專(zhuān)利名稱(chēng)：速度因子的制作方法
速度因子速度因子是在37°C和13°C下測(cè)定的抗原-抗體復(fù)合物締合速率常數(shù)的比率，憑借速度因子有可能將抗體歸類(lèi)為例如熵或焓的結(jié)合物，而無(wú)需詳細(xì)的熱力學(xué)測(cè)定和計(jì)算。
背景技術(shù)：
生產(chǎn)具有卓越的抗原特異性和非凡的抗原復(fù)合物穩(wěn)定性的高親和力抗體是診斷和治療抗體開(kāi)發(fā)中的主要目標(biāo)。就蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)分析而言，占主導(dǎo)地位的技術(shù)是量熱測(cè)定(Chaires, J. B. , Ann. Rev. Biophys. 37(2008) 135-51 ；Perozzo, R.,等人’ J. Recept. Signal Transduct. Res. 24(1-2) (2004) 1-52 ；Li, L.，等人，Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008)529-32 ；Liang, Y.，Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)40(7)(2008)565-76 ； Thielges，M. C.，等人，Biochemistry 47(27) (2008)7237-47)。用于反應(yīng)量熱計(jì)測(cè)定所需的樣品量很高，例如至少125μ g/ml的抗體濃度和至少150 μ 1的樣品體積。而且，反應(yīng)量熱法需要高樣品純度，且不容許任何樣品雜質(zhì)或樣品異質(zhì)性。另外，樣品緩沖液直接影響測(cè)定的熱力學(xué)參數(shù)的結(jié)果。此外，反應(yīng)量熱法僅能解決平衡熱力學(xué)。表面等離子共振(SPR)儀器(Roos，H.，等人，J.Mol. Recognit. 11(1-6) (1998)204-210 ；Van Regenmortel, Μ. H.，等人，J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 163-167 ； Gunnarsson, K. , Curr. Prot. Immunol. Chapter 18 (2001)Unit 18. 6 ；Drake, Α. W., 等人，Anal. Biochem. 328 (1) (2004) 35-43 ；Kikuchi, Y.,等人，J. Biosci. Bioeng. 100 (3) (2005)311-7)允許以高通量的方式快速測(cè)定溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)譜(見(jiàn)例如 Canziani, G. Α.,等人，Anal. Biochem. 325(2004)301-307 ；Saefsten, P.,等)κ, Anal. Biochem. 353 (2006) 181-190 ；Leonard, P.，等人，J. Immunol. Methods 323 (2007) 172-9)。Wassaf，D.，等人(Anal. Biochem. 351 (2006)241-253)報(bào)導(dǎo)了使用表面等離子共振微陣列的抗體的高通量親和力排序。在Roos，H.，等人，J.Mol.Recognit. 11(1998)204-210 中報(bào)導(dǎo)了使用生物傳感器技術(shù)的蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)分析。Wark, K. L.，等人(Adv. Drug. Deliv. Rev. 58 (2006) 657-670)報(bào)導(dǎo)了用于增強(qiáng)抗體親和力的技術(shù)。Papalia, G. A.，等人在 Anal. Biochem. ；359 (2006) 112-119 中報(bào)導(dǎo)了使用BIAcore T100的抗體片段/抗原相互作用的高分辨率表征。Sagawa，Τ.，等人(Mol. Immunol. 39(2003)801-808)報(bào)導(dǎo)了在針對(duì)半抗原的免疫應(yīng)答期間抗體進(jìn)化的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)方面。Jason-Moller, L.，等人在 Curr. Prot. Prot. ki. (2006) page unitl9. 13 中報(bào)導(dǎo)了 BIAcore系統(tǒng)和應(yīng)用的綜述。Gelb，W.報(bào)導(dǎo)了用于肽研究的微量熱法(Proc. 4th Int. Peptide Sympos. (2007)第 1 頁(yè))。發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)，為了抗體的表征，不需要完整的動(dòng)力學(xué)表征，而需要測(cè)定在37°C下的締合速率常數(shù)和在13°C下的締合速率常數(shù)。可使用其比率將抗體根據(jù)其結(jié)合性能分類(lèi)。如本文報(bào)導(dǎo)的第一方面是用于選擇抗體的方法，其包括選擇速度因子為10或更小的抗體的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于選擇抗體的方法包括以下步驟
