進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CD105陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，將吸附有SDF-I和⑶105陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)并進(jìn)行再移植14天后牙根外側(cè)的牙本質(zhì)/牙骨質(zhì)壁的高倍率圖像。圖7A是在未拔牙的情況下在生體內(nèi)進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CD105陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，對(duì)將吸附有SDF-I和CD105陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)14天后的情況進(jìn)行說明的圖。圖7B是在未拔牙的情況下在生體內(nèi)進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CD105陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，將吸附有SDF-I和CD105陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)14天后根管內(nèi)部牙本質(zhì)壁的高倍率圖像。圖8A是在未拔牙的情況下在生體內(nèi)進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CXCR4陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，對(duì)將吸附有SDF-I和CXCR4陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)14天后的情況進(jìn)行說明的圖。圖8B在未拔牙的情況下在生體內(nèi)進(jìn)行牙髓摘除后根管擴(kuò)大，使SDF-I和CXCR4陽性細(xì)胞吸附在I型/III型混合膠原蛋白上，將吸附有SDF-I和CXCR4陽性細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白注入根管內(nèi)14天后根管內(nèi)部牙本質(zhì)壁的高倍率圖像。圖9A是表示從犬恒牙牙髓組織分離出的由流式細(xì)胞術(shù)得到的牙髓源性CD105陽性細(xì)胞之比例的圖。圖9B是表示從犬恒牙牙髓組織分離出的由流式細(xì)胞術(shù)得到的脂肪源性CD105陽性細(xì)胞之比例的圖。圖9C是表示從犬恒牙牙髓組織分離出的培養(yǎng)第3天的初代牙髓CD105陽性細(xì)胞的圖。圖9D是表示從犬恒牙牙髓組織分離出的培養(yǎng)第10天的初代牙髓CD105陽性細(xì)胞的圖。圖9E是表示從脂肪組織分離出的培養(yǎng)第3天的初代脂肪CD105陽性細(xì)胞的圖。圖9F是表示從脂肪組織分離出的培養(yǎng)第10天的初代脂肪CD105陽性細(xì)胞的圖。圖IOA是表示在第30天，牙髓⑶105陽性細(xì)胞的脂肪誘導(dǎo)力的圖。圖IOB是表示在第30天，未分選的總牙髓細(xì)胞的脂肪誘導(dǎo)力的圖。圖IOC是表示在第30天，脂肪⑶105陽性細(xì)胞的脂肪誘導(dǎo)力的圖。圖IOD是表示牙髓⑶105陽性細(xì)胞、未分選的總牙髓細(xì)胞以及脂肪⑶105陽性細(xì)胞脂肪誘導(dǎo)力的基因表達(dá)對(duì)比圖。圖IOE是表示12小時(shí)后，牙髓⑶105陽性細(xì)胞的血管誘導(dǎo)力的圖。圖IOF是表示12小時(shí)后，未分選的總牙髓細(xì)胞的血管誘導(dǎo)力的圖。圖IOG是表示12小時(shí)后，脂肪⑶105陽性細(xì)胞的血管誘導(dǎo)力的圖。圖IOH是表示在第14天，牙髓CD105陽性細(xì)胞的神經(jīng)球(Neurosphere)形成能力的圖。圖101是表示在第14天，未分選的總牙髓細(xì)胞的神經(jīng)球形成能力的圖。
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圖IOJ是表示在第觀天，對(duì)牙髓⑶105陽性細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)絲免疫染色的圖。圖IOK是表示牙髓⑶105陽性細(xì)胞的神經(jīng)絲、神經(jīng)調(diào)制蛋白、電壓依賴性鈉通道以及Ia型(ScnlA)mRNA表達(dá)的圖。圖IOL是表示在第觀天，牙髓⑶105陽性細(xì)胞的牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)力的圖。圖IOM是表示在第觀天，未分選的總牙髓細(xì)胞的牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)力的圖。圖ION是表示在第觀天，脂肪⑶105陽性細(xì)胞的牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)力的圖。圖100是表示牙髓⑶105陽性細(xì)胞、未分選的總牙髓細(xì)胞以及脂肪⑶105陽性細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的能力對(duì)比圖。