可切換的親和力結(jié)合劑的制作方法

專利名稱：可切換的親和力結(jié)合劑的制作方法
可切換的親和力結(jié)合劑相關(guān)申請的交叉參考本申請是2009年2月20日提交的標(biāo)題為“可切換的親和力結(jié)合劑”的美國臨時專利申請?zhí)?1/153，990的部分繼續(xù)申請，其通過引用結(jié)合到本文中。背景本發(fā)明一般涉及在暴露于環(huán)境線索后親和力發(fā)生改變的親和力結(jié)合劑(如抗體、 肽等)。隨著生物學(xué)研究、技術(shù)和醫(yī)學(xué)的進步，對以溫和、不偏倚的形式探索和/或操作生物學(xué)方式的改進組合物和方法的需求逐漸增加。例如，新出現(xiàn)的細胞療法領(lǐng)域?qū)⒑芸煨枰宰屗鼈儽３治葱揎椇臀椿罨共l(fā)癥或無效治療的危險最小的方式積極地鑒定、純化和給予理想細胞的能力。輔助這種鑒定和純化的策略典型地依賴于特異性、高親和力抗體。 例如，DETACHaBeads (Dynal/Invitrogen)是將B和T細胞捕獲至抗體涂覆磁珠上的市售獲得產(chǎn)品。然后為了輔助給藥，通過輸入與第一抗體競爭性結(jié)合并釋放細胞的第二抗體實現(xiàn)細胞釋放。另一種產(chǎn)品，Isolex磁性細胞選擇系統(tǒng)(Magnetic Cell Selection System) (Baxter)依賴于類似路徑將⑶34+干細胞捕獲至磁珠上。但是，在這種情況下細胞游離發(fā)生在加入與珠結(jié)合的次級抗體競爭性結(jié)合的釋放肽之后。盡管已證明這些系統(tǒng)的實用性， 但是必需加入另外的試劑增加了時間、成本，并且加入的抗體或肽可能污染細胞產(chǎn)物。類似地，在篩選用于疾病診斷和治療確定的生物學(xué)樣品，以及用于生物學(xué)或防御應(yīng)用的傳感器時，靶鑒定受到使用經(jīng)典的高親和力結(jié)合劑比如抗體的限制，所述結(jié)合劑在不損傷樣品的情況下難以除去并減小或消除進一步分析的能力。因為這些局限性，所以仍有強勁的動力發(fā)展下一代平臺用于生物學(xué)鑒定和操作，它保持特異性、高親和力靶結(jié)合的功能優(yōu)越性，但能夠以允許生物學(xué)樣品完整和未修飾的方式根據(jù)指令釋放靶。簡述本發(fā)明涉及在暴露于特異性環(huán)境線索后親和力發(fā)生顯著改變的親和力結(jié)合劑 (如抗體、肽等)。在一種環(huán)境狀態(tài)下，這些結(jié)合劑證明理想靶的高親和力、高選擇性結(jié)合， 而在第二種狀態(tài)下它們對相同靶表現(xiàn)低親和力和最小的結(jié)合。這些可切換的親和力結(jié)合劑通過提供從靶的受控附著(attachment)和釋放同時保持高親和力、高選擇性結(jié)合劑-靶相互作用的優(yōu)點，比經(jīng)典親和力結(jié)合劑明顯改善。用于結(jié)合和釋放細胞的本發(fā)明試劑盒的一個實施方案包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合細胞的高親和力狀態(tài)與釋放細胞的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；其中結(jié)合劑包含親和體(affibody)、抗體、肽、其片段，或其組合中的一種或多種。用于結(jié)合和釋放靶的本發(fā)明試劑盒的一個實施方案包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；其中結(jié)合劑包含2-螺旋結(jié)合劑。靶可包含細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、核酸、肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。用于結(jié)合和釋放靶的本發(fā)明試劑盒的另一個實施方案包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān);其中結(jié)合劑包含化學(xué)上修飾的抗體或其片段。靶可選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、核酸、肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。用于結(jié)合和釋放細胞的本發(fā)明方法的一個實例，包括以下步驟使一種或多種結(jié)合劑接觸細胞，其中結(jié)合劑包含可在結(jié)合細胞的高親和力狀態(tài)與釋放細胞的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；為開關(guān)引入觸發(fā)器以引起細胞與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。觸發(fā)器可包含酸、堿、熱、光、磁場、電場、還原劑、鹽或其組合的一種或多種。結(jié)合劑可包含親和體、抗體、肽、其片段，或其組合中的一種或多種。