腦組織損傷之細胞治療的制作方法

專利名稱：腦組織損傷之細胞治療的制作方法
腦組織損傷之細胞治療相關申請案本申請案主張美國臨時申請案第61/180，243號(申請于2009年5月21日)之優(yōu)先權，其內容在此處全部并入作為參考文獻
背景技術：
腦組織損傷，其因創(chuàng)傷或病癥(如，神經(jīng)退化及腦血管疾病)而產生，是長期癱瘓之主要原因。由于胚胎干(embryonic stem, ES)細胞的多能性，其對于治療腦損傷有著極大的希望。然而，倫理和供給上的考量局限了它們的使用。曾有人提出使用非-ES多能性細胞。然而，此等細胞的神經(jīng)重塑能力有限。因此，有需要一種增進其神經(jīng)重塑能力之方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明至少一部份基于非可預期的發(fā)現(xiàn)，即低氧的前置處理(hypoxia preconditioning,HP)能用于增進非-ES多能性細胞的神經(jīng)重塑與分化能力。因此而增進的細胞能用來治療腦組織損傷。因此，本發(fā)明一方面的特征是一種用于增進具腦組織損傷之患者之神經(jīng)病學的行為功能之方法。該方法包括鑒定出患有腦部組織損傷的患者，以及將包含有效量之多能性細胞之組合物投予該患者。該多能性細胞可以是任何合適的干細胞，例如，ES細胞、造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、或骨髓干細胞。在一具體實施例中，該多能性細胞是⑶34+細胞，如，從臍帶血獲得之⑶34+細胞。其流程可進一步包括在低氧條件下培養(yǎng)該細胞后，評估該細胞中的Epacl濃度。該組合物可從腦內投予。在一具體實施例中，該方法進一步包括非侵入性技術來評估該患者的治療效果之步驟。多能性細胞通過一種包括在低氧條件下培養(yǎng)該細胞之流程而制備。低氧條件 (Hypoxia condition, HP)是指一種條件，其包括細胞中的非致命性緊迫、活化多種內生營養(yǎng)訊號及引發(fā)對抗后續(xù)細胞致死性傷害之強力的保護作用。例如，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞可通過將細胞置放于包含60至600mM去鐵胺(Desferrioxamine，DFX)之培養(yǎng)液中達12至48小時而達成。在另一實例中，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞可通過將細胞置放于包含100至450mM去鐵胺(Desferrioxamine，DFX)之培養(yǎng)液中達16至36小時而達成。在又一實例中，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞可通過將細胞置放于包含200至350去鐵胺 (Desferrioxamine, DFX)之培養(yǎng)液中達20至24小時而達成。另外，可將細胞培養(yǎng)于包含 10至500 μ M COCl2之培養(yǎng)液中達12至48小時。COCl2之濃度范圍可從10至500 μ Μ。在一較佳具體實施例中，COCl2之濃度約為100 μ Μ。在低氧條件下培養(yǎng)該細胞亦可在氧氣濃度低于正常細胞培養(yǎng)條件之氧氣濃度的條件下而進行。例如，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞可通過將細胞置放于包含0. 5至3% O2之環(huán)境(如培養(yǎng)箱)中達6至48小時、0. 8至1. 5% O2達12至36小時、或0. 9至1. 1 % O2達 23至25小時而進行。另一方面，本發(fā)明之特征用于增加患者之組織的血管新生之方法。該方法包括將包含有效量之多能性細胞之組合物投予有需要的患者之組織。該多能性細胞以上述相同方式制備。在一實例中，此方法可用于增加具有腦組織損傷之患者之腦部的血管新生。



圖IA-I與1A-2為顯示西方墨點之結果之照片與圖表；圖2A至2G2為顯示治療與神經(jīng)病學的行為測量方法之說明(2A)，以及顯示治療結果之圖表和照片(2B至2G)；圖3A-1至3G-2為顯示腦中經(jīng)由干細胞植入所造成的血管新生之照片與圖表；圖4A-1至4F為顯示于腦部植入干細胞所造成的Epacl或MMP2表現(xiàn)之照片與圖表；圖5A-1至5C-2為顯示于腦部植入干細胞所造成的神經(jīng)新生。
具體實施例方式ES細胞曾被指出可用于使腦中神經(jīng)元或神經(jīng)膠細胞再生，從而可治療腦組織損傷。然而，倫理與供給上的考量局限了 ES細胞的使用。非ES多能性細胞，如骨髓間質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)與人類贓帶血(human umbilical cord blood,hUCB), 展現(xiàn)出替代的希望。然而，這些替代的選擇并非都能被接受，其由于細胞數(shù)量與增生/分化的能力會隨著年齡明顯降低所致。人類臍帶血，由于其原始特性與取得容易，顯現(xiàn)出能作為多效性干細胞收集之有希望的候選者，并且能提供應用于腦再生之細胞療法的令人感興趣的替代候選者。特別是， 經(jīng)由CD34篩選的族群，其為一種表現(xiàn)在來自造血、內皮與神經(jīng)譜系的前驅細胞上的表面分子，是富含于hUCB且含有高量的早期前驅細胞。然而，很少人研究調控內生性神經(jīng)干細胞 (neural stem cells,NSCs) Hg的iti！〒(hematopoietic stem cells，HSCs)。 夕卜，因為宿主腦部之微環(huán)境對移植的干細胞來說是有毒的，因此許多細胞在移植后馬上死亡(Wei et al.，2005，Neurobiol Dis 19 :183_193)。盡管已研究數(shù)種策略以增強移植細胞之植入及增加移植療法之治療潛力(Wei et al. ,2005, Neurobiol Dis 19 183-193 ；Chen et al. ,2002, J Neurol Sci 199 17-24 ；and Park et al. ,2003, Neurosci Lett 353 91-94)，但仍有許多與各自方式有關的限制，其幾乎使得它們在目前無法在臨床上實施。如本文所述，非預期性的是低氧的前置處理(Hypoxic preconditioning, HP)可用于增進非-ES多能性細胞的神經(jīng)重塑與分化能力。低氧的前置處理(HP)是一種經(jīng)由短期低氧所誘發(fā)的非致死緊迫，其活化多種內生營養(yǎng)訊號及引發(fā)對抗后續(xù)細胞致死性傷害之強力的保護作用(Kirino et al. ,2002, J Cereb Blood Flow Metab 22:1283-1296 and Gidday，2006，Nat Rev Neurosci 7:437-448)。如本文所述，其代表一種用以鑒定對抗缺血損傷的新治療標的之工具。某些人已研究使用HP-MSCs之治療能力，但均未成功(Danet et al. ,2003, J Clin Invest 112:126—135)。如本文所述，發(fā)現(xiàn)HP能經(jīng)由HIF-I α的活化來向上提升cAMP活化的交換蛋 S -1 (Exchange protein activated by cAMP-1, Epacl)的表現(xiàn)，并接著增力口 Rapl—GTP 活性。也發(fā)現(xiàn)HP-hUCB衍生的HSCs之腦內移植在腦部缺血模型中通過活化Epacl-Rapl訊息傳遞之分子機制而增強神經(jīng)軸向外生長及MMP分泌，以增強神經(jīng)重塑性。
