Ddahi激動(dòng)劑的篩選方法和用ddahi激動(dòng)劑的療法的制作方法

專利名稱：：Ddahi激動(dòng)劑的篩選方法和用ddahi激動(dòng)劑的療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明來源于出人意料的發(fā)現(xiàn)DDAHI水平降低與門靜脈壓升高關(guān)聯(lián)，且通過增加體內(nèi)DDAHI水平可降低門靜脈壓。本發(fā)明利用這一發(fā)現(xiàn)來鑒定和提供可用于降低門靜脈壓，例如用于治療門靜脈高壓的DDAHI激動(dòng)劑。
背景技術(shù)：
：NIH對(duì)1976-80年時(shí)間段的統(tǒng)計(jì)表示，肝硬化在美國造成的死亡多于26，000例。如果將這一數(shù)據(jù)外推至包括目前在西方和在不發(fā)達(dá)世界日益增加的病毒性肝病和酒精性肝病負(fù)擔(dān)，這個(gè)數(shù)字將超過全世界每年數(shù)百萬例。隨著日益被認(rèn)識(shí)到為具有進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的慢性肝病的非酒精性脂肪肝病的新實(shí)體(與糖尿病和代謝綜合征關(guān)聯(lián))的識(shí)別，這一數(shù)字可能會(huì)繼續(xù)增加。肝硬化伴隨有主要來自門靜脈高壓的嚴(yán)重發(fā)病率和死亡率。門靜脈血管中血壓增加可能是因?yàn)榱鹘?jīng)血管的血體積增加或/和對(duì)經(jīng)過肝臟的血流的阻力增加。在西方國家中，門靜脈高壓的最常見原因是肝硬化中肝臟的廣泛結(jié)疤導(dǎo)致對(duì)血流的阻力增加，肝硬化通常是由于長(zhǎng)期過量的酒精攝取。門靜脈高壓導(dǎo)致新靜脈(稱為側(cè)副管)的發(fā)育，其繞過肝臟直接連接門靜脈血管與體循環(huán)。由于這一旁路，通常被肝臟從血管去除的物質(zhì)(諸如毒素)可進(jìn)入體循環(huán)。側(cè)副管尤其在食道下端部和胃的上部發(fā)育。在這里，血管可變得靜脈曲張。這些充血的靜脈曲張血管是脆弱的并容易出血，有時(shí)是嚴(yán)重的，偶爾有致命結(jié)果。部分由于諸如β-阻滯劑的藥劑的耐受性，降低門靜脈壓以減少靜脈曲張出血風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)有療法局限于約40%效力。而且，有意見認(rèn)為這種藥劑減少肝臟灌注，可能進(jìn)一步危害肝臟功能，因?yàn)楸M管有系統(tǒng)性血管舒張，肝硬化中肝部血流已經(jīng)是低的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及降低門靜脈血壓的方法。根據(jù)本發(fā)明，這通過施用DDAHI的激動(dòng)劑來實(shí)現(xiàn)，所述DDAHI的激動(dòng)劑即能夠增加或保持DDAHI的活性或量，尤其是待治療的受治療者肝臟中存在的DDAHI的活性或量的藥劑。因此，本發(fā)明提供降低門靜脈血壓的方法，包括向需要其的受治療者施用DDAHI的激動(dòng)劑，其中所述激動(dòng)劑優(yōu)選不減少受治療者的血漿TNFα水平。該激動(dòng)劑可導(dǎo)致(a)受治療者肝臟中DDAHI的表達(dá)增加；和/或(b)受治療者肝臟中DDAHI的水平增加。例如，該激動(dòng)劑可促進(jìn)受治療者細(xì)胞中DDAHI的轉(zhuǎn)錄，或該激動(dòng)劑可以是能夠在受治療者肝臟中表達(dá)DDAHI的載體。該激動(dòng)劑可增加個(gè)體肝臟中DDAHI的活性。因此，激動(dòng)劑可導(dǎo)致個(gè)體肝臟中(a)非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平減少；和/或(b)—氧化氮合酶(N0Q水平增加。待治療的受治療者可以是需要降低的門靜脈壓的任何受治療者，諸如患有門靜脈高壓的受治療者。受治療者可患有肝硬化。本發(fā)明還提供可用于鑒定在這些治療方法使用的適合的DDAHI激動(dòng)劑的篩選方法。因此，本發(fā)明提供鑒定適用于治療門靜脈高壓的藥劑的方法，所述方法包括確定受試藥劑是否能夠增加或保持DDAHI的量或活性，其中增加或保持DDAHI的量或活性的能力指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。篩選方法可包括以下步驟將包含DDAHI的細(xì)胞或組織與受試藥劑接觸并確定受試藥劑的存在是否導(dǎo)致細(xì)胞或組織中DDAHI的量或活性的增加。DDAHI的量或活性可在肝臟或來源于肝臟的組織或細(xì)胞中評(píng)價(jià)。例如，篩選方法可在膽管結(jié)扎的大鼠中進(jìn)行，該方法可包括以下步驟向膽管結(jié)扎的大鼠施用受試藥劑并確定受試藥劑的存在是否導(dǎo)致所述大鼠肝臟中DDAHI的量或活性的增加。本發(fā)明的篩選方法還可包括確定受試藥劑是否能夠抑制TNFα，其中增加DDAHI的量或活性的能力聯(lián)合不存在對(duì)TNFα的抑制作用指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。附圖簡(jiǎn)述圖1報(bào)告每分鐘每毫克蛋白的14C-瓜氨酸計(jì)數(shù)。這是eNOS活性的量度。在膽管結(jié)扎的(BDL)或模擬處理(shamtreated)的大鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用英夫利昔單抗(BDL+英夫利昔單抗)或運(yùn)載體(vehicle)(BDL)治療膽管結(jié)扎的大鼠。本圖顯示，膽管結(jié)扎明顯減少eNOS活性，但隨后以英夫利昔單抗治療恢復(fù)eNOS活性到與在模擬動(dòng)物中觀察到的相似水平。圖2報(bào)告在模擬大鼠或BDL大鼠肝臟組織中的ADMA水平。以英夫利昔單抗(BDL+INF)或運(yùn)載體(BDL)治療BDL大鼠。膽管結(jié)扎導(dǎo)致與模擬動(dòng)物相比組織ADMA濃度顯著升高。然而，以英夫利昔單抗治療顯著減少ADMA水平。有趣的是，與模擬動(dòng)物相比，BDL動(dòng)物肝臟組織中ADMA的相對(duì)濃度/積累比血漿ADMA濃度差異大得多。圖3說明BDL大鼠肝臟中DDAH-I同種型的明顯減少的表達(dá)。用英夫利昔單抗治療后，DDAH-I表達(dá)水平恢復(fù)到模擬動(dòng)物水平。圖4報(bào)告在模擬大鼠或BDL大鼠中的門靜脈壓。BDL肝硬化大鼠中的門靜脈壓比正常模擬動(dòng)物門靜脈壓明顯升高(14士0.7vs.5.5士0.3mmHg)。以英夫利昔單抗介入后，門靜脈壓被減少多于30%(9.5士0.6mmHg)。圖5和圖6報(bào)告肝臟eNOS活性(圖5)和肝臟eNOS蛋白表達(dá)(圖6)。發(fā)現(xiàn)盡管eNOS蛋白表達(dá)增加(**-p<0.01)，BDL動(dòng)物中的eNOS活性與模擬相比顯著減少(*_p<0.05)。以INT-747治療后，eNOS活性恢復(fù)到模擬動(dòng)物水平(*_p<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)也類似地正?；?*_P<0.05)。圖7和圖8報(bào)告肝臟ADMA蛋白表達(dá)(圖7)和肝臟DDAHl蛋白表達(dá)(圖8)。發(fā)現(xiàn)BDL動(dòng)物中ADMA表達(dá)顯著增加(#-p<0.01)，伴隨著DDAH-I蛋白表達(dá)顯著減少(**_p<0.01)。施用INT-747后，與僅BDL相比，DDAH-I表達(dá)顯著增加(**-p<0.01)和ADMA顯著減少(*_P<0.05)。圖9報(bào)告在模擬大鼠或BDL大鼠中的門靜脈壓。