a)提供一組或一群或一批抗體，b)測(cè)定溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，c)計(jì)算所有提供的抗體的速度因子，d)選擇速度因子為10或更小的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，速度因子是從0至10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，速度因子是在 37°C下的締合速率常數(shù)和在13°C下的締合速率常數(shù)的比率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在13°C 和37°C下測(cè)定溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用表面等離子共振測(cè)定溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。在另外的實(shí)施方案中，所述方法是高通量的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)速度因子和八S° $ass值選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，在表面等離子共振中，在表面等離子共振芯片上固定抗原。在另外的實(shí)施方案中，溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)是熱力學(xué)平衡數(shù)據(jù)和過(guò)渡態(tài)熱力學(xué)數(shù)據(jù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用van，t Hoff和Eyring和Arrhenius 方程的線(xiàn)性形式計(jì)算溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇小于200J/mol*K 的AS° $ass(AS° % ass < 200J/mol*K)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用范圍從-200J/ 11101^(至2001/11101^(的Δ S。$ ass選擇抗體。還在一個(gè)實(shí)施方案中用范圍從_150J/mol*K 至+100J/mol*K的Δ S。
ass選擇抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表面等離子共振使用補(bǔ)充 lmg/ml羧甲基葡聚糖的HBS-EP緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)單個(gè)雜交瘤或B細(xì)胞產(chǎn)生每種抗體。如本文報(bào)導(dǎo)的第二方面是得到具有對(duì)至少2種抗原的交叉反應(yīng)性的抗體的方法， 所述方法包括用50或更大的速度因子選擇抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，速度因子是從50至 300。如本文報(bào)導(dǎo)的另外的方面是生產(chǎn)抗體的方法，其包括以下步驟a)提供一組/群/批生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，b)選擇生產(chǎn)具有10或更小的速度因子的抗體的細(xì)胞，c)培養(yǎng)選定的細(xì)胞，d)從培養(yǎng)的選定細(xì)胞或其培養(yǎng)基中回收抗體并由此生產(chǎn)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，以單個(gè)細(xì)胞儲(chǔ)存生產(chǎn)抗體的細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，在選擇前培養(yǎng)儲(chǔ)存的單個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在選擇前純化抗體。在另外的實(shí)施方案中，在回收后純化抗體。在特定的實(shí)施方案中，通過(guò)蛋白質(zhì)A層析純化。如本文報(bào)導(dǎo)的另一個(gè)方面是用于選擇親本抗體的人源化形式的方法，其包括a)提供親本抗體，b)提供一組/群/批親本抗體的人源化形式，c)測(cè)定所有提供的抗體的溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，d)計(jì)算所有提供的抗體的速度因子，e)比較人源化形式的速度因子和親本抗體的速度因子，f)通過(guò)用小于親本抗體的速度因子的2倍的速度因子選擇抗體，選擇親本抗體的人源化形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，用小于親本抗體的速度因子的125%的速度因子選擇人源化形式，在另一個(gè)實(shí)施方案中，用小于親本抗體的速度因子的110%的速度因子選擇人源化形式。