用于結(jié)合和釋放靶的本發(fā)明方法的一個實例，包括以下步驟使一種或多種結(jié)合劑接觸靶，其中結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)，其中結(jié)合劑包含2-螺旋結(jié)合劑；為開關(guān)啟動觸發(fā)器以引起靶與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。靶可選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、核酸、 肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。觸發(fā)器可包含酸、堿、熱、光、磁場、電場、還原劑、鹽或其組合中的一種或多種。用于結(jié)合和釋放靶的本發(fā)明方法的另一個實例，包括以下步驟使一種或多種結(jié)合劑接觸靶，其中結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)，其中結(jié)合劑包含化學(xué)上修飾的抗體或其片段；為開關(guān)啟動觸發(fā)器以引起靶與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。靶可選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、 蛋白質(zhì)和核酸。觸發(fā)器包含酸、堿、熱、光、還原劑、鹽或其組合中的一種或多種。用于檢測樣品中多個靶的本發(fā)明方法的一個實例包括以下步驟將探針應(yīng)用于樣品以結(jié)合感興趣的靶，探針包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在不同親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；檢測探針；應(yīng)用外刺激使探針從感興趣的靶釋放；應(yīng)用第二探針以結(jié)合感興趣的第二靶；檢測第二探針；根據(jù)需要多次重復(fù)步驟c和d。附圖當(dāng)參考附圖閱讀下列詳細說明時，將更好地理解本發(fā)明的這些及其它特征、方面和優(yōu)點，在附圖中同樣的字符代表附圖各處同樣的元件，其中

圖1是顯示比較2-螺旋結(jié)合劑與不同類型細胞結(jié)合的實例的圖。圖2是顯示在與CSl、CS4和不可切換的Ab對照溫育后結(jié)合和釋放的SK0V3細胞百分?jǐn)?shù)的實例的圖。圖3是顯示從包含9 1比率CHO和SK0V-3細胞的混合細胞群中選擇性捕獲和釋放SK0V-3細胞的實例的圖。圖4是顯示當(dāng)CS3-PEG12-生物素/SK0V3復(fù)合物固定于Dynal鏈霉抗生物素珠時細胞的捕獲和釋放的實例的圖。圖5顯示當(dāng)暴露于不同波長的光并讓其弛豫不同時間段時SP的光切換異構(gòu)化實例。圖6是α CD34-SP軛合的UV-Vi s分析實例的圖。圖7是對固定的抗-⑶34MAb細胞捕獲的UV-Vis效果實例的圖。圖8是與α CD34結(jié)合的CTGR-標(biāo)記KGla的UV-Vis效果實例的圖。詳述為了更清楚和簡明地描述要求保護的本發(fā)明主題，為用于下列說明和本文權(quán)利要求的具體術(shù)語提供下列定義。如用于本文，術(shù)語“分子開關(guān)”指可在兩種或多種狀態(tài)之間切換的化學(xué)部分。切換可以是可逆或不可逆的。這種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換可因?qū)€別或組合給予的包括各種環(huán)境因素或配體在內(nèi)的一種或多種外刺激的反應(yīng)引起。分子開關(guān)的實例包括但不限于PH開關(guān)、光致變色、手性光學(xué)、宿主-客體開關(guān)、熱開關(guān)、磁開關(guān)或電開關(guān)。如用于本文，術(shù)語“抗體”指與另一種分子特異性結(jié)合從而限定為與另一種分子的特定空間和極性組織互補的免疫球蛋白。抗體可以是單克隆或多克隆，可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)比如宿主免疫和收集血清(多克隆)制備，或通過制備連續(xù)雜交細胞系和收集分泌的蛋白質(zhì)(單克隆)，或通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變體，至少為天然抗體的特異性結(jié)合需要的氨基酸序列編碼?？贵w可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類別和同型，比如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgGh、IgG^和IgG3、IgM。功能性抗體片段可包括能夠保持以類似全長抗體的親和力結(jié)合的抗體部分(例如Fab、Fv和F(ab' )2或？油')。 此外，在適當(dāng)情況下可使用免疫球蛋白或其片段的凝聚物、聚合物和軛合物，只要基本維持對特定分子的結(jié)合親和力。