BDL大鼠中的門靜脈壓與模擬相比顯著增加<0.0001)。在INT-747治療后，與BDL+運(yùn)載體相比門靜脈壓降低30%(**-ρ<0.01)。圖10報(bào)告DDAHIcDNA的重構(gòu)對(duì)模擬大鼠或BDL大鼠中門靜脈壓的作用。發(fā)明詳述二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)是見于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的酶。存在兩種同種型DDAHI和DDAHII，兩種同種型的組織分布有一些差異。DDAH降解甲基精氨酸，具體為非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)和NG-單甲基-L-精氨酸(MMA)。甲基精氨酸ADMA和MMA抑制一氧化氮合酶產(chǎn)生。因此，DDAH在去除由蛋白降解產(chǎn)生并抑制一氧化氮產(chǎn)生的甲基精氨酸的積累方面是重要的。DDAHII此前已被與內(nèi)皮NO合酶表達(dá)程度以及與血管發(fā)生相關(guān)聯(lián)。因此，DDAH同種型DDAHII是此前研究的目標(biāo)。發(fā)明人現(xiàn)在出人意料地發(fā)現(xiàn)，在肝硬化的建立模型中(諸如膽管結(jié)扎的大鼠-BDL，與模擬大鼠相比)DDAHI同種型的表達(dá)顯著減少。發(fā)現(xiàn)在加上炎癥/感染(通過內(nèi)毒素攻擊)的情況中DDAHI同種型的表達(dá)進(jìn)一步減少。而且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過增加DDAHI活性或通過增加其表達(dá)激動(dòng)DDAHI，導(dǎo)致eNOS活性增加、甲基精氨酸(諸如ADMA)水平減少和門靜脈壓顯著降低。因此，本發(fā)明在于增強(qiáng)DDAHI表達(dá)和/或活性，以降低肝臟ADMA，增加肝臟NO產(chǎn)生和降低門靜脈壓。這在臨床情形尤其是肝硬化中有治療門靜脈高壓升高的效用，其中門靜脈高壓升高與靜脈曲張出血增加直接關(guān)聯(lián)。DDAHI激動(dòng)劑本發(fā)明涉及DDAHI的激動(dòng)。DDAHI的激動(dòng)劑可以是增加DDAHI活性、功能或量的任何化合物或分子。優(yōu)選地，激動(dòng)劑在患者肝臟中具有其功能。優(yōu)選地，激動(dòng)劑導(dǎo)致施用激動(dòng)劑的個(gè)體肝臟中DDAHI活性、功能或量的增加。激動(dòng)劑可優(yōu)先在肝臟中作用，或可在包括肝臟的多個(gè)位置作用。如以下進(jìn)一步討論，激動(dòng)劑可在施用期間被靶向于肝臟。優(yōu)選激動(dòng)劑是與不存在激動(dòng)劑時(shí)觀察到的量相比增加DDAHI的活性或量至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的那些。例如，這些大小的增加可在已施用激動(dòng)劑的受治療者的肝臟或肝臟組織觀察到。激動(dòng)劑可特異性地作用以激動(dòng)DDAHI。即，激動(dòng)劑對(duì)DDAHI的作用可大于激動(dòng)劑的任何其他生物作用。這樣的激動(dòng)劑可以是對(duì)DDAHI的激活特異性的，即其可增加或保持DDAHI但不是其他酶的活性。這樣的激動(dòng)劑可以是對(duì)DDAHI的表達(dá)特異性的，即其可增加或保持DDAHI但不是其他蛋白的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明使用的激動(dòng)劑可以是如本文所述的DDAHI的激動(dòng)劑，其不作為TNFa拮抗劑起作用。根據(jù)本發(fā)明使用的激動(dòng)劑可優(yōu)先于DDAHII對(duì)DDAHI起作用。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的DDAHI的激動(dòng)劑可具有如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑的一個(gè)或多個(gè)特征，但對(duì)于DDAHII可能不具有所述特征，或可能對(duì)于DDAHII具有的所述特征與DDAHI相比水平較低。例如，增加DDAHI活性的激動(dòng)劑可能不增加DDAHII活性，或可能與其對(duì)DDAHI的作用相比增加DDAHII活性的程度較小，諸如較低的百分比增加。增加DDAHI的表達(dá)或量的激動(dòng)劑可能不增加DDAHII的表達(dá)或量，或可能與其對(duì)DDAHI的作用相比增加DDAHII表達(dá)的程度較小，諸如較低的百分比增加。能夠刺激DDAHI活性或功能的任何藥劑可適用于本發(fā)明的方法。DDAHI的主要功能是酶促降解甲基精氨酸諸如非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)。因此，本發(fā)明的激動(dòng)劑可作用以增加甲基精氨酸被DDAHI的降解，諸如ADMA的降解。本發(fā)明的激動(dòng)劑可作用以增加DDAHI的活性、功能或量，從而導(dǎo)致優(yōu)選肝臟中的甲基精氨酸諸如ADMA的水平減少。因此，可根據(jù)導(dǎo)致肝臟中ADMA水平減少的能力鑒定激動(dòng)劑活性。甲基精氨酸諸如ADMA抑制一氧化氮合酶(NOS)產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的激動(dòng)劑可作用以增加DDAHI的活性、功能或量，從而增加NOS的水平，優(yōu)選在肝臟中的NOS的水平。因此，可根據(jù)增加肝臟中NOS水平的能力鑒定激動(dòng)劑活性。根據(jù)本發(fā)明使用的激動(dòng)劑可以是直接或間接DDAHI激動(dòng)劑。直接激動(dòng)劑是其活性直接針對(duì)DDAHI的藥劑。例如，直接激動(dòng)劑可以是直接作用于DDAHI酶以增加或保持其活性的藥劑。直接激動(dòng)劑可以是阻止DDAHI降解或增加其體內(nèi)半衰期的藥劑。直接激動(dòng)劑可以是穩(wěn)定DDAHI酶的藥劑。直接激動(dòng)劑可通過向患者提供另外的DDAHI來增加DDAHI的量。直接激動(dòng)劑可以是作用于DDAHI基因、啟動(dòng)子或其他基因調(diào)節(jié)區(qū)以增加或保持DDAHI表達(dá)的藥劑。直接激動(dòng)劑可通過刺激或保持從內(nèi)源DDAHI基因的表達(dá)來增加或保持DDAHI表達(dá)。直接激動(dòng)劑可通過向相關(guān)細(xì)胞提供另外的DDAHI基因從而可實(shí)現(xiàn)從這種另外多核苷酸表達(dá)，來增加或保持DDAHI表達(dá)。例如，類法尼醇(Farnesoid)受體激動(dòng)劑INT-747是膽汁酸響應(yīng)性核受體，促進(jìn)包括DDAHI的多種靶基因表達(dá)。如實(shí)施例中所示，發(fā)明人已經(jīng)顯示，INT-747作用以增加肝臟中DDAHI表達(dá)。DDAHI水平的這一增加導(dǎo)致肝臟組織中ADMA水平的相伴減少，NOS活性增加，和最終門靜脈壓降低。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的DDAHI的激動(dòng)劑可以是促進(jìn)DDAHI表達(dá)的藥劑，諸如類法尼醇受體激動(dòng)劑，諸如類法尼醇受體激動(dòng)劑INT-747。間接藥劑是其活性導(dǎo)致DDAHI激動(dòng)，但不直接作用于DDAHI的藥劑。例如，間接激動(dòng)劑包括可能作為下游作用刺激DDAHI的藥劑諸如抗炎劑或抗TNFα劑。因此，DDAHI的激動(dòng)劑可以是具有導(dǎo)致DDAHI的活性、功能或量增加的作用的藥劑。