如本文報(bào)導(dǎo)的另一個(gè)方面是用如本文報(bào)導(dǎo)的方法選擇的抗體作為治療或診斷劑的用途。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含用如本文報(bào)導(dǎo)的方法得到的抗體的藥物組合物。發(fā)明詳述本文報(bào)導(dǎo)的方法是基于速度因子的測(cè)定?；谒俣纫蜃涌蓪⒖贵w分類(lèi)，即可根據(jù)其結(jié)合性能將抗體表征為例如熵或焓的抗原結(jié)合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于速度因子的分類(lèi)不需要測(cè)定和/或計(jì)算詳細(xì)的熱力學(xué)，因此減少了待測(cè)定的參數(shù)量和待進(jìn)行的計(jì)算量。速度因子是在37°C和在13°C下獨(dú)立測(cè)定的抗原-抗體復(fù)合物的締合速率常數(shù)(ka)的比率。因?yàn)閮H需要2次實(shí)驗(yàn)測(cè)定計(jì)算速度因子，這是一個(gè)快速和適合高通量的方法?？墒褂盟俣纫蜃永绫容^人源化抗體和其來(lái)源的親本抗體。其也可用于評(píng)估直接來(lái)自雜交瘤和/或B細(xì)胞上清的抗體。其不需要初步純化，因?yàn)榭墒褂么稚锨逯苯舆M(jìn)行測(cè)定?；诒砻娴入x子共振的動(dòng)力學(xué)方法比傳統(tǒng)的量熱測(cè)定具有若干優(yōu)勢(shì)——高通量處理是可能的，——低樣品消耗，——測(cè)量親和力(affinity)而不是親合力(avidity)，和——使用粗細(xì)胞上清或復(fù)雜的培養(yǎng)混合物。表面等離子生物傳感器表面是親和基質(zhì)，其用于例如從粗細(xì)胞培養(yǎng)上清中捕獲抗體。因此，可使用粗制和復(fù)雜混合物作為樣品。由于相互作用配偶之一被固定在傳感器的表面上，而第二種化合物被注入流動(dòng)系統(tǒng)，可以測(cè)量平衡和過(guò)渡態(tài)熱力學(xué)，因?yàn)镕IA(流動(dòng)注射分析)系統(tǒng)允許并可單獨(dú)監(jiān)控復(fù)合物的締合和解離相。使用此技術(shù)，計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)——標(biāo)準(zhǔn)自由結(jié)合焓Δ G °，——標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓Δ H。，——標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵Δ S。，和過(guò)渡態(tài)參數(shù)——標(biāo)準(zhǔn)自由締合焓Δ G° $ ass,——標(biāo)準(zhǔn)締合焓ΔΗ° $ass，——標(biāo)準(zhǔn)締合熵$ass，-活化能 Eaass，——標(biāo)準(zhǔn)自由解離能Δ G° $ diss，——標(biāo)準(zhǔn)解離焓Δ H。$ diss,——標(biāo)準(zhǔn)解離熵Δ S。$ diss，和——解離能fediss是可能的。在使用非線(xiàn)性van，t Hoff方程的情況下，也可測(cè)定Δ Cp值。一般在基于SPR的動(dòng)力學(xué)抗體篩選(見(jiàn)例如Steukers，Μ.，等人，J. Immunol. Methods 310 (2006) 126-135 ；Rich, R. L.，等人，Anal. Biochem. 361 (2007) 1-6)后進(jìn)行第二個(gè)步驟，即更高分辨率的熱力學(xué)sra分析。培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，并使產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)上清在一個(gè)實(shí)施方案中經(jīng)歷高通量分析，其中產(chǎn)生溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，以計(jì)算速度因子和過(guò)渡態(tài)(化)熱力學(xué)性能?；谄錈崃W(xué)行為進(jìn)行根據(jù)如本文報(bào)導(dǎo)的方法的抗體的選擇。通過(guò)抗原復(fù)合物締合速率常數(shù)ka[l/Ms]的溫度依賴(lài)的增加和抗原復(fù)合物解離速率常數(shù)kd[l/s]的保持或減少表征高親和力抗體。令人驚訝地，通過(guò)抗原相互作用機(jī)制表征這樣的抗體，其顯示了在結(jié)合平衡中的大的熵變。因此，必須通過(guò)量熱學(xué)以外的方式進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以測(cè)定熵供量(contribution)來(lái)源于哪種效應(yīng)。在復(fù)合物締合相是有風(fēng)險(xiǎn)的， 因?yàn)榛靵y的抗原結(jié)合，或在復(fù)合物解離相，其恰好指示了包含潛在誘發(fā)的抗原構(gòu)象變化的復(fù)雜的抗原相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，熵供量來(lái)源于抗體-抗原復(fù)合物解離步驟，其中發(fā)生解離熵Δ S。