如用于本文，術(shù)語“結(jié)合劑”指可與生物學(xué)樣品中的一種或多種靶結(jié)合的分子。結(jié)合劑可與靶特異性結(jié)合。合適的結(jié)合劑可包括天然或修飾肽、蛋白質(zhì)(如抗體、親和體)、多糖(如凝集素、糖)、脂質(zhì)、酶、酶底物或抑制劑、配體、受體、抗原或半抗原中的一種或多種。 合適的結(jié)合劑可根據(jù)待分析樣品和檢測可用的靶選擇。例如，樣品中的靶可包括配體和結(jié)合劑可包括受體，或者靶可包括受體和結(jié)合劑可包括配體。類似地，靶可包括抗原和結(jié)合劑可包括抗體或抗體片段或者反之亦然。在一些實施方案中，靶可包括核酸和結(jié)合劑可包括互補核酸。在一些實施方案中，靶和結(jié)合劑都可包括能夠互相結(jié)合的蛋白質(zhì)。如用于本文，術(shù)語“生物學(xué)樣品”指從生物學(xué)主體獲得的樣品，包括在體內(nèi)或體外獲得的生物學(xué)組織或流體起源的樣品。此類樣品可以是，但不限于，從包括人在內(nèi)的哺乳動物離析的體液(如血液、血漿、血清或尿液)、器官、組織、碎片和細胞。生物學(xué)樣品還可包括包括組織在內(nèi)的生物學(xué)樣品切片(如器官或組織的橫切面部分)。生物學(xué)樣品還可包括來自生物學(xué)樣品的提取物，例如來自生物學(xué)流體(如血液或尿液)的抗原。生物學(xué)樣品可以是原核起源或真核起源(如昆蟲、原蟲、鳥、魚、爬行動物)。在一些實施方案中，生物學(xué)樣品是哺乳動物(如大鼠、小鼠、牛、狗、猴、豚鼠或家兔)的。在某些實施方案中，生物學(xué)樣品是靈長類起源(例如黑猩猩或人)。如用于本文，術(shù)語“探針”指具有結(jié)合劑和信號發(fā)生器的試劑(agent)。在一些實施方案中，探針的結(jié)合劑和信號發(fā)生器包埋在單個實體(如能夠結(jié)合靶的放射性或熒光分子)中。在替代實施方案中，結(jié)合劑和信號發(fā)生器包埋在離散實體(如能夠結(jié)合靶的初級抗體和能夠結(jié)合初級抗體的標(biāo)記次級抗體)中。當(dāng)結(jié)合劑和信號發(fā)生器是單獨的實體時， 可以在單一步驟或多個步驟中將它們應(yīng)用于生物學(xué)樣品。結(jié)合劑與結(jié)合劑的信號發(fā)生器可以直接(如經(jīng)過摻入結(jié)合劑內(nèi)的放射性標(biāo)記原子)或間接(如通過連接體，它可包括裂解位點)附著，在單一步驟中應(yīng)用于生物學(xué)樣品。 在一些實施方案中，結(jié)合劑和信號發(fā)生器是在應(yīng)用于生物學(xué)樣品之前預(yù)附著的單獨實體， 在單一步驟中應(yīng)用于生物學(xué)樣品。在其他實施方案中，結(jié)合劑和信號發(fā)生器是獨立應(yīng)用于生物學(xué)樣品并合并下列應(yīng)用的單獨實體。
如用于本文，術(shù)語“信號發(fā)生器”指能夠用一種或多種檢測技術(shù)(如光譜法、量熱法、波譜法或目測)提供可檢測的信號的分子。可檢測的信號的合適實例可包括光學(xué)信號和電信號，或放射性信號。信號發(fā)生器的實例包括發(fā)色團、熒光團、Raman-活性尾或放射性標(biāo)記中的一種或多種。如上所述，關(guān)于探針，在一些實施方案中信號發(fā)生器和結(jié)合劑可存在于單個實體(如具有熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記的靶結(jié)合蛋白)中。在其它實施方案中，結(jié)合劑和信號發(fā)生器是在引入樣品之前或之后互相關(guān)聯(lián)的離散實體(如受體蛋白和抗特定受體蛋白的標(biāo)記抗體)。如用于本文，術(shù)語“熒光團”指化學(xué)化合物，當(dāng)它暴露于特定波長的光而被激發(fā)時發(fā)射不同波長的光。熒光團可根據(jù)它們的發(fā)射譜或“顏色”描述。綠色熒光團(例如Cy3、 FITC和Oregon綠)的特征可在于它們的發(fā)射波長一般在515-540納米范圍。紅色熒光團 (例如iTexas紅、Cy5和四甲基羅丹明)的特征可在于它們的發(fā)射波長一般在590-690納米范圍。熒光團的實例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸基(isothiocyanato) 均二苯乙烯_2，2' 二磺酸、吖啶、吖啶和異硫氰酸吖啶的衍生物、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺?；?