Epacl是一種小GTP酶Rapl與Rap2之鳥糞嘌呤核苷酸交換因子(Bos，2006， Trends Biochem Sci 31:680-686)。Epacl的活化能增強Rapl活性，以促進β 1_黏合素調節(jié)的附著并且增加基質金屬蛋白酶(matrix metalIoprotease，MMP) (MMP2/9)分泌。近來，Epacl訊息傳遞被發(fā)現(xiàn)與軸突的再生有關。Epacl活化促進神經(jīng)軸向外生長，其與提升 cAMP以增強脊髓組織上的神經(jīng)軸突再生之效果相同。其亦顯示活化的Epacl與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)以協(xié)同方式增強PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞之神經(jīng)軸延伸。再者，內皮前驅細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的Epacl活化在后肢缺血模型中能增加EPCs復位至缺血的肌肉及造成血管新生。 組織低氧對于刺激Epacl的誘發(fā)之貢獻仍是未知。由于低氧期間之代謝調控，組織間的腺嘌呤核苷濃度上升至活化內皮腺嘌呤核苷受體(adenosine receptors,ARs)并增進內皮細胞之增生與移動的濃度。本發(fā)明關于在HP條件下調適干細胞，如臍帶血干細胞(hUCB)。受此調適之干細胞可用于治療腦組織損傷。各種干細胞可用于本發(fā)明中。干細胞之實例包括臍帶血干細胞、 造血干細胞、胚胎干細胞以及其它可分化成功能性的神經(jīng)元或神經(jīng)膠細胞之干細胞。所稱“干細胞”指能分化成許多最終、經(jīng)分化的細胞類型之細胞。干細胞可為全能性或多能性。全能性干細胞典型地具有發(fā)育成任何細胞類型之能力。全能性干細胞在來源上可為胚胎及非胚胎二者。多能性細胞典型地能分化成數(shù)種不同的最終分化的細胞類型之細胞。單能干細胞只能產生一種細胞類型，但具有自我更新之特性而使其能與非干細胞區(qū)分。這些干細胞可源自于各種組織或器官系統(tǒng)，其包括但不限于，血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸道、骨骼、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺及其類似者。根據(jù)本發(fā)明，干細胞可衍生自成人或新生兒之組織或器官。本發(fā)明所描述的細胞是實質上純的(substantially pure)。所稱“實質上為純的”，當用于描述干細胞或從其衍生而來之細胞(例如，分化的細胞)時，意指該特化的細胞是構成制劑中實質的部分或主要的細胞(例如，超過20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%或95% )。一般而言，實質上純化之細胞群是構成制劑中至少約70%之細胞， 通常是制劑中約80%之細胞，尤其是制劑中至少約90%之細胞(例如，95%、97%、99%或 100% )。在一較佳具體實施例中，本發(fā)明使用臍帶血細胞。這些干細胞可通過該領域已知之方法予以富集且由標準技術予以測試。為了確認該等細胞之分化潛力，可通過該領域已知之方法經(jīng)誘導形成，例如，各種細胞集落形成單位。經(jīng)確認之細胞可進一步于非分化性之培養(yǎng)基增生，超過10、20、50、或100代以上之族群倍增率(population doubling)，其中無自發(fā)性分化、老化、形態(tài)改變、增加的生長速度或分化為神經(jīng)元之能力的改變之跡象。該等細胞可于使用前以標準方法保存之。所稱“增生”與“擴增”于此可交替地使用以描述細胞，指通過分裂使相同種類之細胞數(shù)增加。所稱“分化”指細胞針對一特定功能而成為特化的細胞之發(fā)育過程，例如，細胞獲得一或多種與初始細胞類型不同之形態(tài)上的特征及/或功能。所稱“分化”包含譜系走向(lineage commitment)及終末分化過禾呈(terminal differentiation processes) 二者。分化是可被評估的，例如，通過使用免疫組織化學法或本領域的技術人員所知的其它流程，以監(jiān)測譜系標記之存在與否。自先驅細胞衍生之后代分化細胞可能，但非必然，與該干細胞之來源組織之相同胚層或組織 有關。例如，神經(jīng)先驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血的細胞譜系。所稱“譜系走向，，及“特化”于本文交替使用，指一干細胞發(fā)展之流程，其中該干細胞發(fā)展成定向于形成特定限制范圍之細胞分化類型的前驅細胞。定向的前驅細胞通常具有自我更新或細胞分裂之能力?！敖K末分化” 一詞指細胞進入成熟、完全分化的細胞之最終分化。例如，造血前驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為神經(jīng)或神經(jīng)膠細胞譜系，其終末分化導致成熟的神經(jīng)或神經(jīng)膠細胞。通常，終末分化與細胞周期之中斷及增生之停止有關。本文所稱“前驅細胞”指定向于特定細胞譜系之細胞，且其通過一連串細胞分裂以發(fā)展成該譜系之細胞。如同ES細胞，經(jīng)調適的hUCB具有分化成各種細胞的潛能，包括神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠細胞。它們因此能用來再生細胞，以治療腦組織損害。如以下實例所示，hUCB能于活體外輕易地分離、維持及擴增，并且用常規(guī)技術方法誘導分化。此外，將經(jīng)調適的hUCB移植至小鼠或大鼠之后，沒有顯示有絲分裂的活化細胞、畸胎瘤或惡性腫瘤之證據(jù)。這些細胞能被用于移植，以治療中風、頭部創(chuàng)傷或神經(jīng)退化，而無上述顧忌。由于這些優(yōu)點，此細胞代表其它多能性細胞之替代者。經(jīng)此調適之細胞可用標準方法儲存或可由腦內投予有需要的患者。于本發(fā)明之范疇中，本發(fā)明是一種用于治療患者之腦組織損傷或減輕該病癥之癥狀之方法。此方法包括鑒定出患有或存在發(fā)展為腦部組織損傷之潛在風險的患者。此患者可為人類、或非人類之哺乳類動物，如，貓、狗、或馬。腦部組織受損之實例包括由腦部缺血 (如，慢性中風)或神經(jīng)退化性疾病(如，帕金森氏癥、阿茲海默癥、脊髓小腦癥、或亨丁頓舞蹈癥)所造成之損傷。欲接受治療之患者可通過用于診斷有興趣的病況或病癥之標準技術予以鑒定。該治療方法須將有效量之前述經(jīng)HP調適之干細胞投予有需要之患者。上述細胞之治療效果可通過標準方法評估(如以下實例說明者)。為確認增進腦血管新生之功效，吾人可通過標準腦部影像技術于治療前后檢驗患者，例如，例如，電腦斷層掃描(CT，computed tomography)、都卜勒超音波影像技術(DUI, Doppler ultrasound imaging)、磁振造影(MRI，magnetic resonance imaging)與氫質子磁振頻譜(1H-MRS)。例如，氫質子磁振頻譜(1H-MRS)代表非侵入性方法，以獲取和腦部代謝活動相關之生化資訊 (Lu et al.，1997，Magn. Reson. Med. 37，18-23)。此技術可用于評估有干細胞移植或無干細胞移植之涉及腦部缺血之代謝變化。例如，其可用于研究腦內N-乙酰天門東胺酸(NAA， N-acetylasparate)之濃度，其為腦神經(jīng)元完整性之指標。雖然神經(jīng)碎片中NAA的重新分布和殘留限制其作為一種定量之神經(jīng)標記，然而，腦部缺血時之腦中NAA濃度下降仍可被視為神經(jīng)元喪失或功能異常之指標(Demougeot et al.，2004，J. Neurochem. 90，776-83)。因此，通過1H-MRS測得之NAA濃度可作為有效指標，用以追蹤腦部缺血后之干細胞移植之效用。也可在給藥前后，從來自動物之樣本(如，腦脊液)測量營養(yǎng)因子或細胞死亡相關蛋白質之表現(xiàn)量(如，Epacl或MMP2)。該表現(xiàn)量可通過mRNA含量或是蛋白質含量來決定。 測量組織樣本或體液之mRNA含量的方法是公知技術。為測量mRNA含量，細胞可被裂解，而存在于細胞溶解物中之mRNA量，無論純化與否，皆可通過，如雜交分析(使用可探測之標定的基因特異性DNA或RNA探針)及量化或半量化RT-PCR(使用適合的基因特異性引子對) 測量之。