圖IOP是表示已添加了 SDF-I終濃度50ng/ml的牙髓⑶105陽性細(xì)胞、未分選的總牙髓細(xì)胞以及脂肪CD105陽性細(xì)胞的增殖能力的圖，表示培養(yǎng)2、12、24以及36小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)。圖IlA是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlB是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的局部放大圖。圖IlC是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的局部放大圖。圖IlD是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的圖。圖IlE是表示在摘除犬牙髓后第14天，只將CD105陽性細(xì)胞自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlF是表示在摘除犬牙髓后第14天，只將SDF-I自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlG是表示在摘除犬牙髓后第90天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlH是表示在摘除犬牙髓后第90天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖，表示再生組織上部的新生血管。圖IlI是表示在摘除犬牙髓后第90天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖，表示再生組織中央部的新生血管。圖IlJ是表示正常牙髓組織的細(xì)胞的圖。圖IlK是表示在摘除犬牙髓后，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)，在第90天，并列在沿牙本質(zhì)側(cè)壁重新形成的骨樣/管樣牙本質(zhì)(OD)上的成牙本質(zhì)細(xì)胞的圖。圖IlL是表示在摘除犬牙髓后，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)，在第90天，由原位雜交分析得到的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的圖，表示烯胺素(Enamelysin)/MMP20。圖IlM是表示摘除犬牙髓后，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到空洞的根管內(nèi)，在第90天，由原位雜交分析得到的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的圖，表示牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dentin Sialophosphoprotein，Dspp)。
圖IlN是表示在摘除犬牙髓后第14天，將總牙髓細(xì)胞與SDF-I —起移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖110是表示在摘除犬牙髓后第14天，將總牙髓細(xì)胞與SDF-I —起移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的血管新生的放大圖。圖IlP是表示在摘除犬牙髓后第90天，將總牙髓細(xì)胞與SDF-I —起移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlQ是表示在摘除犬牙髓后第90天，將總牙髓細(xì)胞與SDF-I —起移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的放大圖。圖IlR是表示在摘除犬牙髓后第14天，將脂肪⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起移植到空洞的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖IlS是表示第14天的新生再生組織相對(duì)于根管表面積之比例的圖，圖中的數(shù)據(jù)是用5個(gè)試樣的平均值士SD來表示的比例。圖IlT是表示由BS-I凝集素進(jìn)行免疫染色的圖。圖IlU是由全樣載片(Whole Mount)凝集素染色得到的新生血管的三維解析，是表示移植牙髓⑶105陽性細(xì)胞存在于新生毛細(xì)血管周圍之狀態(tài)的圖。圖IlV是由全樣載片凝集素染色得到的新生血管的三維解析，是表示第14天再生組織的誘導(dǎo)血管之三維圖像的圖。圖IlW是由全樣載片凝集素染色得到的新生血管的三維解析，是表示DiI標(biāo)記的移植細(xì)胞分散在整個(gè)再生組織中之狀態(tài)的圖。圖IlX是表示正常牙髓組織的圖。圖IlY是表示第14天的新生再生組織的蛋白基因產(chǎn)物9. 5 (PGP 9. 5)免疫染色的圖。圖IlZ是表示在下顎第三切牙再生的牙髓組織DiI標(biāo)記的圖。圖12A是表示正常牙髓組織的二維電泳的圖。圖12B是表示再生牙髓組織的二維電泳的圖。圖12C是使正常牙髓組織的二維電泳與再生牙髓組織的二維電泳重疊所得的圖。圖12D是表示正常牙髓組織的二維電泳的圖。圖12E是表示牙周膜組織的二維電泳的圖。圖12F是使正常牙髓組織的二維電泳與牙周膜組織的二維電泳重疊所得的圖。