苯基]萘二甲酰亞胺_3，5 二磺酸酯 (Lucifer黃VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺、鄰氨基苯甲酰胺、Brilliant黃、 香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰紅染料；4'，6-二胺化酰亞氨基(diaminidino)-2-苯基吲哚 (DAPI)、5'，5”-二溴焦掊酚-磺酞(溴代焦掊酚紅)、7_ 二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸基苯基)4-甲基香豆素、_、4，4' -二異硫氰酸基二氫-均二苯乙烯_2，2' -二磺酸、4， 4' -二異硫氰酸基均二苯乙烯_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、伊紅、伊紅衍生物比如異硫氰酸伊紅、藻紅、藻紅衍生物比如藻紅B和異硫氰酸藻紅；乙啡啶；熒光素和衍生物比如5-羧基熒光素(FAM) ,5-(4,6- 二氯三嗪_2_基)氨基熒光素(DTAF)、2' V -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、QFITC (XRITC)；熒光胺衍生物(熒光與胺反應(yīng))；IR144 ；IR1446 ；異硫氰酸孔雀綠；4-甲基傘形酮；鄰位甲酚酞；硝基酪氨酸；副品紅；酚紅、B-藻紅蛋白；鄰苯二醛衍生物(熒光與胺反應(yīng))；芘和衍生物比如芘、丁酸芘和琥珀酰基1-芘丁酸酯；活性紅 4 (Cibacron. RTM.亮紅!3B-A)、羅丹明和衍生物比如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Miod)、羅丹明B、羅丹明123、異硫氰酸羅丹明X、 磺基羅丹明B、磺基羅丹明101和磺基羅丹明101的磺酰氯衍生物(Texas紅)；N，N, N'， N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；四甲基羅丹明、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)；核黃素；玫紅酸和鑭系元素(Iathanide)螯合物衍生物、量子點、菁藍、pyrelium染料和方酸胃(squaraines)0如用于本文，術(shù)語“固體載體”指可將分析物或結(jié)合劑固定其上的物品。結(jié)合劑或分析物可以通過物理吸附、通過共價鍵形成或通過其組合固定在固體載體上。固體載體可包括聚合物、玻璃或金屬材料。固體載體的實例包括膜、微量滴定板、珠、微流芯片、濾器、測試帶、載玻片、蓋玻片和試管。如用于本文，術(shù)語“特異性結(jié)合”指與基本較少識別其他分子相比，兩種不同分子其中一種對另一種的特異性識別。分子在其表面上或在空腔內(nèi)可具有因一種或多種靜電相互作用、氫鍵或疏水相互作用而在兩個分子之間產(chǎn)生特異性識別的區(qū)域。特異性結(jié)合實例包括但不限于抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等。在一些實施方案中，在環(huán)境條件(即PH為約6-約8和溫度為約0°C -約37°C )下結(jié)合劑分子對靶可具有不低于約IO5M-1的內(nèi)在平衡締合常數(shù)(KA)。如用于本文，術(shù)語“靶或分析物”指當(dāng)存在于樣品中時可被檢測或離析的生物學(xué)樣品或其它感興趣的樣品的組分。靶可以是其中存在天然存在的特異性結(jié)合劑(如抗體)或者可制備特異性結(jié)合劑(如小分子結(jié)合劑或適體)的任何物質(zhì)。一般來講，結(jié)合劑可通過靶的一個或多個離散化學(xué)部分或者靶的三維結(jié)構(gòu)組分(如肽折疊產(chǎn)生的3D結(jié)構(gòu))與靶結(jié)合。 靶可包括天然或修飾肽、蛋白質(zhì)(如抗體、親和體或適體)、核酸(如多核苷酸、DNA、RNA或適體)；多糖(如凝集素或糖)和脂質(zhì)中的一種或多種。靶還可包括化學(xué)或生物學(xué)試劑以及全細胞。如用于本文，術(shù)語“肽”指通過α氨基與相鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵互相連接的氨基酸序列。氨基酸可以是標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或一些其它非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。一些標(biāo)準(zhǔn)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、脯氨酸O^ro)、 苯丙氨酸(Wie)、色氨酸(Trp)和蛋氨酸(Met)。極性中性的氨基酸包括甘氨酸(Gly)、絲氨酸Ger)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。 帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)。帶負電荷 (酸性)的氨基酸包括門冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以在體內(nèi)例如通過翻譯后修飾形成，此類氨基酸的一些實例是硒代半胱氨酸和焦賴氨酸(pyrolysine)。肽可以是多種長度，采用它們的中性(不帶電荷)形式或比如其鹽的形式。