diss的大的正變化或大的負(fù)變化。高親和力抗體也可具有來(lái)源于抗原解離相的熱力學(xué)異常，其中解離速率常數(shù) kd[l/s]令人驚訝地和出乎意料地隨著溫度增加而減少。通過(guò)如下熱力學(xué)參數(shù)表征這樣的抗體i)顯示負(fù)或接近0的解離活化能fedissDa/mol]的解離相，ii)負(fù)解離焓ΔΗ° | diSS[kJ/mol]，和iii)大的負(fù)解離熵AS° idissDa/mol]。必須指出，這是此效應(yīng)的完全的理論處理，且不應(yīng)被視為限制。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定解離活化能fediss，解離焓 Δ H。$ diss和解離熵八S° $ diss，并選擇具有i)負(fù)或接近0的解離活化能fedissDa/ mol], ii)負(fù)解離焓 ΔΗ° $dissDa/m0l]，和 iii)大的負(fù)解離熵 AS° $ diss[kj/mol]的抗體。因此，如本文報(bào)導(dǎo)的方法允許基于速度因子和Δ S。
ass值從一批高親和力抗體中選擇抗體。可在篩選前如在一個(gè)實(shí)施方案中在100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中使用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)儲(chǔ)存的單細(xì)胞克隆。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)定溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，即熱力學(xué)篩選前，通過(guò)蛋白質(zhì)A Sepharose(TM)柱層析從上清中純化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于熱力學(xué)篩選的系統(tǒng)緩沖液是HBS-EP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)樣品緩沖液補(bǔ)充lmg/ml羧甲基葡聚糖凝膠以降低非特異性傳感器基質(zhì)效應(yīng)。大多數(shù)使用基于sra測(cè)量的出版物不使用抗體捕獲系統(tǒng)作為傳感器表面呈遞技術(shù)。通常抗體或其片段被共價(jià)固定在傳感器上。此技術(shù)不可用于高通量形式，因?yàn)楸砻娌贿m于多目的抗體呈遞，此外其受到固定了配體的傳感器數(shù)量的技術(shù)限制。為了進(jìn)行熱力學(xué)篩選，可建立具有合適的溫度依賴(lài)的第二抗體復(fù)合物穩(wěn)定性的種類(lèi)特異性捕獲系統(tǒng)。生物傳感器需通過(guò)優(yōu)化程序校準(zhǔn)從而以高通量形式測(cè)定具有不同表位特異性的抗體的結(jié)合特征。熱力學(xué)篩選提供溫度依賴(lài)的數(shù)據(jù)集(見(jiàn)圖3)。在較低的溫度下觀察到較低的響應(yīng)，因?yàn)椴东@系統(tǒng)的締合速率降低了(見(jiàn)實(shí)施例幻。在較高的溫度下締合速率加快。此外發(fā)現(xiàn)在低于13°C的溫度下，捕獲系統(tǒng)的締合動(dòng)力學(xué)太慢而得不到足夠的抗體響應(yīng)。在低于13°C和高于37°C下，抗體的抗原結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)定提供了根據(jù)van’ t Hoff, Eyring和Arrhenius方程的不可線(xiàn)性化的數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在13°C或17°C和37°C的溫度下進(jìn)行熱力學(xué)篩選。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 在此溫度范圍內(nèi)有可能根據(jù)van’ t Hoff方程的線(xiàn)性形式簡(jiǎn)單計(jì)算熱力學(xué)平衡數(shù)據(jù)并根據(jù)線(xiàn)性Eyring和線(xiàn)性Arrhenius方程簡(jiǎn)單計(jì)算過(guò)渡態(tài)熱力學(xué)(Wear，Μ. Α.，等人，Anal.Biochem. 359 (2006) 285-287 ；又見(jiàn)圖幻。在一個(gè)實(shí)施方案中，在相同的條件下進(jìn)行所有測(cè)量以使高通量篩選(HTQ容易控制。用于計(jì)算，可使用如下公式a) Arrhenius 方程(I)k = A*e(-WK*T)b) van，t Hoff 計(jì)算(II) AG° = ΔΗ° _T*AS°(III)AG。= _R*T* InK11(IV)InK11 二 _1/Τ*( Δ H° /R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD = ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° p (T-T0)—Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)c) Eyring 締合相