圖13A是表示在犬受感染根管治療后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到已拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖13B是表示在犬受感染根管治療后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到未拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖13C是表示在犬受感染根管治療后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與SDF-I —起自體移植到未拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的局部放大圖。圖14A是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與G-CSF —起自體移植到已拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。圖14B是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與G-CSF —起自體移植到未拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的圖。
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圖14C是表示在摘除犬牙髓后第14天，將牙髓⑶105陽性細(xì)胞與G-CSF —起自體移植到未拔牙的根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的局部放大圖。-附圖標(biāo)記說明_
100對(duì)象牙齒
110根尖性牙周炎
200非拔牙根管填充材料
210胞外基質(zhì)
220牙髓干細(xì)胞
230趨化因子
400管
500牙本質(zhì)
610明膠
620樹脂
630形態(tài)發(fā)生因子。
具體實(shí)施例方式《第一實(shí)施方式》以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行具體說明。本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料含有牙髓干細(xì)胞和胞外基質(zhì)，在摘除牙髓后或在對(duì)受感染根管進(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后，插入非拔牙的根管的根尖側(cè)。圖1是本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的說明圖。非拔牙根管填充材料200通過使牙髓干細(xì)胞220附著在胞外基質(zhì)210上而形成。牙髓干細(xì)胞220附著在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖側(cè)。牙髓干細(xì)胞是源自恒牙或乳牙的牙髓干細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞包含牙髓CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、牙髓SP細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、CD24陽性細(xì)胞、CD150陽性細(xì)胞、CD29陽性細(xì)胞、CD34陽性細(xì)胞、CD44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞以及⑶90陽性細(xì)胞中的至少一種。例如，犬恒牙牙髓細(xì)胞包含0. 8%的CXCR4陽性細(xì)胞，血管新生能力等組織再生能力較高。牙髓SP細(xì)胞包含CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、CD31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶M陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞、或者⑶90陽性細(xì)胞中的任一種。應(yīng)予說明，⑶31-/⑶146-側(cè)群(SP)細(xì)胞若移植到小鼠下肢缺血部位則能促進(jìn)血流恢復(fù)、血管新生，若移植到大鼠腦梗死缺血部位則能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化、使運(yùn)動(dòng)麻痹康復(fù)。而且，⑶31-/⑶146-SP細(xì)胞若移植到犬活髓切斷面上則在活髓切斷面上的窩洞內(nèi)出現(xiàn)血管新生、神經(jīng)再生、牙髓再生。由此，在采用⑶31-/⑶146-SP細(xì)胞作為牙髓干細(xì)胞的情況下，雖然認(rèn)為牙髓再生能力較高，但為了分選SP細(xì)胞，需要用DNA結(jié)合熒光色素即Hoechst33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，因此應(yīng)用于臨床時(shí)在安全性方面可能會(huì)產(chǎn)生問題。但是，由于能夠不采用因?yàn)榇嬖谖廴镜目赡苄远谂R床上無法使用的流式細(xì)胞術(shù)或者因價(jià)格高昂而使用受到限制的抗體珠(Antibody Beads)法對(duì)牙髓CXCR4陽性細(xì)胞進(jìn)行分選，而是通過使用了 SDF-1、AMD3100、或G-CSF等的遷移法對(duì)牙髓CXCR4陽性細(xì)胞進(jìn)行分選，因此能夠安全且低成本地進(jìn)行分選。