另外，量化或半量化之原位雜交分析可使用可探測之(如螢光或酵素)標定的DNA 或RNA探針，在組織切片或未裂解之細胞懸浮液進行其它的mRNA定量方法包含該RNA保護試驗(RNA protection assay,RPA)方法，及基因表現(xiàn)系列分析方法(serial analysis of gene expression, SAGE)，以及以陣列為基礎之技術。測量組織樣本或體液中蛋白質含量的方法是公知技術。其中部分是使用抗體 (如，單株抗體或多株抗體)，其可特異性地結合至目標蛋白。于此等分析中，該抗體本 身或與其結合之第二抗體皆可接上可探測的標記。另外，該抗體可與生物素結合。其存在能通過可探測標記之卵白素(一種結合生物素的多勝肽)而予以測量。這些方法之結合(包括 “多層夾心結構”分析)可用于提升該方法之靈敏度。一些蛋白質測量分析(如，ELISA或西方墨點法)可被應用于體液或細胞溶解物，或其它者(如，免疫組織方法或螢光流式細胞儀)可應用于組織切片或未溶解之細胞懸浮液。適當?shù)臉擞洶ǚ派湫院朔N(如，1251、1311、 35S、3H或32P)、酵素(如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化氫酶、冷光酵素、或半乳糖苷酶)、螢光 /冷光劑(如，螢光素、鹽基桃紅精、藻紅素、GFP、BFP、以及由Quantum Dot Corporation, Palo Alto，CA所供應之Qdot 奈米粒子)。其它他可應用之方法包含定量免疫沈淀分析或補體結合試驗。基于上述分析之結果，可決定適當?shù)膭┝糠秶屯队柰緩?。所需劑量取決于所選擇的投予途徑、配方的性質、病患的疾病性質、患者的身材大小、體重、表面積、年齡和性別、 其它的投予藥物以及主治醫(yī)師的診斷。有鑒于不同投予途徑有不同的效率，因此，劑量的變化是必須的。此變化可使用可用標準經(jīng)驗上常見途徑來調整使之最佳化，這是本領域能夠理解的。一般而言，可投予IxlO4及IxlO7 (如，IxlO5至5xl06以及更佳為5x10s至2xl05) 的細胞。可使用多重區(qū)域，其視特定損傷之位置及性質而定。下述實例說明用于在大鼠缺血模式中投予細胞之近似座標。在其它物種的其它疾病之作標可依比較解剖學來決定。異體或自體hUCB均可使用。于前者情況，應進行HLA配對，以避免或降低宿主反應。于后者情況，自體hUCB可從患者中予以富集及純化，然后保存供后續(xù)使用。本發(fā)明的另外特征是一種治療神經(jīng)退化疾病之方法。此方法包括鑒定出患有或存在發(fā)展為腦部組織損傷之潛在風險的患者，以及將有效量之多能性動物細胞投予該患者， 其以上述方法處理。神經(jīng)退化性疾病的例子包括帕金森氏癥、阿茲海默癥、脊髓小腦癥、或亨丁頓舞蹈癥。在上述所有方法中，投予(如，大腦內)至患者的細胞數(shù)為IxlO4至1x107 次，較佳為IxlO5至5xl06/次或更佳為5xl05至2xl06/次。為降低或避免宿主排斥，較佳的細胞為患者自體的細胞?！爸委煛币辉~指將組合物(如，細胞組合物)投予至患有，其患有或存在發(fā)展為腦部組織損傷或因疾病而造成該損傷之潛在風險，目的為治愈、減輕、解除、治療或緩解損傷/ 病癥、該損傷/病癥之癥狀、繼發(fā)于該損傷/病癥之疾病狀態(tài)或傾向于該損傷/疾病之易感性。該治療方法可單獨進行或與其它藥物或療法并行。上述方法可進一步包括于細胞移植前、同時、或其后，以一種低度抑制免疫方案投予患者?？刹捎枚喾N類型的抑制免疫方案。實例包括投予抑制免疫藥物、誘發(fā)免疫耐受性的細胞群、及/或抑制免疫的輻射射線。選擇及投適合的抑制免疫方案之指導原則是本領域公知技術(如，Kirkpatrick et al.，1992. JAMA. 268，2952 ；Higgins et al.，1996. Lancet 348，1208 ；Suthanthiran et al.，1996. New Engl. J. Med. 331,365 ；Midthun et al.，1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison et al. ,1994. Am J. Med. 97,14 ；Hanto 1995. Annu Rev Med. 46,381 ；Senderowicz et al. ,1997. Ann Intern Med. 126,882 ；Vincenti et al.,1998. New Engl. J. Med. 338,161 ；Dantal et al. 1998. Lancet 351,623)。合適的抑制免疫藥物之實例包括CTLA4_Ig、抗-⑶40之抗體、抗-⑶40配位基之抗體、抗-B7之抗體、抗-⑶3之抗體(例如，抗-人類⑶3之抗體0KT3)，胺甲基葉酸(methotrexate，MTX)、培尼皮質酮、甲基培尼皮質酮、咪唑硫嘌呤、環(huán)孢子菌素 A (cyclosporin A，CsA)、他克莫司(Tacrolimu s)、環(huán)磷酸酰胺以及福達樂(f ludarabin)、山喜多(mycophenolate mofetil)、賽尼哌(一種人類化(IgGl Fe)之抗 IL_2Ra 鏈(CD25) 抗體)、共軛于毒素(例如，霍亂A鏈或綠膿桿菌毒素)之抗-T淋巴細胞抗體、以及能抑制哺乳動物雷帕霉素目標蛋白(mammalian-target-of-rapamycin，mTOR)之活性的抑制劑。本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，其包含前述細胞或活性試劑/化合物。在一實例中， 本發(fā)明的特征是一種組合物，其具有前述多能性細胞(如，CD34+細胞或從臍帶血獲得者) 與低氧試劑(如，去鐵胺與CoCl2)。醫(yī)藥組合物之制備可通過混合治療有效量之細胞或活性試劑/化合物(可視需要之其它活性物質)及醫(yī)藥上可接受的載劑而制得。上述醫(yī)藥組合物可通過使用已知的醫(yī)藥賦形劑及制備方法來制備。所有賦形劑可與溶劑、?；瘎?、保濕劑及黏合劑進行混合。本文所稱“有效量”或“治療有效量”指造成特定病癥之至少一種癥狀或參數(shù)之可測量的緩解的含量。前述細胞之治療有效量可由此領域已知之方法決定。用以治療一并癥之有效量可通過本領域技術人員所知的經(jīng)驗方法而輕易地決定。用以投予病患之確切含量將依該病癥之情況及嚴重度以及該病患之生理情況而有所不同。任何癥狀或參數(shù)之可測量的緩解可由本領域的技術人員而決定或由該病患向醫(yī)師報告。將被理解的是，前述病癥之任何癥狀或參數(shù)之任何臨床上或統(tǒng)計上的顯著減弱或緩解皆屬于本發(fā)明之范疇內。臨床上的顯著減弱或緩解意指對于該病患及/或于醫(yī)師而言是可察覺的?！搬t(yī)藥上可接受的” 一詞指該等組合物之分子個體及其它成分，當投予人類時，其生理上可接受的且一般不會產生不想要的反應。較佳地，所稱“醫(yī)藥上可接受的”意指聯(lián)邦或州政府之管理處所核準者、或列于美國藥典、或于其它一般公認可用于哺乳動物(特別是指人類)之藥典者。醫(yī)藥上可接受鹽類、酯類、酰胺，以及前驅藥，指該些鹽類(如，羧酸鹽、胺基酸添加鹽)、酯類、酰胺，以及其前驅藥，其于可靠的醫(yī)療判斷范疇內適合用于與病患組織接觸，而無過度毒性、刺激性、過敏反應及其類似者，其與合理的利益/風險相稱，且對于所欲用途是有效的。可應用于前述醫(yī)藥組合物之載劑指稀釋劑、賦形劑、或載體，由此化合物予以投用。該等醫(yī)藥載劑可為無菌的液體，例如，水及油。較佳地，水或水溶液、鹽液、及液態(tài)葡萄糖及甘油溶液可作為載劑，特別是可作為注射溶液。適合的醫(yī)藥載劑說明于E.W.Martin所撰之"Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 18 片反。該等前述細胞可通過灌注或注射(例如，靜脈注射、腦脊髓膜內注射、肌肉注射、 腔內、氣管內、腹腔或皮下)、口服、皮膚穿透、或此領域所知的其它方法而投予至個體。投予可為每兩周一次、一周一次、或更頻繁，但當該疾病或病癥于維持期時，其投予頻率則可能會減少。以下特定之實施例僅供示例說明，無論以何種方式無法限制未揭示部分。無需進一步詳細闡述，相信本領域技術人員可基于本文之說明，將本發(fā)明發(fā)揮至極致。本文所有引述文獻以參考方式并入本說明書中。再者，任何以下所提及之機制不會以任何方式限制本發(fā)明專利權利要求之范疇。材料與方法CD34+hUCBs (hUCB34)之純化與篩選