例如，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，抗TNFa抗體英夫利昔單抗能夠增加膽管結(jié)扎的大鼠的肝臟中的DDAHI水平。如實(shí)施例中所示，DDAHI水平的這一增加導(dǎo)致肝臟組織中ADMA水平的相伴減少，NOS活性增加，和最終門靜脈壓降低。因此，本文所述的任何激動(dòng)劑可用于激動(dòng)DDAHI，即增加DDAHI的存在量、和/或DDAHI的活性或功能。優(yōu)選地，這些激動(dòng)作用發(fā)生在肝臟。能夠激動(dòng)DDAHI的一些藥劑可能不適于作為本文所述治療的一部分而體內(nèi)施用。能夠激動(dòng)DDAHI的一些藥劑尤其是一些間接激動(dòng)劑，可能對(duì)患者具有其他有害作用。醫(yī)師將能夠?yàn)閭€(gè)體患者權(quán)衡這些有害副作用是否超出本文所述的DDAHI激動(dòng)作用的可能益處，以便為本文所述的用途選擇適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑。例如，Naveau等Ofepatology(2004)39:1390-1397)報(bào)道，向急性酒精性肝炎患者系統(tǒng)施用英夫利昔單抗聯(lián)合潑尼松龍導(dǎo)致高水平嚴(yán)重感染，其被認(rèn)為是不可接受的。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的激動(dòng)劑可以是如本文所述激動(dòng)DDAHI，但不具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥劑。例如，該激動(dòng)劑可以是如本文所述激動(dòng)DDAHI，但不減少促炎性細(xì)胞因子水平和/或不具有抗TNFa作用的藥劑。該激動(dòng)劑可以對(duì)體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子水平無影響和/或可以對(duì)體內(nèi)血漿TNFα水平無影響。例如，該激動(dòng)劑可以是如本文所述激動(dòng)DDAHI，并非抗TNFα抗體諸如英夫利昔單抗的藥劑。DDAHI的激動(dòng)劑可以是增加內(nèi)源DDAHI產(chǎn)生的藥劑。例如，該藥劑可在受治療者細(xì)胞中作用以增強(qiáng)或刺激DDAHI的表達(dá)。這樣的藥劑可以是作用于DDAHI基因以促進(jìn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或增強(qiáng)子。例如，這樣的藥劑可以是核受體，諸如類法尼醇受體激動(dòng)劑INT-747。DDAHI的激動(dòng)劑可以是為個(gè)體的細(xì)胞提供產(chǎn)生另外的DDAHI的能力的藥劑。例如，該藥劑可以是能夠表達(dá)DDAHI的載體，諸如包含DDAHI基因和表達(dá)該基因必需的其他序列的表達(dá)載體。因此，可通過向細(xì)胞遞送這樣的載體并允許發(fā)生從載體轉(zhuǎn)錄來提供DDAHI。該藥劑可以是能夠表達(dá)DDAHI的多核苷酸，諸如包含DDAHI基因和將DDAHI基因整合入宿主基因組并允許從該插入的DDAHI基因序列表達(dá)所必需的其他序列的載體。用于基因遞送的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見例如，美國專利號(hào)5，399，346,5,580，859和5，589，466。多核苷酸可在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下表達(dá)。例如，DDAHI多核苷酸的表達(dá)可通過利用肝臟特異性啟動(dòng)子被靶向于肝臟。因此，激動(dòng)劑可以是包含DDAHI基因和肝臟特異性啟動(dòng)子的多核苷酸或載體。例如，如實(shí)施例4所述，可使用肝臟特異性LPl啟動(dòng)子。如實(shí)施例4所述，肝臟局限性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生可利用包含人類apoE/CI肝臟控制區(qū)(HCR)和α-l-抗胰蛋白酶(hAAT)基因啟動(dòng)子的區(qū)段的截短的肝臟特異性啟動(dòng)子LPl實(shí)現(xiàn)，如Osman等.Atherosclerosis2009,204:121-6所述。核酸分子可被直接引入接受的受治療者，或可被活體外引入已從受治療者取出的細(xì)胞中。在后一種情形，包含DDAHI載體的細(xì)胞可被再引入受治療者的適當(dāng)部位，諸如引入受治療者的肝臟。用于這種基因遞送的不同方法是本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域讀者將會(huì)領(lǐng)會(huì)。例如，DDAHI基因可被作為裸核酸構(gòu)建體遞送，優(yōu)選還包括宿主細(xì)胞基因組同源的側(cè)翼序列。DDAHI基因可在載體諸如質(zhì)粒載體或病毒載體中遞送。適當(dāng)?shù)闹亟M病毒載體包括但不限于腺病毒載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體。例如，已報(bào)道利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)肝病的嚙齒動(dòng)物模型中的肝細(xì)胞和其他細(xì)胞類型(Yu等.AmJPhys2002,282:G565-G572,Garcia-Banuelos等.GeneTherapy2002,9:127-134)這樣的腺病毒載體可根據(jù)本發(fā)明使用。類似地，還已報(bào)道以帶有AAV8衣殼的AAV2基因組(AAV2/8)轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟(Osman等。Atherosclerosis2009,204:121-6)這樣的AAV2/8載體也可根據(jù)本發(fā)明使用。DDAHI基因可在脂質(zhì)體制品諸如陽離子脂質(zhì)體制品中施用。篩選方法本發(fā)明還提供鑒定適用于治療門靜脈高壓的藥劑的方法。例如，本發(fā)明提供鑒定適用于降低門靜脈壓的DDAHI激動(dòng)劑的方法。這一方法鑒定的激動(dòng)劑可以是具有上述任何特征或作用的DDAHI激動(dòng)劑。因此，本發(fā)明提供鑒定用于治療門靜脈高壓的藥劑的方法，該方法包括確定受試藥劑是否能夠增加或保持DDAHI的活性或表達(dá)。例如，所述方法可包括確定受試藥劑是否能夠增加或保持DDAHI的量或活性，其中增加DDAHI的量或活性的能力或保持DDAHI的量或活性的能力指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。用在本發(fā)明篩選方法中的受試藥劑是指可能潛在地激動(dòng)DDAHI的任何化合物、分子或藥劑。受試藥劑可以是，或可包括，例如經(jīng)由合理藥物設(shè)計(jì)從已知DDAHI激動(dòng)劑出發(fā)而設(shè)計(jì)的肽、多肽、蛋白、多核苷酸、小分子或其他化合物。受試藥劑可以是具有如上述DDAHI激動(dòng)劑的一種或多種特征的任何藥劑。例如，受試藥劑可以是能夠增加肝臟中NOS水平的藥劑。待篩選的受試藥劑可從化學(xué)組合物或人造化合物衍生或合成。候選藥劑可從包括合成化合物或天然化合物文庫的多種來源獲得?？稍谝陨蠙z驗(yàn)中測(cè)試的適當(dāng)?shù)氖茉囁巹┌◤慕M合文庫、小分子文庫和天然產(chǎn)物文庫，諸如展示(如，噬菌體展示)文庫衍生的化合物。可利用本發(fā)明方法篩選多種受試藥劑以鑒定對(duì)DDAHI具有適當(dāng)作用，諸如刺激DDAHI活性或表達(dá)的一種或多種藥劑。