肽可以沒有修飾比如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化或者包含此類修飾。序列內(nèi)氨基酸的取代基還可選自氨基酸所屬類別的其它成員。合適的肽還可包括由連接于氨基側(cè)鏈的其它取代基修飾的肽，比如糖基單元、脂質(zhì)或無機離子比如磷酸根以及鏈的化學(xué)修飾。因此，術(shù)語“肽”或其等同物可打算包括經(jīng)過上述修飾后不破壞其功能性的參考的適當(dāng)氨基酸序列。如用于本文，術(shù)語“核苷酸”指天然和修飾的磷酸核苷。術(shù)語“核苷”指在1 ‘位或在與糖或糖取代基(如碳環(huán)或非環(huán)部分)的等同位置連接有嘌呤、脫氮嘌呤(deazapurine)、 嘧啶或修飾堿基的化合物。核苷可含有糖或糖取代基的2'-脫氧基、2'-羥基或2'， 3' - 二脫氧基形式以及其它取代形式。磷酸核苷中的糖部分可以是戊糖，比如核糖，磷酸酯化位點可對應(yīng)于連接于核苷戊糖C-5位的羥基。核苷酸可以是，但不限于，三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)。三磷酸脫氧核糖核苷可以是，但不限于，三磷酸脫氧核糖腺苷O'-脫氧腺苷5'-三磷酸酯或dATP)、三磷酸脫氧核糖胞苷O'-脫氧胞嘧啶5'-三磷酸酯或 dCTP)、三磷酸脫氧核糖鳥苷O'-脫氧鳥苷5'-三磷酸酯或dGTP)或三磷酸脫氧核糖胸苷O ‘-脫氧胸腺嘧啶5 ‘-三磷酸酯或dTTP)。術(shù)語“寡核苷酸”用于本文指核苷酸或其衍生物的寡聚物。通用于說明書中，每當(dāng)用字母序列代表寡核苷酸時，核苷酸從左至右是5' -3'順序。在字母序列中，字母A表示腺苷，C表示胞苷，G表示鳥苷，T表示胸苷，W表示A或T，S表示G或C。N代表隨機的核酸堿基(如N可以是A、C、G、U或T中任何一種)。合成的、閉鎖的、隨機的核苷酸用+N代表，硫代磷酸酯修飾的隨機核苷酸用*N代表?！昂怂帷被颉肮押塑账帷庇糜诒疚目梢允荄NA或RNA，或其類似物(如硫代磷酸酯類似物)。核酸或寡核苷酸還可包括修飾的堿基、主鏈和/或末端。合成主鏈的非限制性實例包括硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、磷酸硼烷、氨基磷酸鹽、肽核酸、嗎啉代、閉鎖核酸、木糖核酸或其參看核酸的穩(wěn)定性和/或其它優(yōu)點的類似物。如用于本文，術(shù)語細胞指真核和原核細胞，包括各種組織或器官、成熟、不成熟、原始或干細胞衍生的細胞。術(shù)語還包括在實驗室操作以通過標(biāo)記、遺傳工程或本領(lǐng)域已知的任何其它手段摻入一種或多種理想特性的細胞。術(shù)語“干細胞”包括但不限于胚胎干細胞、成人干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞、癌干細胞、通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的干細胞。干細胞可從血液、骨髓、脂肪或其它組織和器官離析。術(shù)語“感興趣的分子”或“分析物”可互換使用。在一些實施方案中，感興趣的分子可通過樣品需要的分析或分離的類型和性質(zhì)確定。在一些實施方案中，分析可提供關(guān)于樣品中感興趣分子的存在或不存在的信息。在另一個實施方案中，分析可提供關(guān)于樣品狀態(tài)的信息。例如，如果樣品包括飲用水樣品，則分析可提供關(guān)于樣品中細菌濃度的信息從而提供樣品的可飲用性。類似地，如果樣品包括組織樣品，則本文公開的方法可用于檢測感興趣的分子，可幫助比較不同類型的細胞或組織，比較不同的發(fā)展階段，檢測疾病或異常的存在，確定疾病異常的類型或者研究感興趣的多種分子之間的相互作用。在一個實施方案中，可通過分子設(shè)計并將環(huán)境敏感元件直接摻入結(jié)合劑的分子主鏈內(nèi)發(fā)展可切換的親和力結(jié)合劑。這使結(jié)合劑平臺成為可能，其中對一組環(huán)境改變反應(yīng)性呈現(xiàn)一致性分子改變(立體重排、電荷等)的特異性元件是保守的，而形成結(jié)合/靶識別袋的其它分子元件可改變。這樣可將可切換的結(jié)合劑支架修飾以識別不同靶，同時保持對特異性環(huán)境改變的敏感性。這種路徑因為可切換主鏈元件的保守而呈現(xiàn)改善的釋放機制和大小一致性，但通過限制允許改變的親和力序列的數(shù)目和位置增加發(fā)展抗理想靶的高親和力結(jié)合劑的難度。在另一個實施方案中，可通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的任何技術(shù)選擇或設(shè)計抗感興趣的特異性靶的不可切換的結(jié)合劑，然后經(jīng)過附著環(huán)境敏感性部分將所得結(jié)合劑在化學(xué)上修飾以產(chǎn)生環(huán)境應(yīng)答性可切換的結(jié)合劑，制備可切換的親和力結(jié)合劑。本實施方案允許在設(shè)計和選擇親和力結(jié)合劑時增加柔性，因為一個靶與下一個之間支架部分不必保守，只要存在足夠的化學(xué)操控性以允許后續(xù)修飾。