如先前所述(Kekarainenet al.，2006，BMC Cell Biol 7 :30)，從新鮮或冷凍保存的人類臍帶血(hUCBW) (Stemcyte，USA)制備單核球細胞(Mononuclear eel Is, MNCs)。用淋巴細胞分離(Ficoll-Histopaque，Sigma, USA)離心法(Asahara et al.，1997，Science 275 :964-967)將MNC層收集，接著以含ImM EDTA的PBS清洗兩次。依制造商之說明書， 通過磁珠分離法(MACS ；Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)，從 2X IO8MNCs 中分離出 CDSA+MNCstj簡言之，將MNCs懸浮于300 μ L PBS與5mM EDTA中。這些細胞以抗CD34的半抗原共軛單株抗體(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)及結合微珠之抗-半抗原之抗體的進行標記，然后以每108細胞100 μ L磁珠之比例在4°C中共育15分鐘。磁珠陽性細胞在磁場中(⑶34+MNCs)富集于正向-篩選-管柱。使用標記藻紅蛋白(phycoerythrin， ΡΕ) (Becton Dickinson, USA) "CD34 # (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) M 于MACS-收集細胞進行之FACS分析顯示選出的細胞有94% 士 1.7%為⑶34陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，以 1 μ g/mL 的雙苯甲亞胺(bis-benzimide ；Hoechst 33342 ；Sigma, USA) 標記細胞，在37°C、5%二氧化碳/95%空氣的潮濕氣體與抗生素中，于培養(yǎng)液(StemSpanTM SFEM and Cytokine Cocktail, StemCell Technologies)培養(yǎng) 72 小時，并為進一步的移植而作準備。低氧預調控(HP)程序與形態(tài)分析將hUCB34 細胞(1 X 106/mL)培養(yǎng)在 StemSpan SFEM 培養(yǎng)液中，于 37 °C、5 % C02 潮濕培養(yǎng)箱中，條件為正常氧(20% O2)或低氧(1% O2)，如先前所述(Ivanovic et al.， 2000,Br J Haematol 108:424-429)。低氧培養(yǎng)是以雙-氣體培養(yǎng)箱(Jouan,Winchester, Virginia,USA)配備O2探針來調節(jié)N2濃度。以臺盼藍排除分析來評估細胞數(shù)目與存活數(shù)。 對于流式細胞儀部分，細胞與抗-人類CD34 (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)共育， 接著以FACSCalibur流式細胞儀(Becton，Dickinson and Co.)分析。為了產生化學性的低氧，細胞以含有 60 至 600mM 去鐵胺(Desferrioxamine，DFX, Sigma-Aldrich, MO)之培養(yǎng)液處理，其通過抑制HIF-I α因泛素化所必需的脯胺?；鶜埢u化作用來模擬低氧調控 (Schioppa et al.，2003，J Exp Med 198 1391-1402)。Rapl活性分析Rapl活性分析根據(jù)制造商之說明書使用Rapl-活性分析套組(Upstate)而進行 (Goichberg et al.，2006，Blood 107:870-879)。簡言之，hUCB34 是以前述之短暫低氧處理。然后，將細胞裂解于Rapl活性裂解緩沖液中。通過離心使細胞溶解物澄清化，保留一部分細胞溶解物，供分析總Rapl含量之用，另將500 μ L溶解物與預先連結至麩胱甘胺酸小珠之Ral⑶S的GST-標記RBD (Upstate)共育，以特異性地將Rapl之GTP-結合態(tài)沉淀出。 樣本在4°C共育45分鐘同時溫和的旋轉。在溶解緩沖液中清洗小珠三次。使用西方墨點法以抗Rapl抗體偵測Rapl (Upstate)。(Chromatin immunoprecipitation, ChIP) yMff為了證明HIF-I α 蛋白會結合至 Epacl 啟動子上(Zanata et al.，2002，Embo J 21 :3307_3316)，以市售套組(Upstate Biotechnology)使用制造商之說明書，以些微調整進行Chip分析。hUCB34生長并培養(yǎng)于空氣或O2中4小時，接著直接加入甲醛至培養(yǎng)液中，最終濃度為1%，隨后依先前文獻所述(Ponnusamy et al.，2008，J Biol Chem 283 27514-27524)在37°C下培養(yǎng)20分鐘。在連結至蛋白質A瓊脂珠上之鮭魚精子DNA上分離 DNA-蛋白質復合體，并以1%505與0. IM NaHCO3沖提。通過在65°C下共育5小時進行交聯(lián) (cross-linking).用蛋白質酶K移除蛋白質，接著以酚/氯仿萃取DNA，回溶并且與Epacl 啟動子引子以PCR-增幅， iEt^ii歹IJ 59-attcagcagatatagggcag-39反向序列59-acagtcagctctcattaatg-39 (反向)。(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)已有先前文獻描述使用EMSA以評估HIF-I α DNA結合活性之詳細方法(Yin et al.，2000，Biochem Biophys Res Commun 279:30-34)。使用市售套組制備細胞核萃取物(Pierce)。使用對應到Epacl啟動子中的低氧反應元件(hypoxia-response element,HRE)之寡核苷酸探針(5，-CCTCCCGGCCACGTGGCGGCCAG-3，及 5，-GGAGGGCCGGTGCA CCGCCGGTC-3’)。依制造商之說明書，使用光移位EMSA套組(Pierce)進行寡核苷酸之非-放射線標記。簡言之，結合反應于20ml之含有結合緩沖液(IOmM Tris-HCl、20mM NaCl, ImM DTTUmM EDTA、以及 5%甘油、pH 7. 6)、標記探針 0. Ing( > 10，OOOcpm)、核蛋白 30 μ g 與聚(dl-dC) 1 μ g的反應混合物中進行。于室溫下共育20分鐘后，該混合物在非變性6% 聚丙烯酰胺膠體上，于低離子強度條件下，以180伏特進行膠體電泳2至4小時。將該膠體予以真空干燥并進行自動放射顯影照相。對于超位移分析，在加入標記探針前1小時，將 Iyg 之抗-HIF-I α 抗體(Novus Biologicals)加入樣本中。實驗動物的腦內hUCB34移植將實驗大鼠與小鼠分成3組(圖2A)經(jīng)HP之hUCB34之腦內移植組(HP-hUCB34)、 無HP之hUCB34之腦內移植組(hUCB34)與空白-對照組。所有移植在第7天進行。HP-hUCB34 組在低氧條件下處理20至24小時。在各實驗組的第O天誘發(fā)腦部缺血。在腦部缺血后第7天，兩組腦內移植hUCB34的實驗大鼠通過26-或30- 口徑之Hamilton注射器以立體定位方式注射3至5 μ L PBS懸浮液到3個大腦皮質區(qū)域，硬膜下方3. O至5. Omm (小鼠為 2. O至3. Omm)，該懸浮液有約2 X 105具雙苯甲亞胺標記的hUCB34。