本發(fā)明的篩選方法可體內(nèi)、活體外或體外進(jìn)行。具體地，將受試藥劑與DDAHI或與包含DDAHI的細(xì)胞或組織接觸的步驟可體內(nèi)、活體外或體外進(jìn)行。本發(fā)明的篩選方法可在基于細(xì)胞的系統(tǒng)或無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。例如，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟將包含DDAHI的細(xì)胞或組織與受試藥劑接觸并確定受試藥劑的存在是否導(dǎo)致細(xì)胞或組織中DDAHI量或活性的增加。例如，受試藥劑增加或保持DDAHI活性或表達(dá)的能力可在表達(dá)DDAHI的宿主細(xì)胞或組織中測(cè)試。例如，DDAHI的量或活性可在肝臟或來源于肝臟的組織或細(xì)胞中體外、體內(nèi)或活體外評(píng)價(jià)。在這樣的基于細(xì)胞的檢驗(yàn)中，DDAHI和/或受試藥劑可以是宿主細(xì)胞或組織內(nèi)源的，可被引入宿主細(xì)胞或組織，可通過促使或允許表達(dá)構(gòu)建體或載體的表達(dá)而被引入宿主細(xì)胞或組織，或可通過刺激或激活從細(xì)胞中的內(nèi)源基因表達(dá)而被引入宿主細(xì)胞或組織。在這樣的基于細(xì)胞的方法中，存在或不存在受試藥劑時(shí)DDAHI的活性可通過評(píng)價(jià)細(xì)胞或組織中DDAHI水解甲基精氨酸諸如ADMA的能力來確定。例如，可對(duì)細(xì)胞或組織提供ADMA或細(xì)胞或組織可包含ADMA。在這樣的基于細(xì)胞的方法中，可在存在或不存在受試藥劑時(shí)評(píng)價(jià)DDAHI的量以確定該藥劑是否改變細(xì)胞或組織中DDAHI的量，諸如通過調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織中的DDAHI表達(dá)或通過穩(wěn)定細(xì)胞或組織中的DDAHI蛋白。在任一種情形中，在受試藥劑存在時(shí)細(xì)胞或組織中存在更高DDAHI活性或DDAHI量增加，指示該受試藥劑可以是用于根據(jù)本發(fā)明降低門靜脈壓的適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的基于細(xì)胞的檢驗(yàn)可對(duì)來源于待治療的患者的細(xì)胞或組織體外或活體外進(jìn)行。因此可確定受試藥劑是否能夠增加或保持該受治療者的細(xì)胞或組織中DDAHI的活性或量。例如，這樣的方法可對(duì)來自患者肝臟的細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行。本發(fā)明的方法可使用無細(xì)胞檢驗(yàn)。例如，DDAHI可在無細(xì)胞環(huán)境中存在。適當(dāng)?shù)臒o細(xì)胞檢驗(yàn)可在細(xì)胞提取物中進(jìn)行。例如，本發(fā)明方法的接觸步驟可在可表達(dá)、產(chǎn)生或以其他方式包含DDAHI和/或甲基精氨酸諸如ADMA和/或受試藥劑的細(xì)胞獲得的提取物中進(jìn)行。包含DDAHI的無細(xì)胞系統(tǒng)可與本發(fā)明方法的其他組分諸如受試藥劑和/或甲基精氨酸諸如ADMA—起孵育。另外，無細(xì)胞系統(tǒng)可在使得DDAHI能夠作用以水解甲基精氨酸諸如ADMA的條件下在受試藥劑不存在時(shí)孵育。在這樣的無細(xì)胞方法中，存在或不存在受試藥劑時(shí)DDAHI的活性可通過評(píng)價(jià)DDAHI水解甲基精氨酸諸如ADMA的能力來確定。在這樣的無細(xì)胞方法中，可在存在或不存在受試藥劑時(shí)評(píng)價(jià)DDAHI的量以確定該藥劑是否改變細(xì)胞或組織中DDAHI的量，諸如通過穩(wěn)定DDAHI蛋白。在任一種情形中，在受試藥劑存在時(shí)存在更高DDAHI活性或DDAHI量增加，指示該受試藥劑可以是用于根據(jù)本發(fā)明降低門靜脈壓的適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑。本發(fā)明方法的接觸步驟可包括孵育各組分。這樣的孵育可在任何適當(dāng)?shù)臏囟冗M(jìn)行，通常4°C至40°C?？蔀榱俗顑?yōu)活性選擇孵育時(shí)間段，但也可被優(yōu)化以便于快速高通量篩選。在接觸步驟和任選的孵育步驟后，本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括洗滌步驟以去除未結(jié)合的組分，其中通常在需要去除檢測(cè)中產(chǎn)生背景信號(hào)的標(biāo)記諸如放射性或熒光標(biāo)記的非特異性結(jié)合的組分時(shí)采用這樣的洗滌步驟。細(xì)胞系統(tǒng)或無細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)中的孵育可在微量滴定板(如，96孔板或其他微孔板)中進(jìn)行。另外，孵育可以自動(dòng)方式進(jìn)行(如，對(duì)于高通量篩選)。本發(fā)明的篩選方法可體內(nèi)進(jìn)行。例如，篩選方法可在動(dòng)物模型中進(jìn)行。在這樣的體內(nèi)模型中，受試藥劑的作用可在肝臟中評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，動(dòng)物是非人類動(dòng)物諸如大鼠。例如，如實(shí)施例中所述，篩選方法可在膽管-結(jié)扎的大鼠模型中進(jìn)行。如實(shí)施例所示，大鼠的膽管結(jié)扎導(dǎo)致大鼠肝臟中DDAHI水平減少。因此，這樣的模型可適于鑒定能夠增加DDAHI水平的藥劑。因此，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟向膽管結(jié)扎的大鼠施用受試藥劑并確定受試藥劑的存在是否導(dǎo)致大鼠肝臟中DDAHI的量或活性的增加。這樣的模型可用于評(píng)價(jià)受試藥劑的體內(nèi)作用。例如，這樣的模型可用于評(píng)價(jià)受試藥劑是否能夠體內(nèi)增加或保持DDAHI的活性或量。在這樣的方法中，可評(píng)價(jià)DDAHI的量，可評(píng)價(jià)酶活性，可評(píng)價(jià)甲基精氨酸(如，ADMA)的水平或可評(píng)價(jià)NOS的量。體內(nèi)模型也可用于確定受試藥劑是否具有任何有害副作用。例如，本發(fā)明的方法可比較受試藥劑對(duì)DDAHI的作用與其對(duì)其他酶的作用以確定受試藥劑是否是特異性的。如本文所述，在一些實(shí)施方案中用于降低門靜脈壓的藥劑對(duì)促炎性細(xì)胞因子或TNFa的水平無影響可能是優(yōu)選的。本發(fā)明的篩選方法可包括在用受試藥劑治療后測(cè)量動(dòng)物中TNFa或促炎性細(xì)胞因子的水平以確定該藥劑是否調(diào)節(jié)動(dòng)物中細(xì)胞因子或TNFa的量的步驟。本發(fā)明的篩選方法可包括確定受試藥劑是否能夠抑制TNFa的步驟，其中增加DDAHI的量或活性的能力聯(lián)合不存在對(duì)TNFα的抑制作用指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。在這樣的體內(nèi)方法中，存在或不存在受試藥劑時(shí)DDAHI的活性可通過評(píng)價(jià)DDAHI水解甲基精氨酸諸如ADMA的能力或通過評(píng)價(jià)其下游結(jié)果諸如NOS水平來確定。