但是，這種在支架主鏈中的相同柔性規(guī)定抗不同靶的結(jié)合劑(或甚至抗相同靶的不同結(jié)合劑)將對修飾呈現(xiàn)不同的敏感性，因此基于分子開關(guān)修飾的效率、位置等對理想環(huán)境線索將經(jīng)常證明不同的敏感性水平。雖然制備方法可根據(jù)所用結(jié)合劑支架和發(fā)展方法而變化，但可通過選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境開關(guān)將本發(fā)明應(yīng)用于多種親和力結(jié)合劑?？赡艿挠H和力結(jié)合劑的非窮盡名單包括抗體、 抗體片段、親和體和肽基結(jié)合劑。這些親和力支架各自呈現(xiàn)不同的優(yōu)點和缺點，根據(jù)預(yù)期應(yīng)用而變化，在文獻中已詳盡綜述。用于一個或多個實施方案的目的時，只要所選親和力結(jié)合劑能夠直接或間接加入環(huán)境敏感性分子開關(guān)，則讓使用者判定確切的選擇。用于一個或多個實施方案的目的時，分子或環(huán)境開關(guān)定義為整合或附屬于結(jié)合劑的化學(xué)部分，對外刺激的反應(yīng)是經(jīng)歷不同的物理改變(如構(gòu)象位移、電改變、Pi改變等)。通過修飾選擇的分子開關(guān)可以發(fā)展對多種環(huán)境線索和多種刺激強度敏感的可切換的結(jié)合劑。 這些環(huán)境刺激可包括但不限于溫度、PH、鹽/離子濃度、暴露于特定波長的光、引入化學(xué)化合物等。除了摻入單一類型開關(guān)和使用單一刺激以外，對相同結(jié)合劑使用多種類型開關(guān)和 /或應(yīng)用多種刺激是可行的。
通過小心地選擇，可以進一步鑒定對適度刺激改變和強度反應(yīng)以便切換前和切換后環(huán)境條件都適應(yīng)于生物學(xué)樣品比如核酸、蛋白質(zhì)、細胞、組織和動物的這些開關(guān)的亞類。 這使它們能夠用于原位、計算機生物模擬(in silico)、體外和體內(nèi)應(yīng)用，沒有使靶損傷或修飾的危險，允許它們用于此類任務(wù)比如生物學(xué)分離、靶標(biāo)記和造影、多路分析和傳感器。 可能的分子開關(guān)及其關(guān)聯(lián)優(yōu)點和缺點已在文獻中廣泛討論。用于一個或多個實施方案的目的時，可利用這些中的任何一種，只要可以設(shè)計將它們直接整合入所選親和力結(jié)合劑的主鏈內(nèi)或間接使其附屬于結(jié)合劑的手段，而不明顯破壞親和力結(jié)合劑識別理想靶的能力。當(dāng)構(gòu)建時，無論利用何種制備方法，所得可切換的親和力結(jié)合劑在一種環(huán)境條件下對其靶呈現(xiàn)能夠高選擇性、高特異性結(jié)合的初始親和力，但在第二種環(huán)境條件下證明結(jié)合親和力大幅下降。這種結(jié)合親和力的下降足夠充分，以便可通過溫和的洗滌步驟將結(jié)合劑從其靶除去，讓樣品處于未修飾、分析前狀態(tài)。此類可切換的親和力結(jié)合劑可用于不抑制修飾的親和力結(jié)合劑的初始靶結(jié)合或后續(xù)靶釋放的任何格式。例如，溶液基或固體-固定狀態(tài)。這包括但不限于使溶液中利用的染料-親和力結(jié)合劑配體直接軛合，比如用于熒光活化細胞分選、活或固定細胞染色，和組織樣品染色，以及在固體表面上固定，比如顯微鏡載玻片、磁或?qū)游鲋?、流室表面、傳感器陣列等。這種柔性允許可切換的親和力結(jié)合劑用于各種應(yīng)用，包括但不限于細胞和組織分析、細胞和蛋白質(zhì)分離、可更新的傳感器等。在一些實施方案中，靶包含但不限于一種或多種生物學(xué)細胞。例如，細胞可包括原核和真核起源。真核細胞可以是任何分類，包括但不限于昆蟲、兩棲動物、禽類、哺乳動物和人。合適的人細胞包括臨床上有關(guān)如來自內(nèi)胚層、外胚層和中胚層的細胞，比如干細胞、癌細胞和血細胞。在一些實施方案中，靶包含但不限于一種或多種生物學(xué)試劑。例如，生物學(xué)試劑可包含病原體、毒素或其組合。生物學(xué)試劑可包括阮病毒、微生物(病毒、細菌和真菌)和一些單細胞和多細胞真核生物(例如寄生蟲)及其關(guān)聯(lián)毒素。病原體是可引起其宿主(動物或植物)疾病或生病的感染物。病原體可包括細菌、病毒、原蟲、真菌、寄生蟲或阮病毒中的一種或多種。在一些實施方案中，分離包含但不限于從天然來源或?qū)嶒炇抑苽涞纳飳W(xué)樣品離析蛋白質(zhì)、抗體或其它生物學(xué)試劑。實例包括但不限于治療蛋白比如胰島素、治療或診斷抗體、疫苗、酶或激素。