這些位置之近似座標大約是前囟門前方1.0至2. Omm(小鼠為O至1.0mm)與中軸線旁3. 5至4. Omm(小鼠為2.0 至2. 5mm)、前囟門后方0.5至1.5mm(小鼠為0至1.0mm)與中軸線旁4.0至4. 5mm(小鼠為2.0至3. 5mm)以及前囟門后方3. 0至4. 0mm(小鼠為1. 5至2. 5mm)與中軸線旁4. 5至 5. Omm(小鼠為2. 0至3. 0mm)。每次注射后針頭停留在原處5分鐘，然后于頭骨缺損處敷上一片骨蠟防止注射液體漏出。空白-對照組大鼠在立體定位下注射鹽水。各組實驗大鼠每天注射環(huán)孢子菌素A (CsA，10mg/kg,皮下注射，Novartis)，分別地以等量的CsA或鹽水注射到移植組和鹽水對照組，如先前所述(Muller et al. ,Nature 410:50-56 and Aandahl et al. ,2002, J Immunol 169:802-808)。為了抑制移植的 HP-hUCB34 之 Epacl 之活性，細胞另再與10μ g/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)作用2-3小時，如先前所述(Muller et al.，Nature 410 50-56 and Aandahl et al.，2002，J Immunol 169 :802_808)。此夕卜，連續(xù)8天于腹腔注射一種廣泛性、特定-種類之金屬蛋白酶抑制劑(GM6001，Chemicon) IOOmg/ kg,如先前所述(Lee et al. ,2006, J Neurosci 26:3491-3495)。
神經(jīng)病學的行為評分在腦部缺血3天前進行行為評估。該測試是測量(a)身體的不對稱性，如先前所述，(b)運動功能，如先前所述，與(c)抓力，使用抓力測量儀(TSE-Sy stems ,Germany)進行， 如 先前文獻加以修改(Shyu et al. ,2008, J Clin Invest 118:2482-2495)。[18氟]氟化-2-去氧葡萄糖正子斷層造影(FDG-PET)檢查為了評估腦組織代謝活性，使用[18氟]氟化-2-去氧葡萄糖([18F] fluoro-2-deoxyglucose,FDG)之microPET掃描檢驗實驗大鼠，以測量相對代謝活性，如先前所述(Carmichael et al. ,2004, Stroke 35 :758_763)。簡言之，如先前所述(Hamacher et al.，1986，J Nucl Med 27 :235_238)，以自動 18 氟-FDG 合成系統(tǒng)(Nihonkokan)合成 18 氟-FDG。以高解析度的小動物PET搜集數(shù)據(jù)(microPET Rodent R4, Concorde Microsystems Inc.)，該系統(tǒng)參數(shù)如Visnyei等人之先前文獻所述(Carmichael et al. ,2004, Stroke 35: 758-763)。在各處理一周后，以水化氯醛(0. 4g/kg，皮下)麻醉動物，固定于訂做的頭部固定器，并于microPET掃描器下定位。然后，對動物給予溶于0. 5mL鹽水的18氟_FDG(200 至250 μ Ci/大鼠)之高量靜脈注射。使用3-D擷取技術，在一基礎位置上，于注射同時開始擷取資料并持續(xù)60分鐘。將從microPET取得的影像資料顯示出來，并且通過5. 5版本 IDL (Research Systems)禾口 3· 2 版本 ASIPro (Concorde Microsystems)之軟體進 亍分析。 用于紋狀體和皮質測量之冠狀切片代表來自前囟門0與+Imm之間的腦部區(qū)域，而視丘測量代表來自前囟門_2與_3mm之間的腦部區(qū)域，其系如非損傷側之目視檢查所測量者。在終腦皮質與皮質所關注區(qū)域中的相對代謝活性以百分比缺損表示，如先前所述加以修改 (Carmichael et al.，2004，Stroke 35 :758_763)。評估hUCB34移植所誘發(fā)之血管新生通過靜脈注射投予螢光標記血漿(FITC-dextran，Sigma, USA)至大鼠并以螢光顯微鏡觀察(Carl Zeiss, Axiovert 200M,Germany)，以分析腦的微循環(huán)，如先前所述(Morris et al.，1999，Brain Res Brain Res Protoc 4:185-191)。此外，為量化腦血管密度,實驗大鼠以水化氯醛麻醉，接著以4%三聚甲醛灌流。以⑶-31(1 100, BD-Pharmingen, USA)特異性并與 Cy-3(1 500，Jackson Immunoresearch，PA，USA)共軛之抗體對組織切片(6μπι)進行染色。測定血管數(shù)目，如先前所述(Taguchi et al.，2004，J Clin Invest 114 330-338)。腦血流(cerebral blood flow, CBF)之測量將實驗大鼠以立體定位儀定位，并且在腦部缺血后，于麻醉狀態(tài)下以雷射都卜勒血流儀(LDF monitor, Moor Instrutments, Axminster, U. K.),監(jiān)控底線區(qū)域之皮質血流(baseline local cortical blood flow，bCBF)，如先前所述(Park et al. ,2005, J Neurosci 25:1769-1777)。簡言之，CBF值的計算是相較于bCBF之增加的百分比。原位酶譜分析(In situ zymography, ISZ)與免疫組織化學染色為找出明膠酶活性區(qū)域，以標記FITC之明膠在腦切片上進行原位酶譜分析。將缺血腦部(在不同時間點移植后3天、7天、14天以及28天)快速移出，而不進行固定，然后于干冰上冷凍，如先前所述(Amantea et al.，2008，Neuroscience 152 :8_17)。在冷凍切片 (每片20μπι)后，依制造商之說明書，使標本于37°C與螢光標記明膠(Invitrogen)共育。 通過使用此技術，基質之蛋白水解造成綠螢光之解除阻斷。ISZ結合針對Neu-N與Epacl之神經(jīng)元-特異性標記之免疫組織化學染色，其它另外的切片接著以2%三聚甲醛固定并且使用與 Cy-3(1 500 Jackson Immunoresearch)共軛之 Neu-N(1 200，Chemicon)以及 Epacl (1 ； 400, Santa Cruz) ^ifl{φ, ill^T^Mfeid (Amantea et al. , 2008, Neuroscience 152 8-17)。西方墨點分析法使用西方墨點 分析法在hUCB34-處理組與對照組動物中測量右腦皮質與紋狀體區(qū)域蛋白質表現(xiàn)，如先前所述(Shyu et al. ,2005, J Neurosci 25:8967-8977)。簡言之，實驗動物在腦部缺血后3天斷頭。從中風腦之周圍區(qū)域(邊緣區(qū)域)與紋狀體取得缺血的腦皮質樣本。在這些樣本上進行西方墨點分析。接著將缺血的腦組織在含有320mM蔗糖、5mM HEPESU μ g/mL亮抑酶與1 μ g/mL抑肽酶之緩沖液中均質與溶解。溶解物在13000g下離心 15分鐘。將產生的沉淀物重新懸浮于樣本緩沖液中(62. 5mM Tris_HCl、10%甘油、2% SDS、 0. 溴酚藍與50mM DTT)，并進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(4至12% )電泳。然后移轉至 Hybond-P尼龍膜上。接著與適當稀釋之Bcl-2(稀釋率1 200 ；Santa Cruz，USA)、Bax (稀 200 ；Santa Cruz,USA) 200 ；Transduction Laboratories,USA) >