因此，在用CXCR4陽性細(xì)胞作為牙髓干細(xì)胞的情況下，能夠立刻用于臨床，而且還有價(jià)格便宜這一重要優(yōu)點(diǎn)。牙髓干細(xì)胞可以是從接受牙組織再生處置的對(duì)象動(dòng)物本身提取出的自體細(xì)胞，也可以是從接受牙組織再生處置的對(duì)象動(dòng)物以外的動(dòng)物提取出的同種細(xì)胞。優(yōu)選牙髓干細(xì)胞在非拔牙根管填充材料200中的含有率在IX IO3Cell/μ 1以上1 X IO6Cell/μ 1以下。這是因?yàn)槿绻浪韪杉?xì)胞的含有率小于lX103cell/y 1，則根管內(nèi)牙組織的再生可能會(huì)不充分。另一方面，如果牙髓干細(xì)胞的含有率大于lX106cell/yl，則可能會(huì)對(duì)對(duì)象牙齒產(chǎn)生難以預(yù)料的副作用。優(yōu)選胞外基質(zhì)(支架(Scaffold))210由生體親和性材料組成，該生體親和性材料包含膠原蛋白、人工蛋白聚糖、明膠、水凝膠、血纖蛋白、二乙氧磷酰硫膽堿、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、纖連蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚內(nèi)消旋乳酸(PDLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)Ji基磷灰石、β-磷酸三鈣(β-TCP)、碳酸鈣、鈦以及金中的至少一種。應(yīng)予說明，蛋白聚糖是蛋白質(zhì)和糖鏈(糖胺聚糖)以共價(jià)鍵連接而成的一種復(fù)合糖。而且，胞外基質(zhì)還可以使用三維結(jié)構(gòu)體，該三維結(jié)構(gòu)體呈海綿狀，由用熱塑性高分子等高分子體制成的數(shù)均直徑為Inm IOOOnm的納米纖維構(gòu)成。優(yōu)選這種三維結(jié)構(gòu)體的空隙率為80% 99. 99%。優(yōu)選作為胞外基質(zhì)使用的膠原蛋白采用I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合物即I型/III型混合膠原蛋白。I型膠原蛋白是基礎(chǔ)膠原蛋白，即纖維性膠原蛋白。III型膠原蛋白形成與膠原蛋白纖維不同的稱為網(wǎng)狀纖維的細(xì)網(wǎng)眼狀結(jié)構(gòu)，成為細(xì)胞等的支架。優(yōu)選III型膠原蛋白在上述混合膠原蛋白中的比例在10重量％以上50重量％以下。這是因?yàn)槿绻鸌II型膠原蛋白的比例大于50重量％，則混合膠原蛋白可能會(huì)無法固化。另一方面，如果III型膠原蛋白的比例小于10重量％，則I型膠原蛋白的比例增加，可能不會(huì)發(fā)生后述血管新生，而是使牙本質(zhì)再生。接著，用圖2對(duì)本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制備方法進(jìn)行說明。圖2是對(duì)非拔牙根管填充材料200的制備方法進(jìn)行說明的說明圖。非拔牙根管填充材料200通過使牙髓干細(xì)胞220附著在胞外基質(zhì)210的根尖側(cè)而形成。優(yōu)選牙髓干細(xì)胞220附著非拔牙根管填充材料200根尖部的1/4 2/3，更優(yōu)選附著根尖部的1/3。作為根管填充材料的制備方法的一個(gè)具體例，首先，向自動(dòng)移液器(Pipetman)的內(nèi)管等中吸入10 μ 1 13μ 1的I型/III型混合膠原蛋白，然后吸入7 μ 1 10 μ 1混合有牙髓干細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白(例如膠原蛋白XYZ (新田明膠))，總吸入量為20μ1。優(yōu)選在吸入自動(dòng)移液器的內(nèi)管等時(shí)以緩慢的速度抽吸，以避免產(chǎn)生氣泡。這是因?yàn)槿绻芴畛洳牧蟽?nèi)部產(chǎn)生氣泡，則所產(chǎn)生的氣泡會(huì)妨礙細(xì)胞的遷移并不利于牙組織再生的促進(jìn)。優(yōu)選自動(dòng)移液器的內(nèi)管的內(nèi)徑較細(xì)，例如可以使用內(nèi)管的下內(nèi)徑為0. 5 0. 7mm的自動(dòng)移液器，例如可使用QSP公司的H-010-96RS微細(xì)吸頭(MicroCapillary Tip)。非拔牙根管填充材料的形狀沒有特別限定，其形狀例如為圓錐、圓臺(tái)、圓柱等。接著，用圖3A 圖3F對(duì)使用非拔牙根管填充材料200的牙組織再生方法進(jìn)行說明。
如圖3A所示，本實(shí)施方式所涉及的牙髓組織再生方法對(duì)作為例如患有牙髓炎的對(duì)象牙齒100，以非拔牙的方式進(jìn)行牙組織再生。對(duì)象牙齒是指，由于齲齒、牙髓炎等，細(xì)菌感染擴(kuò)及冠部牙髓或根部牙髓的牙齒。如圖:3B所示，對(duì)對(duì)象牙齒100進(jìn)行牙髓摘除或受感染根管的根管擴(kuò)大清創(chuàng)。牙髓摘除是指，將存在于牙齒內(nèi)部的牙髓除去的行為。受感染根管是指，在細(xì)菌到達(dá)牙髓后再擴(kuò)及根管壁的牙本質(zhì)的情況下的根管，根管擴(kuò)大清創(chuàng)后是指，將受感染根管中的細(xì)菌除去后。優(yōu)選在摘除牙髓后，通過將對(duì)象牙齒的根管擴(kuò)大，使根尖部的根管的大小達(dá)到規(guī)定的粗細(xì)。