在這樣的體內(nèi)方法中，可在存在或不存在受試藥劑時(shí)評(píng)價(jià)DDAHI的量以確定藥劑是否改變細(xì)胞或組織中DDAHI的量，諸如通過穩(wěn)定DDAHI蛋白改變細(xì)胞或組織中DDAHI的量。在任一種情形中，在受試藥劑存在時(shí)存在更高DDAHI活性或DDAHI量增加，指示該受試藥劑可以是用于根據(jù)本發(fā)明降低門靜脈壓的適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑。為DDAHI激動(dòng)劑的受試藥劑可導(dǎo)致在存在受試藥劑時(shí)比不存在受試藥劑時(shí)DDAHI活性或水平增加至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少60%、至少75%、至少100%或更多。這樣的增加可在被測(cè)試的樣品中觀察到，或例如當(dāng)該方法在動(dòng)物模型中進(jìn)行時(shí)，尤其是來自動(dòng)物的組織諸如肝臟中觀察到。DDAHI的水平或量可通過評(píng)價(jià)DDAHI基因的表達(dá)來測(cè)量?；虮磉_(dá)可通過觀察mRNA產(chǎn)生或水平或觀察蛋白產(chǎn)生或水平來評(píng)價(jià)。表達(dá)產(chǎn)物諸如mRNA和蛋白可通過本領(lǐng)域已知方法鑒定或定量。這樣的方法可利用雜交來特異性地鑒定目標(biāo)mRNA。例如這樣的方法可包括PCR或?qū)崟r(shí)PCR方法。鑒定或定量目標(biāo)蛋白的方法可包括使用結(jié)合該蛋白的抗體。例如，這樣的方法可包括蛋白印跡法。DDAHI基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可在存在和不存在受試藥劑時(shí)比較。如此，可鑒定以比不存在受試藥劑時(shí)觀察到的水平更高的水平增加DDAHI基因表達(dá)或保持DDAHI表達(dá)的受試藥劑。這樣的受試藥劑可以是根據(jù)本發(fā)明的適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑。DDAHI的活性可通過評(píng)價(jià)DDAHI酶活性產(chǎn)物的水平來測(cè)量。例如，DDAHI的活性可通過評(píng)價(jià)甲基精氨酸諸如ADMA或水平被DDAHI調(diào)節(jié)的下游產(chǎn)物諸如NOS的量來測(cè)量。例如，DDAH活性可如下評(píng)價(jià)如Ogawa等(J.BiolChem(1989)264=10205-10209)所述或如實(shí)施例所述通過確定L-瓜氨酸形成，或通過直接評(píng)價(jià)ADMA水平，如，通過HPLC或串聯(lián)質(zhì)譜。藥物制劑如本文所述的適當(dāng)?shù)腄DAHI激動(dòng)劑通常為了施用與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑一起配制。激動(dòng)劑可以是如本文定義的任何激動(dòng)劑，包括本發(fā)明篩選方法鑒定的任何激動(dòng)劑。因此，可用制藥領(lǐng)域常規(guī)的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，將激動(dòng)劑配制成藥物。制劑的確切性質(zhì)將依賴于包括期望施用途徑的多種因素。通?？蓪⒓?dòng)劑配制成用于口服、靜脈內(nèi)、胃內(nèi)、血管內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。藥物載體或稀釋劑例如可為等滲溶液例如生理鹽水。固體口服形式可含有與活性化合物一起的稀釋劑例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；潤(rùn)滑劑例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、和/或聚乙二醇；粘合劑例如淀粉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚劑例如淀粉、藻酸、藻酸鹽或羥乙酸淀粉鈉；泡騰混合物；染料；增甜劑；濕潤(rùn)劑，例如卵磷脂、聚山梨酯、硫酸月桂酯；以及藥物制劑中通常使用的無毒和無藥理學(xué)活性的物質(zhì)。這類藥物制劑可通過已知方式制備，例如通過混合、制粒、壓片、糖包衣或膜包衣工藝制備?？诜┯玫囊后w分散劑可以是糖漿劑、乳劑或懸浮劑。糖漿劑可含有作為載體的例如蔗糖，或者蔗糖與甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。懸浮劑和乳劑可含有作為載體的例如天然樹膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯醇。用于肌內(nèi)注射的懸浮劑或溶液可含有與鳥氨酸和乙酸苯酯和丁酸苯酯中的至少一種一起的藥學(xué)上可接受的載體，例如無菌水、橄欖油、油酸乙酯、二醇例如丙二醇，以及若需要，還可含適量的利多卡因鹽酸鹽。當(dāng)待施用的激動(dòng)劑是核酸分子時(shí)，例如當(dāng)激動(dòng)劑以表達(dá)載體形式時(shí)，核酸的攝取和/或表達(dá)的某些促進(jìn)劑(“促進(jìn)轉(zhuǎn)染劑(transfectionfacilitatingagent)”)也可被包括在組合物中，例如，促進(jìn)劑諸如布比卡因、心臟毒素和蔗糖，以及常規(guī)用于遞送核酸分子的促進(jìn)轉(zhuǎn)染運(yùn)載體諸如脂質(zhì)體制品或脂質(zhì)制品。根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑可進(jìn)一步包含一種或多種另外的治療劑。例如，該制劑可包含一種或多種如本文定義的DDAHI激動(dòng)劑。該制劑可包含一種或多種如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑還有一種或多種另外的治療劑。優(yōu)選地，一種或多種另外的治療劑是協(xié)助治療或預(yù)防待治療的個(gè)體的藥劑。例如，一種或多種有效治療門靜脈高壓的藥劑可作為本文所述的制劑的一部分而施用。一種或多種有效治療患者潛在肝臟病況或其癥狀的藥劑可作為本文所述的制劑的一部分而施用。MiX本發(fā)明提供用于降低例如患有門靜脈高壓的受治療者的門靜脈血壓的方法。因此，本發(fā)明提供降低門靜脈血壓的方法，包括向需要其的受治療者施用DDAHI激動(dòng)劑。同樣地，可提供用在降低門靜脈血壓的方法中的DDAHI激動(dòng)劑。還提供DDAHI激動(dòng)劑在制備用于降低門靜脈血壓的藥物中的用途。在任何這些方法和用途中，DDAHI激動(dòng)劑可以是并非TNFα拮抗劑的藥劑，即，該藥劑在被治療的受治療者中不減少TNFα水平和/或不減少TNFα活性。DDAHI激動(dòng)劑對(duì)被治療的受治療者的TNFα水平和/或TNFα活性可不具有顯著影響。該激動(dòng)劑可以是如本文所述的任何激動(dòng)劑，包括由本發(fā)明篩選方法鑒定的任何激動(dòng)劑。激動(dòng)劑可以在如本文所述的制劑中提供。如此，向受治療者施用如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑以降低受治療者的門靜脈壓。如此，可施用如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑以改進(jìn)受治療者的病況，例如患有門靜脈高壓的受治療者?？墒┯萌绫疚乃龅腄DAHI激動(dòng)劑以減輕受治療者的癥狀，例如與門靜脈高壓相關(guān)的癥狀。可施用如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑以抗擊或延遲門靜脈高壓或與其相關(guān)的任何癥狀諸如靜脈曲張的發(fā)作。