實施例用于實施例部分的縮寫擴展如下:“min，，分鐘；“h” 小時；“S” 秒；“rt”室溫；“mg，，毫克；“mL，，毫升；“mg/mL，，毫克每毫升；"mmol"；毫摩爾；"μ L” 微升；"KDa" 千道爾頓；“MALDI-T0F-MS”基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；“HPLC” 高效液相色譜；"(LC-MS) ” 液相色譜質(zhì)譜；“ESI-MS” 電噴射電離質(zhì)譜；“TFA” 三氟乙酸；“HOAc” 乙酸；“DMS0” 二甲基亞砜；“DMF” 二甲基甲酰胺；“DVB” 二乙烯基苯；“DTT” 二硫蘇糖醇； “NMM” =N-甲基嗎啉；“HC1” 鹽酸；“MeCN” 乙腈；“NHS，，:N_羥基琥珀酰亞氨基；“PBS” 磷酸鹽緩沖鹽水；“SP”:l-(-羧基乙基)-3，3- 二甲基-6，-硝基螺(二氫吲哚-2,2' -2H-苯并吡喃)；“MWC0 分子量篩截；“FmoC”:9-芴基甲基氨基甲酸酯；“HBTU”:鄰-苯并三唑-N，N,N' N，-四甲基脲每 1六氟磷酸鹽；“ TIPS”:三異丙基硅烷；“EDT”:乙二硫醇；“Rink酰胺樹脂LS”:442' ,4' - 二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基樹脂，100-200目。除非另外提出，否則使用的所有試劑級化學(xué)品都是原樣使用，Millipore水用于制備所有水溶液。
實施例1牛物素-CSl的制備用0. 2mmol/g 取代 Rink Amide Resin LS 以 40-100 μ mol 規(guī)模與 N- α -Fmoc-保護的氨基酸，用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)合成線性肽(生物素-GSGSCNKEMRNRYWEAALDPNLNNQQKRAKIRS IYDDPC)。用 Symphony 肽合成儀(Protein Technologies Inc.)合成肽。使樹脂在二氯甲烷中膨脹1小時，接著用DMF洗滌30分鐘，此時交換二氯甲烷。每次偶聯(lián)反應(yīng)都在室溫下進行，用HBTU作為偶聯(lián)劑和NMM作為堿。對于每一步，以相對于估計的樹脂容量為5當(dāng)量的規(guī)模各自遞送偶聯(lián)劑和氨基酸。除了殘基2-5以外大多數(shù)殘基都進行雙偶聯(lián)。單偶聯(lián)的偶聯(lián)時間是30分鐘(首次偶聯(lián)為40分鐘)，雙偶聯(lián)為2X20分鐘。反應(yīng)不擾亂氨基酸的側(cè)鏈，將側(cè)鏈用對酸敏感的基團保護，或者在半胱氨酸的情況下，使用酸和堿穩(wěn)定的乙酰氨基甲基(Acm)保護。在每次偶聯(lián)反應(yīng)后，將N-端Fmoc-保護的胺通過在室溫下用20%哌啶在 DMF中15分鐘脫保護。在最終的氨基酸偶聯(lián)和N-端Fmoc保護基團脫保護后，用與其它氨基酸殘基所用相同程序使生物素軛合。然后將固體載體用DMF洗滌6次，用DCM洗滌6次， 通過使氮氣穿過反應(yīng)器干燥50分鐘。裂解和脫保護通過將載體用每IOOmg原料樹脂(在肽合成開始時)1. 2mL比率為94 2. 5 2. 5 1的TFA EDT 水TIPS混合物攪動約2-2. 5小時，使肽從載體裂解和側(cè)鏈脫保護(除了半胱氨酸以外)。通過玻璃絨過濾混合物，用2X0. 5mL TFA洗滌樹脂。將濾液和洗滌液在固體干冰中冷卻，用冷的乙醚( 10-15ml/ml濾液)稀釋。將懸浮液在4°C以3000rcf離心10分鐘。傾析上清液，使殘留物再懸浮于冷的乙醚( 20ml) 中，將離心和傾析的過程重復(fù)3次。使最后的殘留物溶于水中并凍干。以上過程關(guān)于每種肽的偏差，和進一步的細節(jié)，在下文描述。氧化(環(huán)化使粗線性肽(6mg)溶于anL 50% HOAc中。將溶液用18mL IN HCl 稀釋。向該溶液內(nèi)加入M4. 4μ L碘溶液(0. 1Μ，通過使1體積IN(0. 5Μ) I2溶液與4體積 50% HOAc混合制備)，將混合物攪拌90分鐘。通過滴加IM硫代硫酸鈉溶液猝滅反應(yīng)物， 直至沒有顏色殘留。將所得混合物通過反相HPLC在AKTA凈化器上純化，使用以下方法 0-25% B 6. 875CV(柱體積)，25-35%B 41. 25CV 和 35-100% Bi. 875CV，柱Xterra MS C18 19X100mm，5ym 粒度，流速10ml/min，緩沖液=A,0. 1% TFA 在水中，B,0. 1% TFA 在乙腈 (ACN)中。當(dāng)主峰開始洗脫時，手工收集流分。通過分析HPLC發(fā)現(xiàn)單一流分是純的，將其凍干。MS (單同位素質(zhì)量)計算值4763. 2，實測值4763. 8。實施例2牛物素-CS2的制備
N—GSGSCNKEMRNRYWEAALDPNLNNQQKRAKIRSIYDDP
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)合和釋放細胞的試劑盒，所述試劑盒包含，結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合細胞的高親和力狀態(tài)與釋放細胞的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；其中所述結(jié)合劑包含親和體、抗體、肽、其片段，或其組合中的一種或多種。
2.一種用于結(jié)合和釋放靶的試劑盒，所述試劑盒包含，結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；其中所述結(jié)合劑包含2-螺旋結(jié)合劑。