這是因?yàn)槿绾笏?，將非拔牙根管填充材?00填充到已摘除牙髓或完成受感染根管治療的根管內(nèi)時(shí)，事先將根管擴(kuò)大的方式更容易填充非拔牙根管填充材料200，而且血管和神經(jīng)也更容易從根尖牙周組織進(jìn)入。此處，根尖是指與對(duì)象牙齒的牙槽骨結(jié)合的端部(牙根的尖端部分)。例如，在圖;3B中，優(yōu)選根尖部根管的粗細(xì)d為根管直徑在0. 7mm以上1. 5mm以下。這是因?yàn)槿绻艿拇旨?xì)d小于0. 7mm，則血管和神經(jīng)難以從根尖牙周組織進(jìn)入，并且非拔牙根管填充材料200的填充可能難以進(jìn)行；另一方面，如果根管的粗細(xì)大于1. 5mm，則對(duì)象牙齒可能會(huì)受到不必要的負(fù)擔(dān)而變得容易破裂。接著，如圖3C所示，用小鑷子等將非拔牙根管填充材料200填充到根管的根尖側(cè)。由于非拔牙根管填充材料200含有生物學(xué)材料，因此能夠作為生物學(xué)的根管填充材料。優(yōu)選將非拔牙根管填充材料200填充到根管內(nèi)牙髓存在過之處即牙髓對(duì)應(yīng)部位。應(yīng)予說明，在胞外基質(zhì)210為凝膠狀的情況下，無法用小鑷子等夾住胞外基質(zhì)210，此時(shí)要利用自動(dòng)移液器、注射等注入胞外基質(zhì)210。在將非拔牙根管填充材料200注入根管的根尖側(cè)后，如圖3D所示，將明膠610注入非拔牙根管填充材料200的上部，用樹脂620將其覆蓋。由此，使根管內(nèi)的牙組織再生。如圖3E所示，再生的牙組織為例如為根管內(nèi)的牙髓固有組織、血管400、神經(jīng)等。而且，通過使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等形態(tài)發(fā)生因子，再生的牙組織還包括牙本質(zhì)。并且，在將非拔牙根管填充材料200填充到受感染根管內(nèi)的情況下，再生的牙組織，還包括牙周膜(使牙齒固立在牙槽骨上的牙周組織)、牙骨質(zhì)等牙周組織。然后，如圖3F所示，一次性除去樹脂620，將BMI^s等形態(tài)發(fā)生因子630或牙本質(zhì)形成因子涂布在牙冠部牙髓上，用樹脂620進(jìn)行覆蓋。如圖3G所示，通過將形態(tài)發(fā)生因子630或牙本質(zhì)形成因子涂布到牙冠部牙髓上，還能使牙本質(zhì)500再生。使用本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200進(jìn)行的牙組織再生，在再生組織中未出現(xiàn)內(nèi)部吸收和外部吸收，而且也未出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上?？紤]到若出血所產(chǎn)生的血塊大量存在則會(huì)對(duì)牙髓組織再生造成障礙，由于本實(shí)施方式所涉及的發(fā)明是非拔牙，因此能夠?qū)⒀獕K的產(chǎn)生抑制得很低，從而能夠有效率地促進(jìn)牙組織再生。并且，由于本實(shí)施方式所涉及的發(fā)明是非拔牙，因此能夠在根管上敷藥，待根管擴(kuò)大后的出血或癥狀消失后再進(jìn)行根管填充，從而能夠更貼近實(shí)際臨床治療。應(yīng)予說明，如上所述，對(duì)象牙齒100是因齲齒、牙髓炎等細(xì)菌感染擴(kuò)及冠部牙髓或根部牙髓的牙齒，但并不限于此，對(duì)象牙齒100還包括神經(jīng)功能降低咬合感減弱的牙齒。在此情況下，通過在摘除牙髓后填充非拔牙根管填充材料200，能夠使牙髓再生以提高咬合
13感。而且，如圖3H所示，對(duì)象牙齒100還包括細(xì)菌感染擴(kuò)及根尖牙周組織的牙齒(細(xì)菌到達(dá)牙髓后再擴(kuò)及根管壁的牙本質(zhì)和根尖牙周組織的牙齒)。這樣的牙齒多伴隨有根尖性牙周炎110。對(duì)受感染根管進(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后注入非拔牙根管填充材料200。《第二實(shí)施方式》圖4A和圖4B是本發(fā)明第二實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的說明圖。如圖4A所示，非拔牙根管填充材料200使牙髓干細(xì)胞220附著在根管的根尖側(cè)，并使包含細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子230附著在根管的牙冠側(cè)(例如根管的上部1/2 2/3)。使牙髓干細(xì)胞220附著在根管的根尖側(cè)，并使趨化因子230附著在根管的牙冠側(cè)的原因是，即便讓牙髓干細(xì)胞220附著至根管的牙冠側(cè)，也無法供給來自組織的營養(yǎng)，可能會(huì)發(fā)生壞死。而且，附著在根管的根尖側(cè)的牙髓干細(xì)胞220被附著在根管的牙冠側(cè)的趨化因子所牽引，易于促進(jìn)牙組織再生。應(yīng)予說明，如圖4B所示，可以在非拔牙根管填充材料200的根管的牙冠側(cè)殘留胞外基質(zhì)210。細(xì)胞趨化因子是指，通過與受體結(jié)合來激活與細(xì)胞遷移有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的分子。細(xì)胞增殖因子是指，通過與受體結(jié)合來激活與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的分子。