專利名稱：含有Exendin-4的融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與糖尿病相關(guān)的藥物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有延長的胰升血糖素樣肽類的體內(nèi)半衰期的融合蛋白。本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法以及其在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種遺傳因素和多種環(huán)境因素相關(guān)聯(lián)的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合癥。由于糖尿病還伴隨著諸多并發(fā)癥，現(xiàn)已成為僅次于惡性腫瘤和心血管疾病之后的第三大健康殺手。1984年，胰升血糖素肽-1 (GLP-I)類藥物被發(fā)現(xiàn)，它是一種具有30個氨基酸的腸降血糖素。然而GLP-I作為降血糖藥物在應(yīng)用上受到了限制，其主要原因是GLP-I 的體內(nèi)半衰期僅為3-5分鐘。Exendin-4是一條39個氨基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的氨基酸殘基與哺乳動物GLP-I序列有52%的同源性，其與GLP-I的最大不同之處在于N端第2位的甘氨酸耐血液中二肽基肽酶(DPP-IV)的酶切作用，而GLP-I的相同位置則為極易被DPP-IV切斷的丙氨酸，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期較長(tl/2 = 2. 4小時)。Exendin-4是一種強(qiáng)效GLP-I受體激動劑，能模擬GLP-I這種內(nèi)源性多肽的糖調(diào)控作用，降低空腹和餐后血糖。Exendin-4的活性主要通過與人體胰臟GLP-I受體結(jié)合而介導(dǎo)，由環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴和β細(xì)胞分化機(jī)制引發(fā)葡萄糖依賴的胰島素合成和分泌。 因為Exendin-4的氨基酸結(jié)構(gòu)及生物活性與GLP-I均具有相關(guān)性，故通常它也被視為腸促胰島素的一種。由于Exendin-4的降糖作用時間較GLP-I長，延緩胃排空和抑制攝食沖動對肥胖病人體重的有益作用又有別于傳統(tǒng)的降糖藥物，因此其在作為2型糖尿病治療藥物開發(fā)方面具有巨大的潛力。隨著Exendin-4結(jié)構(gòu)為活性單體的藥物(英文通用名為Exenatide，中文名為艾塞那肽，由Lily公司生產(chǎn))于2005年在美國上市，Exendin-4作為GLP-I家族中的一員在治療糖尿病方面引起廣泛的關(guān)注。但是，現(xiàn)在上市的Exendin-4藥物依然存在著半衰期短的問題，藥用的Exenatide 為每日注射兩次，極大地增加的患者的痛苦。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種融合蛋白，該融合蛋白具有GLP-I或其類似物 Exendin-4的活性，并且在體內(nèi)的存留時間長，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中GLP-I或Exendin-4需要每天多次注射給藥的缺陷。本發(fā)明的另一目的是提供編碼該融合蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的重組載體以及包含該重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一個目的是提供制備該融合蛋白的方法。本發(fā)明的又一個目的是提供該融合蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的還一個目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含所述融合蛋白有效成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
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用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4(I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自人血清白蛋白(HSA)或IgG的Fc片段。優(yōu)選地，所述人源蛋白為HSA。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的核酸序列，包含該核酸序列的重組載體，以及包含該重組載體的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供一種上述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括在表達(dá)可檢測量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯上述核酸序列的步驟。具體來說，上述融合蛋白的制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建所述融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟2、的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。又一方面，本發(fā)明提供了上述的融合蛋白、核酸序列、重組載體或宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。優(yōu)選地，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑?，F(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的目的對本發(fā)明逐一加以描述。本發(fā)明的通式I的融合蛋白如下述所示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4通式I其中，連接肽優(yōu)選為含有5個氨基酸殘基的肽鏈，序列為GGGGS (SEQ IDNO 5)；Exendin-4 氨基酸序列(SEQ ID NO 6)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS人源蛋白為人血清白蛋白或IgG Fc部分。本發(fā)明的通式I的Exendin-4融合蛋白是通過下述方法制備的構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA 本發(fā)明中的融合蛋白可以從各種來源獲得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如這些蛋白可以從由表達(dá)野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的組織或細(xì)胞的cDNA文庫獲得。本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法對相關(guān)的融合蛋白的mRNA進(jìn)行篩選，通過公開的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列設(shè)計引物。 本發(fā)明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)優(yōu)選來源于天然人序列，以減少融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性危險。本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開序列設(shè)計PCR引物，從人血RNA中釣取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通過標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。