MMP2(1 200，Abeam)、Epacl(l 400，Santa Cruz)、CXCR4 (1 200，R&D System)以及 i3-Actin(稀釋率1 : 2000，Santa Cruz，USA)之抗體作用。依照制造商之使用明，針對各別抗體進行膜阻斷、初級與次級抗體共育及化學發(fā)光反應。每個條帶之強度用Kodak Digital Science ID Image Analysis System (Eastman Kodak，Rochester，NY)測量。與內對照組比較，計算出西方墨點之條帶強度比例。膠體酶譜法分析將帶有等量腦萃取物與細胞溶解物之蛋白質裝載至具明膠(Bio-Rad，CA)之10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。于電泳后，膠體在5% Triton X_100中清洗然后與MMP分析緩沖液共育(Bio-Rad)。條帶以考馬斯亮藍顯現(xiàn)并在30%甲醇與10%醋酸退染。體內神經(jīng)軸再生之評估將腦組織樣品進行免疫染色，以測量神經(jīng)軸向外生長。神經(jīng)軸再生之測量如先前所述進行之(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。簡言之，將各實驗大鼠之腦組織樣品固定并且以抗β-微管(1 400 ；Sigma)之專一抗體免疫染色。為了定量分析，具有大于細胞本體直徑兩倍以上之突起的神經(jīng)元視為具有神經(jīng)軸之細胞而并入計算。 使用數(shù)位影像與影像分析軟體(SigmaScan 4. 01. 003)，從數(shù)位影像測量每個神經(jīng)元最長神經(jīng)軸之長度并予以定量?；蜣D殖與剔除小鼠譜系Nestin-EGFP 基因轉殖小鼠為 Dr. Docherty (Bernardo et al. ,2006, Mol Cell Endocrinol 253 14-21)所贈。MMP9 缺陷小鼠(MMP9-/-)購自 Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA)。MMP2 同型合子缺陷小鼠(MMP2-/-)通過與來自 RIKEN Brain Science Institute之異型合子雜交而得。所有動物實驗皆通過中國醫(yī)藥大學動物研究倫理委員會的審查與批準。腦組織之免疫組織化學評估動物以水化氯醛(0.4g/kg，腹腔注射)麻醉后，以鹽水灌流心臟，接著以泡入 4%三聚甲醛而予以灌流，由此將腦固定，如先前所述(Shyu et al. ,2004, Circulation110:1847-1854)。以與 FITC(1 500 Jackson Immunoresearch)或 Cy3(l 500 ； Jackson Immunoresearch)共輒之抗 Epacl (1 ； 400，Santa Cruz) >MMP2 (1 ； 50，Abeam)、 GFAP(1 400 ；Sigma)、MAP-2(1 200 ；BM), Neu-N(1 200 ;Chemicon)及 vWF (1 400 ； Sigma)之特異性抗體進行雙重免疫螢光技術，如先前所述。組織切片以Carl Zeiss LSM510 雷射掃瞄共軛顯微鏡分析。分離GFP+之神經(jīng)干細胞(GFP+NSCs)將3天大之NeStin-EGFP-C57BL/6基因轉殖小鼠之腦取出。在移除腦膜后，從側腦室側壁無菌地分離并分解海馬回腦室下區(qū)，如先前所述(Wachs et al. ,2003, Lab Invest 83:949-962)。然后，細胞重新懸浮在 Neurobasal (NB)培養(yǎng)液中(Gibco BRL，Germany)， 添加 B27 (Gibco BRL, Germany)、2mM L-麩酰胺酸(PAN, Germany) U00U/ml 盤尼西林與 0. lmg/L鏈霉素(Gibco，Germany)。為了培養(yǎng)物之維持與擴增，NB/B27額外添加2 μ g/mL 肝素(Sigma, Germany), 20ng/mL FGF-2 (R&D Systems, Germany)以及 20ng/mL EGF (R&D Systems, Germany)。培養(yǎng)在37°C潮濕的5% C02培養(yǎng)箱中。使用繼代培養(yǎng)數(shù)為4到6之 GFP+NSC于整個研究中CD34+細胞與GFP+NSCs之共培養(yǎng)利用胰蛋白酶獲得GFP+NSCs (1 X 106)，接著分配至6孔組織培養(yǎng)盤之各孔中，俾與⑶34+共同培養(yǎng)。免疫篩選的⑶34+約為1 X 104細胞/mL，重新懸浮于在6-孔組織培養(yǎng)盤中之2mL混合物中，其包含 10%FBS、2mmol/L L-麩酰胺酸、IX ITS-S(Life Technologies, San Francisco，CA，USA)、足量的人類重組促血小板生成素(rhTPO ;Kirin Brewery, Tokyo, Japan) >50ng/mL flt3- # (FL ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA) >50ng/ mM^ -3(Interleukin-3, IL-3 ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA)與 25ng/mL S 素-6(Interleukin-6, IL—6 ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA)及 DMEM。每 2 天添力口 1 毫升新鮮培養(yǎng)液至各孔中，總共達8天。免疫細胞化學分析以PBS清洗細胞培養(yǎng)物，然后在4%三聚甲醛下于室溫固定30分鐘，如先前所述(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。在 PBS 清洗后，以阻斷溶液處理固定后的培養(yǎng)細胞達30分鐘(PBS內含10g/L BSA.0. 03% Triton X-100、以及4%血清)。以初級抗體與細胞于4°C共育一夜，其包括神經(jīng)膠酸性纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP, 1 300 ;Chemicon)、基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1，SDF-I，1 200 ；Chemokine)、第 4 型 CXC 受器(CXCR4,1 200 ；Chemokine)、 MMP9(1 200，Abeam)、β III-微管(Tuj_l，l 200 ;Chemicon)、微管相關蛋白-2 (MAP-2， 1 300 ；Chemicon)以及神經(jīng)細胞核抗原(Neu-N, 1 50 ;Chemicon)，達3小時，隨后與共軛于FITC之次級抗體共育達3小時，然后在PBS中潤洗3次。最后，玻片以DAPI輕度對比染色，以清水潤洗，然后封片?；铙w外神經(jīng)軸再生之評估為了 β-微管之免疫染色，細胞培養(yǎng)物以PBS清洗并在室溫下于4%三聚甲醛固定 30分鐘。以PBS清洗后，固定的細胞培養(yǎng)物以阻斷溶液處理30分鐘(PBS內含10g/L BSA、 0. 03% Triton X-100、以及4%血清)。細胞與抗β -微管(1 200 ；Chemicon)之初級抗體于4°C共育一夜，達3小時，隨后與共軛于FITC的次級抗體次級抗體共育達1小時，然后在PBS中潤洗3次。最后，玻片以DAPI輕度對比染色，清水潤洗然后封片。評估具有神經(jīng)軸細胞之數(shù)目以及神經(jīng)軸長度，如先前所述加以修改之(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。簡言之，各處理組在0⑶后分盤、固定且對β -微管進行免疫染色。為了定量分析，具有大于細胞本體直徑兩倍以上之突起的神經(jīng)元視為具有神經(jīng)軸之細胞而并入計算。使用數(shù)位影像與影像分析軟體(SigmaScan 4. 01. 003)，從數(shù)位影像測量每個神經(jīng)元最長神經(jīng)軸之長度并予以定量。