神經(jīng)營養(yǎng)因子是指，通過與受體結(jié)合來激活與細(xì)胞存活有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的分子。血管新生因子是指，通過與受體結(jié)合來激活與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、抗細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的分子。優(yōu)選細(xì)胞趨化因子采用SDF-1、VEGF、G-CSF、SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一種。特別是MMP3的細(xì)胞遷移能較高，可優(yōu)選使用。優(yōu)選細(xì)胞增殖因子采用IGF、bFGF以及PDGF中的至少任一種。優(yōu)選神經(jīng)營養(yǎng)因子采用⑶NF、BDNF, NGF、神經(jīng)肽Y以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3中的至少一種。優(yōu)選血管新生因子采用內(nèi)皮細(xì)胞選凝素(E-selectin)、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子 1 (VCAMl)、ECSCR(Endothelial Cell-specific Chemotaxis Receptor)以及SLC6A6 (Solute Carrier Family 6Member 6)中的至少一種。趨化因子在附著有趨化因子的胞外基質(zhì)中的含有率在0. Ing/μ 1以上500ng/y 1以下。這是因?yàn)槿绻吇蜃拥暮新市∮?. Ing/μ 1，則遷移程度可能會(huì)減少。另一方面，如果趨化因子的含有率大于500ng/y 1，則可能會(huì)對(duì)對(duì)象牙齒產(chǎn)生難以預(yù)料的副作用。接著，用圖5對(duì)本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制備方法進(jìn)行說明。圖5是對(duì)使趨化因子230附著在根管的牙冠側(cè)的非拔牙根管填充材料200的制備方法進(jìn)行說明的說明圖。作為實(shí)施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的制備方法之一具體例，首先，向自動(dòng)移液器的內(nèi)管等中吸入10μ 1 13μ 1混合有趨化因子的I型/III型混合膠原蛋白(I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合比為1 1)，然后吸入7μ1 ΙΟμΙ混合有牙髓干細(xì)胞的I型/III型混合膠原蛋白，總吸入量為20 μ 1。在實(shí)施方式2中也優(yōu)選在吸入自動(dòng)移液器的內(nèi)管等時(shí)以緩慢的速度抽吸，以避免產(chǎn)生氣泡。而且，優(yōu)選自動(dòng)移液器的內(nèi)管的內(nèi)徑較細(xì)。由此，制備圖4Α所示的根管填充材料200。實(shí)施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的使用形態(tài)與實(shí)施方式1相同，在摘除牙髓后或?qū)κ芨腥靖苓M(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后，填充到非拔牙根管的根尖側(cè)。根據(jù)本實(shí)施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200，由于含有趨化因子，故能夠更有效率地進(jìn)行牙組織再生，再生組織中沒有內(nèi)部吸收，也未出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上。《第三實(shí)施方式》在上述第一實(shí)施方式中，使牙髓干細(xì)胞220附著在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖側(cè)形成非拔牙根管填充材料200。但并不限于這樣的實(shí)施方式，牙髓干細(xì)胞220還可以均勻混合在整個(gè)非拔牙根管填充材料200中。這種非拔牙根管填充材料200也能夠?qū)ρ栏l(fā)育完全的牙齒實(shí)現(xiàn)不發(fā)生內(nèi)部吸收或外部吸收，不會(huì)出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，并且成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上的牙組織再生。這種非拔牙根管填充材料200例如可通過以下方式制備將牙髓干細(xì)胞與I型/III型混合膠原蛋白(例如膠原蛋白XYZ(新田明膠))不產(chǎn)生氣泡地混合均勻。在上述第二實(shí)施方式中，使牙髓干細(xì)胞220附著在根管的根尖側(cè)，并使趨化因子230附著在根管的牙冠側(cè)，組成非拔牙根管填充材料200。但并不限于這樣的實(shí)施方式，牙髓干細(xì)胞220和趨化因子230可以一起均勻地混合在整個(gè)非拔牙根管填充材料200中。這種非拔牙根管填充材料200也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)牙根發(fā)育完全的牙齒不發(fā)生內(nèi)部吸收或外部吸收，不會(huì)出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，并且成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上的牙組織再生。