構(gòu)津本發(fā)明中Exendin-4融合蛋白載體利用本領(lǐng)域常規(guī)的PCR突變技術(shù)制備連接有連接短肽的Exendin-4用以與蛋白表達(dá)質(zhì)粒的連接。連接技術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明利用PCR將含有連接肽的Exendin-4 與蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過T4連接酶進(jìn)行連接，得到本發(fā)明中所有融合蛋白的表達(dá)載體。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來轉(zhuǎn)染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。隨汰本劍月_輔_一細(xì)去用本發(fā)明中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，用于表達(dá)融合蛋白。參考本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)化本發(fā)明中各種融合蛋白的表達(dá)，用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的原則、技術(shù)(例如培養(yǎng)基、溫度、PH 等)可以參見 Mammalian CellBiotechnology :A Practical Approach, Μ. Butler。本發(fā)明中的Exendin-4融合蛋白的表達(dá)采用本領(lǐng)域常規(guī)的Iac啟動子大腸桿菌融合蛋白表達(dá)技術(shù)，使用IPTG啟動Exendin-4融合蛋白的產(chǎn)生。本發(fā)明融合蛋白的純化:一旦本發(fā)明的融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分離和純化技術(shù)對本發(fā)明中的融合蛋白進(jìn)行純化。例如根據(jù)融合蛋白表達(dá)載體內(nèi)的標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白的粗提純。本發(fā)明中，純化后的融合蛋白可以通過超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋白經(jīng)過紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。本發(fā)明的融合蛋白的表征本發(fā)明中，可以用許多方法表征本發(fā)明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色偶聯(lián)的SDS-PAGE或免疫印跡技術(shù)。本發(fā)明中的融合蛋白通過免疫印跡的鑒定，例如使用Exendin-4的抗體。本發(fā)明的組合物本發(fā)明的Exendin-4融合蛋白，可以與一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料共同制成藥物組合物，這些輔料包括水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等。該藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內(nèi)、皮下等注射途經(jīng)給藥，優(yōu)選的劑型為凍干或溶液注射劑；本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一種或幾種的組合；PH調(diào)節(jié)劑包括枸櫞酸、磷酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨，碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銨鹽，碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無機(jī)酸和堿及鹽等一種或幾種的組合；穩(wěn)定劑包括EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。滲透壓調(diào)節(jié)劑包括氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。本發(fā)明提供包含所述融合蛋白的注射制劑，所述注射制劑的制備可以示范性參考以下步驟(1)凍干劑
取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得。(2)溶液注射液取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得。本發(fā)明的Exendin-4融合蛋白具有更長的體內(nèi)存留時間，可作為有效成分制備糖尿病治療藥物。其在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的，劑量可由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定， 這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、對藥物的個體反應(yīng)，癥狀的嚴(yán)重程度等。一般來說，本發(fā)明活性成分的有效量lX10_7-20mg/kg/天，可以單劑量給藥或分劑量給藥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的存留時間較長，避免了同類產(chǎn)品在用于治療時需要每天多次注射給藥的缺陷，便于臨床應(yīng)用。2、本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選來源于人的天然序列，減少了融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性風(fēng)險。3、本發(fā)明的融合蛋白可以通過濃縮至藥用濃度，作為藥物有效成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體等組分制備成藥用組合物，用于糖尿病及肥胖癥等疾病和相關(guān)病癥或疾病的治療中。
以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施例，其中圖1顯示了融合蛋白免疫印跡結(jié)果，其中1為融合蛋白的Exendin-4免疫印跡，2 為本發(fā)明的融合蛋白的HSA免疫印跡；圖2顯示了本發(fā)明的融合蛋白的降血糖功能圖3顯示了本發(fā)明的融合蛋白的克隆載體構(gòu)建圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實施例1 人血清白蛋白編碼DNA的構(gòu)建本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開序列設(shè)計PCR引物(SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2)，從人血RNA中釣取人血清白蛋白的mRNA。在進(jìn)行人血清白蛋白mRNA逆轉(zhuǎn)錄實驗中，設(shè)計PCR引物使人血清白蛋白的編碼DNA末端含有適合與載體連接的酶切位點 (KpnI-HSA-NotI)。通過標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。