因此，本發(fā)明可阻止門靜脈高壓的醫(yī)學(xué)結(jié)果。使用如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑可因此延長(zhǎng)肝病患者的生命。如本文所述，DDAH1激動(dòng)劑可導(dǎo)致受治療者肝臟中DDAHI的表達(dá)增加和/或水平增加。例如，該激動(dòng)劑可以是促進(jìn)DDAHI在受治療者細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的藥劑或該藥劑可以是能夠在受治療者肝臟中表達(dá)DDAHI的載體。例如，可通過基因治療方法增加DDAHI表達(dá)，如本文所述的包含DDAHI基因的多核苷酸或載體藉以向個(gè)體施用。經(jīng)由靶向施用諸如直接施用于肝臟，或諸如利用肝臟特異性啟動(dòng)子的靶向表達(dá)，多核苷酸或載體可靶向于肝臟。能夠表達(dá)DDAHI的此類多核苷酸或載體的施用可用于將個(gè)體中DDAHI的病理生理學(xué)低水平重構(gòu)。這可通過向個(gè)體單次或多次施用這樣的多核苷酸或載體來實(shí)現(xiàn)。如本文所述，DDAHI激動(dòng)劑可導(dǎo)致個(gè)體肝臟中DDAHI活性增加。例如，激動(dòng)劑可導(dǎo)致個(gè)體肝臟中非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平降低和/或一氧化氮合酶(N0Q水平增加。受治療者用如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑治療。如上所述，DDAHI激動(dòng)劑可單獨(dú)施用或以藥物制劑形式施用。制劑可包含一種或多種DDAHI激動(dòng)劑并可包含一種或多種另外的治療劑或預(yù)防劑。兩種或多種不同的如本文所述的DDAHI激動(dòng)劑可聯(lián)合使用以治療受治療者。兩種或多種激動(dòng)劑可一起、以單個(gè)制劑、同時(shí)、以兩種或多種分別的制劑、或分別或順序地作為聯(lián)合施用方案的一部分而施用。本發(fā)明的激動(dòng)劑或制劑可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩绞┯?。?yōu)選地其通過口服、靜脈內(nèi)、胃內(nèi)、腹膜內(nèi)或血管內(nèi)途徑施用。激動(dòng)劑或制劑可直接施用于受治療者的肝臟。激動(dòng)劑以治療有效量施用。本發(fā)明激動(dòng)劑的適當(dāng)劑量可根據(jù)多種參數(shù)確定，諸如待治療的受治療者的年齡、體重和狀態(tài)；肝病的類型和嚴(yán)重度；施用途徑；和所需方案?？蔀閱为?dú)的激動(dòng)劑確定適當(dāng)?shù)膭┝?。例如，?duì)一些激動(dòng)劑，典型劑量可以在從lmg/kg/天至30g/kg/天的數(shù)量級(jí)。醫(yī)師能夠?qū)?dòng)劑和為任何具體受治療者確定所需劑量。本發(fā)明廣泛適用于治療方法并與預(yù)防性治療和/或治療性治療的開發(fā)相關(guān)。應(yīng)理解的是，本文提及的所有治療包括根治性治療、姑息性治療和預(yù)防性治療。預(yù)防或治療包括但不限于引起DDAHI量、功能或活性的有效增加，以導(dǎo)致門靜脈壓降低，或阻止或減少門靜脈壓增加。例如，預(yù)防或治療可導(dǎo)致患有門靜脈壓增加的受治療者諸如患有門靜脈高壓的受治療者的門靜脈壓降低。預(yù)防或治療可導(dǎo)致門靜脈壓增加或預(yù)期門靜脈壓將增加的患者保持門靜脈壓的特定水平。預(yù)防或治療可導(dǎo)致個(gè)體門靜脈壓的增加與在不存在這種治療時(shí)將會(huì)觀察到或?qū)?huì)預(yù)期的增加相比被減少或減慢。預(yù)防或治療對(duì)于本文所述的門靜脈高壓的任何癥狀或結(jié)果可具有類似作用。即，根據(jù)本發(fā)明的治療可導(dǎo)致此類癥狀或結(jié)果的嚴(yán)重度的減少，維持此類癥狀或結(jié)果的現(xiàn)有水平，或減慢或減少此類癥狀或結(jié)果的惡化。待治療的患者本發(fā)明涉及降低有相應(yīng)需要的個(gè)體的門靜脈壓。因此，根據(jù)本發(fā)明待治療的受治療者可患有門靜脈高壓或可處于門靜脈高壓的增加風(fēng)險(xiǎn)中。例如，受治療者可患有肝硬化。門靜脈高壓可定義為門靜脈和其支流中血壓增加。門靜脈是將血液從腸帶到肝臟的大靜脈。當(dāng)門靜脈壓梯度(插入肝靜脈或門靜脈的導(dǎo)管的測(cè)量值與肝靜脈或下腔靜脈中的無阻血壓讀數(shù)(freepressurereading)之間的壓力差)為彡IOmmHg或更大時(shí)，門靜脈高壓可定義為臨床顯著。用于診斷門靜脈高壓的方法是本領(lǐng)域公知的，尤其是本領(lǐng)域中的臨床醫(yī)師和獸醫(yī)公知的。優(yōu)選地，受治療者已被例如醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)專業(yè)人員診斷為患有門靜脈高壓。受治療者可展示與門靜脈高壓相關(guān)的一種或多種癥狀。例如，門靜脈高壓可導(dǎo)致腹水積累。這可導(dǎo)致患者的腹部腫脹?；颊哌€可具有增大的脾臟。超聲掃描可用于檢查門靜脈和附近血管中的血流并檢測(cè)腹部的液體。側(cè)副管可以是腹壁上方或直腸周圍的皮膚上可見的。食管和胃靜脈曲張容易出血，且有時(shí)是大規(guī)模出血。超聲或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)掃描可用于尋找和檢查側(cè)副管。由于大多數(shù)患有門靜脈高壓的人群還患有嚴(yán)重的肝臟功能障礙，所以他們可能具有肝衰竭的癥狀，諸如出血的傾向。門靜脈壓可被直接測(cè)量。例如，可將導(dǎo)管通過切口插入頸部并穿過血管到肝臟或脾臟中以直接測(cè)量門靜脈血管中的壓力。待治療的個(gè)體可例如通過這些方法中的任何一種被診斷為患有門靜脈高壓。待治療的個(gè)體可被診斷為處于門靜脈高壓風(fēng)險(xiǎn)中。例如，個(gè)體可被診斷為具有與門靜脈高壓相關(guān)的一種或多種癥狀。例如，門靜脈高壓通常見于肝硬化患者。待治療的個(gè)體可患有肝硬化。門靜脈高壓還可以是晚期肝病導(dǎo)致的，所述晚期肝病包括酒精性肝炎、特發(fā)性非硬變性門靜脈高壓、先天性肝臟纖維變性、部分結(jié)節(jié)樣轉(zhuǎn)化(partialnodulartransformation),巴-希二氏綜合征(Budd-Chiarisyndrome)、門靜脈血栓形成、右心衰竭或血吸蟲病感染。待治療的個(gè)體可患有這些病況中的任何一種或多種。待治療的受治療者可以是易于增加門靜脈壓諸如門靜脈高壓的任何個(gè)體。受治療者可以是男性或女性。女性對(duì)酒精的不良作用可能比男性更敏感。相對(duì)男性而言，女性可在更短的時(shí)間段內(nèi)，由更少量的酒精產(chǎn)生酒精性慢性肝病。待治療的受治療者可以是人類。待治療的受治療者可以是非人類動(dòng)物。待治療的受治療者可以是家畜例如母?；蚬?、綿羊、豬、牛、山羊或馬，或者可以是馴養(yǎng)動(dòng)物例如狗或貓。受治療者可以是或可以不是肝病動(dòng)物模型。動(dòng)物可以是任何年齡的，但通常應(yīng)是成熟的成年受治療者。實(shí)施例材料和方法BDL大鼠這些實(shí)驗(yàn)利用建立的肝硬化動(dòng)物模型，即膽管結(jié)扎的(BDL)大鼠。BDL大鼠可通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠O00_250g)可用于這一程序。在麻醉后，可進(jìn)行中線剖腹術(shù)，暴露膽管，以4.0縫合絲線三重結(jié)扎，并在第二和第三結(jié)扎線之間切斷。