3.權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述靶是細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、 核酸、肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。
4.一種用于結(jié)合和釋放靶的試劑盒，所述試劑盒包含，結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；其中所述結(jié)合劑包含化學(xué)修飾的抗體或其片段。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述靶選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、核酸、肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。
6.一種用于結(jié)合和釋放細胞的方法，所述方法包括，使一種或多種結(jié)合劑接觸細胞，其中所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合細胞的高親和力狀態(tài)與釋放細胞的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)；和為所述開關(guān)引入觸發(fā)器，以引起細胞與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述觸發(fā)器包含酸、堿、熱、光、磁場、電場、還原劑、鹽或其組合中的一種或多種。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述結(jié)合劑包含親和體、抗體、肽、其片段，或其組合中的一種或多種。
9.一種用于結(jié)合和釋放靶的方法，所述方法包括，使一種或多種結(jié)合劑接觸靶，其中所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)，其中所述結(jié)合劑包含2-螺旋結(jié)合劑； 和為所述開關(guān)引入觸發(fā)器，以引起靶與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述靶選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)、 核酸、肽、脂質(zhì)、多糖，或其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述觸發(fā)器包含酸、堿、熱、光、磁場、電場、還原劑、鹽或其組合中的一種或多種。
12.一種用于結(jié)合和釋放靶的方法，所述方法包括，使一種或多種結(jié)合劑接觸靶，其中所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)，其中所述結(jié)合劑包含化學(xué)修飾抗體或其片段；為所述開關(guān)引入觸發(fā)器，以引起靶與結(jié)合劑結(jié)合或從結(jié)合劑釋放。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述靶選自細胞、病原體、病毒、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)和核酸。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述觸發(fā)器包含酸、堿、熱、光、還原劑、鹽或其組合中的一種或多種。
15. 一種檢測樣品中多個靶的方法，所述方法包括以下步驟將探針應(yīng)用于樣品以結(jié)合感興趣的靶，所述探針包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在不同親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)； 檢測探針；應(yīng)用外刺激使探針從感興趣的靶釋放； 應(yīng)用第二探針以結(jié)合感興趣的第二靶； 檢測第二探針；和根據(jù)需要多次重復(fù)步驟c和d。
全文摘要
用于結(jié)合和釋放生物學(xué)靶的方法和試劑盒，所述試劑盒包含結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含可在結(jié)合靶的高親和力狀態(tài)與釋放靶的低親和力狀態(tài)之間切換的環(huán)境反應(yīng)性分子開關(guān)。
文檔編號A61K47/48GK102405278SQ201080018138
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者A·杜爾加-塔洛奇, A·蘇德, E·R·羅欣, E·W·科瓦茨 申請人:通用電氣公司