該非拔牙根管填充材料200例如可通過以下方式制備將牙髓干細(xì)胞、趨化因子以及I型/III型混合膠原蛋白(例如膠原蛋白XYZ(新田明膠))不產(chǎn)生氣泡地混合均勻。[實(shí)施例]《實(shí)施例1》〈細(xì)胞分選和特征化〉摘出人牙髓后，用膠原酶在37°C下進(jìn)行1. 5小時(shí)酶消化分離出牙髓細(xì)胞后，以1 X 106cells/ml的濃度將細(xì)胞分散在含有2%血清的DMEM中，用CXCR4抗體在4°C下標(biāo)記30分鐘，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。人牙髓源性CXCR4陽性細(xì)胞占總量的20%。表1表示流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果。對(duì)于⑶四和⑶44，CXCR4陽性細(xì)胞與⑶105陽性細(xì)胞同樣在90%以上。對(duì)于⑶105，⑶105陽性細(xì)胞為90. 0%，而CXCR4陽性細(xì)胞為1.7%。對(duì)于⑶146，CXCR4陽性細(xì)胞與⑶105陽性細(xì)胞同樣為較低值。而且，對(duì)于用于未分化的干細(xì)胞的標(biāo)記物即⑶150，CXCR4陽性細(xì)胞顯示出比⑶105陽性細(xì)胞略高的值。[表1]
權(quán)利要求
1.一種非拔牙根管填充材料，其特征在于該非拔牙根管填充材料含有在摘除牙髓后或者在對(duì)受感染根管進(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后，插入非拔牙根管的根尖側(cè)的牙髓干細(xì)胞和胞外基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓干細(xì)胞包含牙髓CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、牙髓側(cè)群細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶對(duì)陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞以及⑶90陽性細(xì)胞中的至少任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓側(cè)群細(xì)胞為CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶M陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞或者⑶90陽性細(xì)胞中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述非拔牙根管填充材料使所述牙髓干細(xì)胞附著在根管的根尖側(cè)，并且使含有細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述細(xì)胞趨化因子為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、干細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶3、Slit以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子中的至少任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述細(xì)胞增殖因子為胰島素樣生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子以及血小板衍生生長因子中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述神經(jīng)營養(yǎng)因子為膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)肽Y以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述胞外基質(zhì)由生體親和性材料組成，該生體親和性材料包含膠原蛋白、人工蛋白聚糖、明膠、水凝膠、血纖蛋白、二乙氧磷酰硫膽堿、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、纖連蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼多糖、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚內(nèi)消旋乳酸、聚己內(nèi)酯、羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、碳酸鈣、鈦以及金中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓干細(xì)胞在所述胞外基質(zhì)中的含有率在IX IO3Cell/μ 1以上1 X IO6Cell/μ 1以下。