然后以可吸收的縫線按層封閉傷口，允許動(dòng)物在安靜房間中恢復(fù)，隨后返回動(dòng)物保管設(shè)施。DDAH-活件檢驗(yàn)以下實(shí)驗(yàn)條件用于確定DDAH活性。在存在蛋白酶抑制劑下將肝臟組織樣品(每300μL裂解緩沖液IOOmg冷凍組織)在Tris-HCl緩沖液中均化。將勻漿在預(yù)冷)離心機(jī)中以10，OOOrpm離心90分鐘。對(duì)于DDAH活性檢驗(yàn)，將50μL等份的所得上清液加入含1μL14CL-NMMA(0.02mCi)禾口2μLIOOmM未標(biāo)記L-NMMA的50μL等份的PBS緩沖液中并在37°C孵育60分鐘。孵育后，準(zhǔn)備樣品以確定[14C]瓜氨酸含量與Iml50%(w/v)Dowex(pH7.0)渦旋混合，以10，OOOrpm離心5分鐘；然后將500μL上清液與5ml液體閃爍液混合并在液體閃爍分析儀O^ackardBiosciences,Berks,UK.)上評(píng)價(jià)閃爍計(jì)數(shù)。一單位酶活性定義為在37°C每分鐘催化從ADMA形成1μML-瓜氨酸的量。分子分析蛋白印跡法將包含等量蛋白的提取物變性并在4-12%NuPAGEBis-Tris凝膠上分離并印跡到PVDF膜(Invitrogen，UK)上。然后將膜利用不同的山羊抗DDAH1&2(分別是11000)和小鼠抗eNOS和iN0S(分別是1500&110，000；TransductionLaboratories/Pharmingen，SanJose，CA)、兔抗TNF-α(11000；abeam)>兔抗ADMA(11000；immundiagnostik)和小鼠抗CTH(11000；abnova)抗體孵育，并隨后與各自的HRP-共軛的二抗孵育。利用強(qiáng)化的ECL檢測(cè)試劑盒顯現(xiàn)條帶，并通過光密度測(cè)定法定量。上樣準(zhǔn)確度經(jīng)由以針對(duì)小鼠和兔抗-α微管蛋白的抗體(分別是11000;upStateandCellSignalingTechnology)再次雜交膜來評(píng)價(jià)。ΑΡΜΑ.SDMA和精氨酸測(cè)量利用片段化特異性穩(wěn)定同位素稀釋電噴射串聯(lián)質(zhì)譜(fragmentationspecificstableisotopedilutionelectrospraytandemmassspectrometry)測(cè)量ADMA、SDMA禾口精氨酸。簡(jiǎn)言之，對(duì)含氘化ADMA、SDMA和精氨酸的去蛋白化(de-proteinized)的樣品在替考拉寧保護(hù)柱10mmX2.ImmID(ChirobioticTjASTECLtd，Congleton，UK)上進(jìn)行層析(乙腈水11，帶有0.025%甲酸)，利用SCIEXAPI4000(AppliedBiosystems，Warrington,UK)以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析。^MM1英夫禾1|昔單抗治療曾力DDDAHl7k平并降彳氏門靜脈壓這些實(shí)驗(yàn)中使用三組大鼠以運(yùn)載體治療的BDL大鼠、以抗TNF單克隆抗體英夫利昔單抗治療的BDL大鼠、和模擬處理的大鼠。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)膽管結(jié)扎明顯減少eNOS活性，但以英夫利昔單抗治療BDL大鼠將eNOS活性恢復(fù)到與在模擬動(dòng)物觀察到的相似的水平。如圖2所示，膽管結(jié)扎也導(dǎo)致與模擬動(dòng)物相比肝臟組織ADMA濃度顯著升高。然而以英夫利昔單抗治療顯著減少ADMA水平。如圖3所示，膽管結(jié)扎明顯減少肝臟中DDAH-I同種型的表達(dá)。以英夫利昔單抗治療后，DDAH-I表達(dá)水平恢復(fù)到模擬動(dòng)物水平。如圖4所示，BDL肝硬化大鼠中的門靜脈壓比正常模擬動(dòng)物門靜脈壓明顯增加(14士0.7VS.5.5士0.3mmHg)。以英夫利昔單抗介入后，門靜脈壓減少多于30%(9.5士0.6mmHg)。因此，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)以英夫利昔單抗治療BDL大鼠導(dǎo)致-肝臟組織DDAH1表達(dá)顯著增加。-肝臟ADMA產(chǎn)生減少。-肝臟NO產(chǎn)生增加(N0S活化)。-與用等體積鹽水注射治療的BDL大鼠相比門靜脈壓減少大于33%。t施例2類法原醇等體激動(dòng)劑INT-747增加DDAHl水平并降低,丨、1靜脈ff.類法尼醇受體(FXR)是膽汁酸響應(yīng)性核受體，此前顯示其對(duì)大鼠中的膽管結(jié)扎(BDL)損傷具有肝保護(hù)作用。F)(R激動(dòng)劑具有包括DDAHl的多種靶基因。這一研究測(cè)試以下假設(shè)F)(R激動(dòng)劑(INT-747)將恢復(fù)DDAH-I水平從而恢復(fù)eNOS活性，降低門靜脈壓。在對(duì)Sprague-Dawley大鼠(η=14)BDL或模擬手術(shù)后四周，對(duì)BDL大鼠強(qiáng)飼運(yùn)載體(玉米油)中的5mg/kgFXR激動(dòng)劑INT-747(6-乙基鵝去氧膽酸，InterceptPharmaceuticalsInc.)5ο在治療5天后對(duì)大鼠進(jìn)行直接門靜脈壓評(píng)價(jià)然后處死，收集血漿和肝臟組織用于分析。通過標(biāo)記的放射性精氨酸向瓜氨酸的轉(zhuǎn)化以放射性測(cè)量方法來確定eNOS活性。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白印跡法技術(shù)測(cè)量eN0S、iN0S、DDAH_l和DDAH-2的蛋白表達(dá)。評(píng)估肝臟活組織切片的以H+E、VanGiesen和網(wǎng)硬蛋白染色的組織病理學(xué)。如圖5和圖6所示，以INT-747治療后，BDL大鼠中的eNOS活性恢復(fù)到模擬動(dòng)物水平(*-p<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)也類似地正?；?*_p<0.05)。如圖7和*所示，INT-747施用于BDL大鼠導(dǎo)致與僅BDL相比，DDAH-I表達(dá)顯著增力口(**-p<0.01)和ADMA顯著減少(*_p<0.05)。如圖9所示，BDL大鼠的INT-747治療導(dǎo)致與BDL+運(yùn)載體相比門靜脈壓降低30%(**-p<0.01)。以INT-747介入后這種門靜脈壓的降低發(fā)生在不存在組織纖維化或炎癥上的任何顯著改變的情況下。與BDL+運(yùn)載體動(dòng)物相比，以INT-747治療的動(dòng)物中的血漿TNFα水平未顯著改變。實(shí)施例3已經(jīng)證明，注射帶有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子的裸質(zhì)粒DNA導(dǎo)致目標(biāo)基因在嚙齒動(dòng)物中的有效肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)(Maruyama等.JGeneMed2002，4:333-41)。這一方法稱為‘水流動(dòng)力學(xué)基因治療’，用于確定在BDL大鼠中轉(zhuǎn)導(dǎo)DDAH-I對(duì)門靜脈壓的作用。將含人類DDAH-lcDNA的質(zhì)粒經(jīng)頸靜脈的分支注射到如上產(chǎn)生的BDL嚙齒動(dòng)物或模擬嚙齒動(dòng)物中。含GFP的對(duì)照質(zhì)粒用作在BDL動(dòng)物中介入的對(duì)照。