權(quán)利要求
1.得到抗體的方法，其包括以下步驟a)提供一批抗體，b)測(cè)定在37°C下每種抗體與其抗原的締合速率常數(shù)和在13°C下每種抗體與其抗原的締合速率常數(shù)，c)計(jì)算在37°C下的締合速率常數(shù)與在13°C下的締合速率常數(shù)的比率，d)通過(guò)選擇具有10或更小的比率的抗體并由此得到抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于用表面等離子共振進(jìn)行測(cè)定。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過(guò)計(jì)算比率和通過(guò)測(cè)定% ass進(jìn)行選擇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在表面等離子共振中在表面等離子共振芯片上固定抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于以小于200J/mol^(的八S°$ass 選擇抗體。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過(guò)單個(gè)雜交瘤細(xì)胞或B細(xì)胞產(chǎn)生每種抗體。
7.用于得到具有對(duì)至少2種抗原的交叉反應(yīng)性的抗體的方法，其包括以下步驟a)提供一批抗體，b)測(cè)定在37°C下每種抗體與其抗原的締合速率常數(shù)和在13°C下每種抗體與同一抗原的締合速率常數(shù)，c)計(jì)算在37°C下的締合速率常數(shù)與在13°C下的締合速率常數(shù)的比率，d)通過(guò)以50或更大的比率選擇抗體并由此得到具有對(duì)至少2種抗原的交叉反應(yīng)性的抗體。
8.生產(chǎn)抗體的方法，其包括以下步驟a)提供一組生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，b)測(cè)定在37°C和13°C下每種生產(chǎn)抗體的細(xì)胞產(chǎn)生的每種抗體與抗原的締合速率常數(shù)，c)計(jì)算在37°C下的締合速率常數(shù)與在13°C下的締合速率常數(shù)的比率，d)選擇生產(chǎn)具有10或更小的比率的抗體的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，e)培養(yǎng)選定的細(xì)胞，f)從培養(yǎng)的選定細(xì)胞或其培養(yǎng)基中回收抗體并由此生產(chǎn)抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于以單個(gè)細(xì)胞保存在步驟a)中的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括在選擇前培養(yǎng)儲(chǔ)存的單個(gè)細(xì)胞的額外步驟。
11.得到人源化抗體的方法，其包括a)提供親本抗體，b)提供一組親本抗體的人源化形式，c)測(cè)定在37°C和13°C下每種人源化抗體形式與其抗原的締合速率常數(shù)d)計(jì)算在37°C下的締合速率常數(shù)與在13°C下的締合速率常數(shù)的比率，e)比較人源化形式的比率和親本抗體的比率，f)以小于親本抗體比率2倍的比率選擇人源化形式作為人源化抗體，并由此得到人源化抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法得到的抗體作為治療或診斷劑的用途。
13.包含根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法得到的抗體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及速度因子?；谒俣纫蜃涌蓪⒖贵w分類(lèi)，即可按照其結(jié)合性能將抗體表征為例如熵或焓的抗原結(jié)合物?；谒俣纫蜃拥姆诸?lèi)不需要詳細(xì)的熱力學(xué)測(cè)定和/或計(jì)算。速度因子是在37℃和13℃下測(cè)定的抗原-抗體復(fù)合物締合速率常數(shù)ka的比率。因?yàn)閮H需要2種實(shí)驗(yàn)測(cè)定計(jì)算速度因子，這是快速和適于高通量的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102482344SQ201080037440
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
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