10.一種非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于該非拔牙的牙組織再生方法通過向摘除牙髓后或?qū)κ芨腥靖苓M(jìn)行根管擴(kuò)大清創(chuàng)后的非拔牙根管的根尖側(cè)注入含有牙髓干細(xì)胞和胞外基質(zhì)的非拔牙根管填充材料，使根管內(nèi)的牙組織再生。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述牙髓干細(xì)胞包含牙髓CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、牙髓側(cè)群細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶對(duì)陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞以及⑶90陽性細(xì)胞中的至少任一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述牙髓側(cè)群細(xì)胞為CXCR4陽性細(xì)胞、SSEA-4陽性細(xì)胞、FLK-I陽性細(xì)胞、⑶31陰性且⑶146陰性細(xì)胞、⑶M陽性細(xì)胞、⑶105陽性細(xì)胞、⑶150陽性細(xì)胞、⑶四陽性細(xì)胞、⑶34陽性細(xì)胞、⑶44陽性細(xì)胞、⑶73陽性細(xì)胞或者⑶90陽性細(xì)胞中的任一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述非拔牙根管填充材料使所述牙髓干細(xì)胞附著在根管的根尖側(cè)，并且使含有細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述細(xì)胞趨化因子為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、干細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶3、Slit以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子中的至少任一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述細(xì)胞增殖因子為胰島素樣生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子以及血小板衍生生長因子中的至少一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述神經(jīng)營養(yǎng)因子為膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)肽Y以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3中的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述胞外基質(zhì)由生體親和性材料組成，該生體親和性材料包含膠原蛋白、人工蛋白聚糖、明膠、水凝膠、血纖蛋白、二乙氧磷酰硫膽堿、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、纖連蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼多糖、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚內(nèi)消旋乳酸、聚己內(nèi)酯、羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、碳酸鈣、鈦以及金中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于在將所述根管填充材料注入所述根管的根尖側(cè)之前，通過對(duì)所述根管進(jìn)行擴(kuò)大，使根尖部的根管的粗細(xì)達(dá)到規(guī)定大小。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的非拔牙的牙組織再生方法，其特征在于所述牙髓干細(xì)胞在所述胞外基質(zhì)中的含有率IX IO3Cell/μ 1以上IX IO6Cell/μ 1以
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非拔牙根管填充材料，該非拔牙根管填充材料對(duì)牙根發(fā)育完全的牙齒能夠?qū)崿F(xiàn)不發(fā)生內(nèi)部吸收或外部吸收，不出現(xiàn)破牙質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞平滑地排列在牙本質(zhì)壁上的牙組織再生。非拔牙根管填充材料(200)含有牙髓干細(xì)胞(220)和胞外基質(zhì)(210)，在摘除牙髓后或?qū)κ芨腥靖苓M(jìn)行根管擴(kuò)大、清創(chuàng)后，插入非拔牙的根管的根尖側(cè)。牙髓干細(xì)胞例如為牙髓CXCR4陽性細(xì)胞。優(yōu)選使含有細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、和血管新生因子中的至少一種因子的趨化因子附著在根管的牙冠側(cè)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102596270SQ201080040308
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者中島美砂子, 庵原耕一郎 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人國立長壽醫(yī)療研究中心