在介入后48小時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行直接門靜脈壓測(cè)量，并且收集血漿和組織用于分析肝臟DDAH-ImRNA(rtPCR)和蛋白表達(dá)(蛋白印跡法)、以及常規(guī)組織學(xué)和生物化學(xué)。被治療的所有動(dòng)物均良好耐受水流動(dòng)力學(xué)注射，被提供隨意獲得食物和水的機(jī)會(huì)。48小時(shí)后，在處死時(shí)，進(jìn)行門靜脈壓評(píng)價(jià)。模擬大鼠具有的平均門靜脈壓顯著低于注射GFP質(zhì)粒的BDL大鼠(6.5士0.7mmHgvs.17.8士1.8mmHg)。然而，以并入DDAH-I的質(zhì)粒治療的組與GFP治療組相比具有38%門靜脈壓下降(11士0.9mmHg)。參見圖10。這一數(shù)據(jù)證實(shí)了以下推斷通過重構(gòu)DDAH-lcDNA的遺傳治療可作為治療門靜脈高壓的療法起作用。實(shí)施例4腺相關(guān)病毒(AAV)載體是最常用的基因治療病毒載體之一。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)注射到小鼠時(shí)，帶有AAV8衣殼的AAV2基因組(AAV2/8)的高效肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)(Osman等；Atherosclerosis2009，204121-6)。目標(biāo)基因的表達(dá)由包含人類apoE/CI肝臟控制區(qū)(HCR)和α-l-抗胰蛋白酶(hAAT)基因啟動(dòng)子的區(qū)段的截短的肝臟-特異性啟動(dòng)子LPl驅(qū)動(dòng)，提供強(qiáng)的肝臟局限性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生。我們已經(jīng)克隆了在AAV2/8質(zhì)粒中含在肝臟特異性LPl啟動(dòng)子控制下的人類DDAHlcDNA的DNA構(gòu)建體。產(chǎn)生AAV載體隨后的步驟是(a)轉(zhuǎn)染DDAH-AAV2/8質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒到感受態(tài)細(xì)胞中，(b)以AVBkpharose柱純化DDAH-AAV2/8，和(c)以rtPCR定量DDAH-AAV2/8。將DDAH-AAV2/8載體由尾靜脈注射而注射到BDL大鼠或模擬大鼠中。無目標(biāo)基因的陰性對(duì)照AAV2/8也被注射到BDL大鼠中。門靜脈壓可通過直接插管來評(píng)價(jià)。DDAH-I的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過測(cè)量mRNA(rtPCR)和蛋白(蛋白印跡法)來評(píng)價(jià)。實(shí)施例5已經(jīng)顯示腺病毒載體示范了在肝病的嚙齒動(dòng)物模型中高效轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞和其他細(xì)胞類型(Yu等，AmJPhys2002，282:G565_G572;Garcia_Banuelos等，GeneTherapy2002,9:127-134)。構(gòu)建了表達(dá)DDAH-I的腺病毒。構(gòu)建后，DDAH-腺病毒構(gòu)建體可用于確定向肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(包括竇內(nèi)皮細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)DDAH-I對(duì)BDL大鼠中eNOS活性和門靜脈壓的作用。將DDAH-腺病毒載體由尾靜脈注射而注射到BDL模擬大鼠中。無目標(biāo)基因的陰性對(duì)照AAV2/8也被注射到BDL大鼠中。門靜脈壓可通過在5天時(shí)對(duì)門靜脈直接插管來評(píng)價(jià)。DDAH-I的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過測(cè)量mRNA(rtPCR)和蛋白(蛋白印跡法)來評(píng)價(jià)。權(quán)利要求1.一種降低門靜脈血壓的方法，包括向需要其的受治療者施用DDAHI的激動(dòng)劑，其中所述激動(dòng)劑不減少受治療者的血漿TNFα水平。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述激動(dòng)劑導(dǎo)致(a)受治療者肝臟中DDAHI的表達(dá)增加；和/或(b)受治療者肝臟中DDAHI的水平增加。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述激動(dòng)劑促進(jìn)受治療者細(xì)胞中DDAHI的轉(zhuǎn)錄。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述激動(dòng)劑是能夠在受治療者肝臟中表達(dá)DDAHI的載體。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述激動(dòng)劑增加個(gè)體肝臟中DDAHI的活性。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述激動(dòng)劑導(dǎo)致個(gè)體肝臟中(a)非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)的水平減少；和/或(b)一氧化氮合酶(N0Q的水平增加。7.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者患有門靜脈高壓。8.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者患有肝硬化。9.一種鑒定適用于治療門靜脈高壓的藥劑的方法，所述方法包括確定受試藥劑是否能夠增加或保持DDAHI的量或活性，其中增加DDAHI的量或活性的能力指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。10.如權(quán)利要求9所述的方法，包括以下步驟將包含DDAHI的細(xì)胞或組織與受試藥劑接觸并確定所述受試藥劑的存在是否導(dǎo)致所述細(xì)胞或組織中DDAHI的量或活性的增加。11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中在肝臟或來源于肝臟的組織或細(xì)胞中評(píng)價(jià)DDAHI的量或活性。12.如權(quán)利要求9或10所述的方法，包括以下步驟向膽管結(jié)扎的大鼠施用受試藥劑并確定所述受試藥劑的存在是否導(dǎo)致所述大鼠肝臟中DDAHI的量或活性的增加。13.如權(quán)利要求9至12任一項(xiàng)所述的方法，還包括確定所述受試藥劑是否能夠抑制TNFα，其中增加DDAHI的量或活性的能力聯(lián)合不存在對(duì)TNFα的抑制作用指示該化合物可適用于治療門靜脈高壓。全文摘要本發(fā)明來源于以下發(fā)現(xiàn)DDAHI水平降低與門靜脈壓升高關(guān)聯(lián)，且通過增加體內(nèi)DDAHI水平可降低門靜脈壓。因此，本發(fā)明提供降低門靜脈血壓的方法，包括向需要其的受治療者施用DDAHI的激動(dòng)劑。文檔編號(hào)A61K31/575GK102573850SQ201080040286公開日2012年7月11日申請(qǐng)日期2010年9月9日優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日發(fā)明者拉吉夫·加蘭,拉杰什瓦爾·P·慕克吉,高塔姆·梅塔申請(qǐng)人:Ucl商業(yè)有限公司