所有測量數(shù)據(jù)是從3次重復的實驗計算而來。統(tǒng)計分析本研究中所 有測量皆為盲目(blindly)進行。結果以平均值士SEM.表示。行為分數(shù)已為常態(tài)性而評估之。學生t-試驗用以評估對照組與處理組間平均差異。缺少正常分布之數(shù)據(jù)是以單因子變異分析(One-Way AN0VA)進行分析。P值小于0. 05視為顯著。結果HP提升hUCB34細胞的良好功效西方墨點顯示在低氧條件下20至24小時，在蛋白質濃度上，確認HP-hUCB34中有增加的Epacl表現(xiàn)(圖IA-I至1A-2)。以DFX處理之HP-hUCB34，在低氧或正常氧條件下，達到遠高于對照組細胞之Epacl濃度(圖1A)。我們也在HP-與DFX-處理的hUCBs34中測得低氧誘發(fā)因子-1 α (HIF-1 α )之蛋白質濃度增加(圖1Α-1至1Α-2)。短暫低氧之HP-hUCB34 增加Rapl的GTP-鍵結活化態(tài)，并且在刺激15分鐘后達到最大值。這些數(shù)據(jù)顯示HP-hUCBs34 表現(xiàn)出功能性的Epacl以及低氧能在HP-hUCB34激活Rapl-GTP之活性。為了獲得HIF-I α與Epacl啟動子之間交互作用的直接證據(jù)，我們用染色體免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)分析法，測量針對 Epacl 啟動子之 HIF-Ia 吸引反應。雖然在正常氧調控下未觀察到HIF-I α與Epacl啟動子之間有交互作用，但是在低氧調控4小時后明顯測到針對Epacl啟動子之HIF-I α吸引反應。在腦部缺血后腦內移植HP-hUCB34增進神經(jīng)病學的行為使用神經(jīng)病學的行為測量方法，評估在HP-hUCB34-(η = 10)及hUCB34-處理大鼠(η =10)與對照組大鼠(η = 10)上，于MCA結扎前后之神經(jīng)病學的功能(圖2Α)。行為的測量分數(shù)皆與基準分數(shù)校正。因為腦部缺血造成運動能力不平衡，所有的實驗大鼠在腦部缺血1天后，發(fā)生明顯肢體不協(xié)調與腦部缺血側之對側旋轉。通過磁珠分離法(MACS)分離出 hUCBs34。分離出來的hUCB34之純度以FACS分析法鑒定系大于90% (數(shù)據(jù)未顯示)。在處理14至28天后，相較于hUCB34-處理和對照組，以HP-hUCB34移植處理的大鼠顯示出肢體不協(xié)調性顯著地減少(圖2B)。測驗所有動物在腦部缺血前后之運動能力。大鼠接受腦部缺血后HP-hUCB34移植組相較于hUCB34-處理與對照組在第14與28天間垂直活動、垂直移動時間以及垂直移動次數(shù)顯著地增加(圖2C、D與E)。另外，抓力的測量用于測驗所有實驗大鼠在處理前與其它兩種處理28天后的前肢力。結果顯示，在HP-hUCB34組較hUCB34-處理組與對照組有較高的抓力比率(圖2F)。相反地，各實驗大鼠在HP-hUCB34植入后(η = 8)， 接受腹腔注射MMP抑制劑(GM6001)在神經(jīng)病學的行為測量顯示幾乎無恢復，其與空白對照組大鼠在腦部缺血后的測量相同(圖2Β至F)。另外，通過抑制Epacl活性，缺血大鼠移植以布雷菲德菌素A(brefeldin Α)誘導后之HP-hUCB34，在神經(jīng)病學的功能障礙改善程度會向下調節(jié)至與對照組相同(η = 8)(圖2B至F)。HP-hUCB34-處理的中風大鼠之葡萄糖的代謝活性增加
為證實是否腦內移植 HP-hUCB34能增加葡萄糖的代謝活性，各實驗大鼠接受 18FDG-PET檢測。在各處理1周后通過FDG microPET測量葡萄糖代謝。攝入的FDG在 microPET下影像顯示出HP-hUCB34處理組中整個右腦皮質攝入的FDG明顯增加(圖2G-1 至2G-2)。腦右半球(相對于非中風的腦半球)之相對葡萄糖代謝活性的半定測量量，顯示HP-hUCB34-處理大鼠(η = 8)相較于hUCB34-處理(η = 8)以及對照組大鼠(η = 8)明顯地增加(圖2G-2)。腦內移植HP-hUCB34增加活體內細胞植入與神經(jīng)分化為了判定是否外源性移植HP_hUCB34可成功植入缺血腦部并且在實驗大鼠的缺血腦部能分化成神經(jīng)元以及神經(jīng)膠細胞，使用雷射掃瞄共軛顯微鏡進行免疫螢光共定位研究。以雙苯甲亞胺標記之移植的HP-hUCBs34適當?shù)刂踩肴毖X部(圖3A-1與3A-2)。在 HP-hUCB34處理過的缺血大鼠腦部之邊緣部位中，共定位研究顯示某些雙苯甲亞胺標記細胞與MAP-2、Neu-N與GFAP的抗體具有共同位置(圖3B_D)。HP-hUCB34-處理過的大鼠分化率( 5. 5% MAP-2+、 4% Neu-N+ 與 9. 5% GFAP+) (η = 8)也高于 hUCB34_ 處理過的大鼠( 3% MAP-2+、 2% Neu-N+ 與 5% GFAP+) (η = 8)。此夕卜，在 HP-hUCB34-處理大鼠通過注射GM6001(n = 8)與布雷菲德菌素A-預處理(η = 8)也會降低植入細胞之數(shù)目 (圖 3Α-2)。腦內移植HP-hUCB34誘發(fā)血管新生以促進腦血流量(facilitate cerebral blood flow, rCBF)為了偵測HP-hUCB34是否能誘發(fā)血管新生，在HP-hUCB34-處理、hUCB34-處理與空白_對照組大鼠的腦切片上進行雙重免疫螢光染色、FITC-葡聚糖灌流檢查與血管密度分析。結果指出在幾組移植過HP-hUCB34 (雙苯甲亞胺-標記)在缺血的腦部之邊緣區(qū)域中顯示血管的形態(tài)(vWF細胞)圍繞在周邊血管與內皮區(qū)域(圖3E)。目視檢查指出HP-hUCB34 處理組(η = 8)比hUCB34處理組(η = 8)和對照組(η = 8)，其充滿FITC-葡聚糖的腦微血管有明顯的增加(圖3F)。血管密度的定量通過⑶31免疫染色檢查(圖3F)，發(fā)現(xiàn)邊緣區(qū)域中以HP-hUCB34處理的缺血大鼠(η = 6)比以hUCB34處理的缺血大鼠(η = 8)或對照組大鼠(η = 8)，表現(xiàn)出顯著較多的新生血管。為了驗證是否增加的血管密度能增強缺血腦部之CBF的功能，在腦部缺血后于麻醉情況下以雷射都卜勒血流儀(LDF)監(jiān)測實驗大鼠。腦部缺血后一周，相較于hUCB34-處理 (η = 8)和對照組大鼠(η = 8)，HP-hUCB34-處理的大鼠(η = 8)之皮質中間腦動脈之CBF 顯著增加。(圖3G-1與3G-2)。腦內移植HP-hUCB34可通過增加抗-凋亡蛋白、Epacl與MMP2之表現(xiàn)援救神經(jīng)組織為了研究移植HP-hUCB34影響重塑之分子機制，我們檢測凋亡_相關蛋白之表現(xiàn)。西方墨點法顯示，在移植后3天，相較于hUCB34-處理(η = 6)和對照組大鼠(η = 6)， HP-hUCB34-處理大鼠(n = 6)有顯著地向上調節(jié)的抗凋亡蛋白(如Bcl_2)(圖4A-1與 4A-2)。為了檢測移植HP-hUCB34是否會提高腦部缺血大鼠之Epacl與MMP2之表現(xiàn)，我們使用原位酶譜法(ISZ)、膠體酶譜法(GZ)、免疫組織化學法以及西方墨點法分析。ISZ證實明膠酶活性會表現(xiàn)于整個腦，尤其是在移植HP-hUCB34后的整個預移植區(qū)域(圖4B-1至4B-3)。ISZ之增加的明膠酶活性顯示在移植HP-hUCB34后與Epacl共表現(xiàn)(圖4B-2與 4B-3)。移植7天后，ISZ結合IHC分析顯示HP-hUCB34-處理大鼠(η = 6)比hUCB34-處理大鼠之腦切片有更多的明膠-Neu-N-雙苯甲亞胺之共表現(xiàn)細胞(4C-1與4C-2)。GZ顯示在移植7天后，HP-hUCB34-處理大鼠(η = 6)比hUCB34-處理大鼠(η = 6)之明膠酶活性(ΜΜΡ2) 明顯增加(圖4D-1與4D-2)。西方墨點蛋白質表現(xiàn)數(shù)據(jù)顯示在3至7天后HP-hUCB34移植大鼠比hUCB34-處理⑶(η = 6)和空白-對照組大鼠(Cv) (η = 6)之Epacl與ΜΜΡ2明顯增加(4Ε-1與4Ε-2)。移植HP-hUCB34會增加Rapl之GTP-鍵結活性，在移植后3天達到最高。在IHC實驗，3D共定位顯示移植HP-hUCB34會提升處理后第7天植入細胞中Epacl與 MMP2的共同表現(xiàn)(圖4F)。腦內移植HP -hUCB34提升神經(jīng)元新生以增進活體內神經(jīng)軸再生為了偵測在實驗大鼠缺血腦中移植的HP-hUCB34是否能經(jīng)由Epacl活化調節(jié)以分化成神經(jīng)元與神經(jīng)膠細胞，使用雷射_掃瞄共軛焦顯微鏡進行免疫螢光共定位實驗。在三度空間的共定位實驗，結果顯示在HP-hUCB34-處理與hUCB34-處理的缺血大鼠腦部邊緣處， 某些雙苯甲亞胺標記的細胞與Epacl+細胞具有共同位置，亦進一步與其它MAP2+、Neu-N+ 或GFAP+細胞具有共同位置(圖5A-1至5A-3)。測量干細胞移植組和對照組神經(jīng)軸形成，以確認HP-hUCB34或hUCB34的移植是否會刺激神經(jīng)軸向外生長。腦內移植HP-hUCB34比hUCB34-處理和對照組大鼠明顯的增進神經(jīng)軸的再生(圖5B-1)。在腦部缺血28天后，HP-hUCB34-處理大鼠(η = 8)比hUCB34-處理(η = 8)或對照組大鼠(η = 8)明顯有較長的神經(jīng)軸延伸至整個邊緣區(qū)域(圖5Β-2)。再者，在腦部缺血28天后，HP-hUCB34-處理大鼠(η = 8)比hUCB34-處理(η = 8)或對照組大鼠(η = 8)， 在邊緣區(qū)域以及紋狀體中有更多的具有神經(jīng)軸之神經(jīng)元。然而，在腦內缺血大鼠中移植以布雷菲德菌素A(brefeldin Α)誘發(fā)之HP-hUCB34 (η = 8)無法促進神經(jīng)軸再生(圖5Β-1至 5Β-3)。再者，在腦內缺血后之ΜΜΡ2-/-小鼠移植HP-hUCB34與hUCB34(n = 8，每組)與同窩對照組小鼠(η = 8)相比，無法顯著地改善神經(jīng)軸退化(圖5C-1與5C-2)。前述結果證明以⑶34—免疫收集之人類臍帶血之造血干細胞(HP-hUCB34)之HP可激活通過HIF-I α誘發(fā)由cAMP活化的交換蛋白_1 (Epacl)。通過HP之Epacl活化是通過測量 Rapl GTP 酶-活化蛋白(Rapl GTPase-activating protein, Rapl-GTP)之表現(xiàn)而表示之。在干細胞移植腦部缺血模式中，在HP-hUCB34中活化的Epacl-Rap訊息傳遞通過增進神經(jīng)病學上的缺損及葡萄糖的代謝活性而增強神經(jīng)重塑性，并提升神經(jīng)前驅細胞(neural progenitor cells, NPCs)的復位。此外，在 HP-hUCB34 中經(jīng)由 Epacl-Rapl 傳遞增加 MMP2 之活性也促進了干細胞移植后的中風大鼠之血管新生與神經(jīng)軸再生。總結，在hUCB34中通過HP活化之EapcI-Rapl訊息傳遞進一步調控MMP2活性，其在HP-hUCB34移植的腦部缺血模式中提供神經(jīng)重塑的微環(huán)境。其它具體實施例所有于本說明書所揭露之特征可以任何組合方式組合。于本說明書所揭露之每一特征可通過另一相同、等效、或相似目的之可替換特征來置換。因此，除非明確陳述，否則每一揭露之特征僅為各種等效或相似特征的一般系列之例示。于前述說明中，本領域技術人員可輕易確認本發(fā)明之必要技術特征，在無脫離其精神及范圍下，可對本發(fā)明進行各種不同改變及修改以使其適用于各種不同之用途及情況。因此，其它之具體實施例亦在以下權利要求之范疇內。
權利要求
1.一種增進具腦組織損傷之患者之神經(jīng)病學的行為功能的方法，其特征在于，包括 鑒定出患有腦部組織損傷的患者，以及將包含有效量之多能性細胞之組合物投予該患者，其中該多能性細胞通過一種包括在低氧條件下培養(yǎng)該細胞之流程而制備。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該多能性細胞為CD34+細胞。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該多能性細胞為CD34+細胞并且從臍帶血獲得。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該流程進一步包括在低氧條件下培養(yǎng)該細胞后，評估該細胞中的Epacl濃度。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該組合物從腦內投予。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法進一步包括通過非侵入性技術來評估該患者的治療效果。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞通過將細胞置放于包含60至600mM去鐵胺(Desferrioxamine，DFX)之培養(yǎng)液中達12至48小時而進行。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞是通過將細胞置放于包含100至450mM去鐵胺(Desferrioxamine，DFX)之培養(yǎng)液中達16至36小時而進行。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞是通過將細胞置放于包含200至350mM去鐵胺(Desferrioxamine，DFX)之培養(yǎng)液中達20至24小時而進行。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞是通過將細胞置放于包含0. 5至3% O2之培養(yǎng)箱中達6至48小時而進行。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞通過將細胞置放于包含0. 8至1. 5% O2之培養(yǎng)箱中達12至36小時而進行。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞通過將細胞置放于包含0. 9至1. O2之培養(yǎng)箱中達23至25小時而進行。
13.一種用于增加患者之組織的血管新生的方法，其特征在于，包括將包含有效量之多能性細胞之組合物投予有需要的患者之組織，其中該多能性細胞通過一種包括在低氧條件下培養(yǎng)該細胞之流程而制備。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，該患者具腦組織損傷且該組織為該患者之腦部。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞是通過將細胞置放于包含10至500 μ M COCl2之培養(yǎng)液中達12至48小時而進行。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧條件下培養(yǎng)該細胞是通過將細胞置放于包含100 μ M COCl2之培養(yǎng)液中達12至48小時而進行。
17.—種包括一或多種多能性細胞與低氧試劑的組合物。
18.如權利要求17所述的組合物，其特征在于，所述一或多種多能性細胞為CD34+細胞。
19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種多能性細胞從臍帶血獲得。
20.如權利要求19所述的組合物，其特征在于，該低氧試劑為去鐵胺或C0C12。
全文摘要
本發(fā)明揭露一種用于調適干細胞以及使用調適后之干細胞治療腦組織損傷之方法。
文檔編號A61P25/00GK102448474SQ201080022286
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權日2009年5月21日
發(fā)明者徐偉成, 李謝秀梅, 李鴻, 林欣榮 申請人:史坦賽特股份有限公司