SEQ ID NO 1 :5TTATA GGT ACCAAG TGG GTA ACC TTT ATT TCCCTT3SEQ ID NO 2 :5AATTAT GCG GCC GCTAA GCC TAA GGC AGC TTGACT3將PCR產(chǎn)物進(jìn)行KpnI/NotI雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行純化以去除內(nèi)切酶。實施例2 :“Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-” 編碼 DNA 的構(gòu)津本專利采用全基因合成方法制備編碼“Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exen din-4-GGGGS-”的雙鏈DNA，基因序列為SEQID NO 3。本實施例中合成的編碼DNA具有以下特征1、5’端具有NdeI酶切位點，其用于與表達(dá)載體pETMb連接；2、3’端具有KpnI酶切酶切位點，其用于與HSA的5’端連接。SEQ ID NO 3 5TATATCATATGCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAAC GGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCGGTACCATATT3將產(chǎn)物進(jìn)行(Ndel/Kpnl)雙酶切，并進(jìn)行純化。純化后的DNA與實例例1中的 HSA (KpnI/NotI酶切后)利用！"4連接酶進(jìn)行連接，由此構(gòu)建Exendin-4-GGGGS-Exendin_4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA 完畢。實施例3 :“-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4” 編碼 DNA 的構(gòu)建本專利采用全基因合成方法制備編碼“-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGG GS-Exendin-4”的雙鏈DNA，基因序列為SEQ ID NO 4。本實施例中合成的編碼DNA具有以下特征1、5’端具有NotI酶切位點，其用于與HSA的3’端連接端；2、3’具有BamHI酶切位點，其用于與表達(dá)載體PETMb連接。SEQ ID NO 4 5TAATTTAGCGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGTAATAAGGATCCATTGATT3將產(chǎn)物進(jìn)行(Notl/BamHI)雙酶切，并進(jìn)行純化。純化后的DNA與實施例2中的E
7xendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA 利用 T4 連接酶進(jìn)行連接。由此 “Exendin-4-GGG-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4” 構(gòu)建完畢。t施例4 構(gòu)律本發(fā)明中Exendin-4融合蛋白表汰裁體及融合蛋白的鈍化將表達(dá)質(zhì)粒pETMb進(jìn)行雙酶切(Ndel/BamHI)，然后與實施例4中的產(chǎn)物通過 Ndel/BamHI酶切位點進(jìn)行連接。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來傳染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。將構(gòu)建完畢的 pETMb [Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4GGGGS-HSA-GGGGS-Exe ndin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4](命名為 pET15b6Exendin_4HSA，示意圖見圖 3)以熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，熱擊轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。將轉(zhuǎn)化后的融合蛋白表達(dá)載體在含有氨芐青霉素抗生素的LB培養(yǎng)平皿上培養(yǎng)篩選具有氨芐青霉素抗性的細(xì)胞。將得到的具有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒提取及純化，質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定完全正確。將過夜的菌液1 100比例以LB新鮮培養(yǎng)基稀釋，37°C培養(yǎng)菌液直至0D600達(dá)到 0.6，使用IPTG啟動融合蛋白的表達(dá)，并將體系溫度降至25°C。融合蛋白表達(dá)16小時后，將菌液離心，收集后，超聲波破碎菌體，操作程序為dOcycles，15秒/cycle。將破碎后的菌液高速離心，上清液被注入鎳柱。用鎳柱捕獲含6XHIS標(biāo)簽的融合蛋白，并利用咪唑的濃度梯度對融合蛋白進(jìn)行洗脫。將洗脫的蛋白收集，利用具有IOkDa半透膜的離心管對收集的蛋白進(jìn)行透析及濃縮。凝血酶處理純化后的融合蛋白用來切除N末端的6XHIS標(biāo)簽，凝血酶的酶切技術(shù)參考hvitrogen公司的實驗手冊。利用GelFiltration S-200蛋白純化柱進(jìn)行反應(yīng)混合物的分離，同時對目標(biāo)融合蛋白進(jìn)行精純。上述純化后的融合蛋白經(jīng)IOK過濾膜過濾濃縮后，紫外線滅菌處理。實施例5 :Exendin-4融合蛋白的免疫印跡鑒定用含1 % SDS和2mg溴酚藍(lán)的PBS稀釋純化后的融合蛋白。煮沸變性后，取20 μ 1 樣品置SDS-PAGA膠上，電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉溫室封閉2小時，加入鼠抗人Exendin-4的單抗(SantaCruz，USA)室溫下孵育1小時，然后用HRP標(biāo)記的兔抗鼠的多抗進(jìn)行二抗結(jié)合，用ECL試劑盒發(fā)光顯色(Amersham Pharmacia Biotech，USA)。 結(jié)果如圖1所示本發(fā)明的融合蛋白得到了較好的表達(dá)。^mm 6 ^m^^mm^m^mmm^取實施例5的融合蛋白10mg，穩(wěn)定劑精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置于容器中，加注射用水80ml，攪拌使溶解，再加入甘露醇Sg、山梨醇2g，攪拌使溶解，以0. lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 0-8. 0，補加水至100ml。加入0. 3g活性碳，在10-25°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支Iml進(jìn)行分裝。預(yù)凍2小時后，冷凍下減壓干燥18小時，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格IOOug/支。 ^mm τ ^m^^mm^m^mmm^ 取實施例5的融合蛋白25mg，加穩(wěn)定劑磷酸氫二鉀0. 05g，氯化鈉0. 9g，置于容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g攪拌使溶解，用0. lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 5-8. 5，補加水至100ml，加入0. 25g活性碳，在10_2(TC下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支2ml進(jìn)行分裝，預(yù)凍2小時后，冷凍下減壓干燥15 小時，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格500ug/支。實施例8 含融合蛋白的藥物組合物溶液制劑的制備取實施例5的融合蛋白50mg，加入穩(wěn)定劑三羥甲基氨基甲烷0.2g，焦亞硫酸鈉 0. lg、氯化鈉0. 9g至容器中，加注射用水80ml中攪拌溶解，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH為6_8，補加水至100ml，加入0. 2g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過濾除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，規(guī)格IOOOug/支。實施例9 含融合蛋白的藥物組合物溶液制劑的制備取實施例5的融合蛋白5mg，穩(wěn)定劑谷氨酸O.Olg、氯化鉀0.09g至容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖Ig攪拌溶解。加氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為7. 0-8. 5， 補加水至100ml，加入0. 05g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過濾除菌，以每支Iml灌封、即得融合蛋白注射液，規(guī)格50ug/支。實施例10 融合蛋白的體內(nèi)藥代動力學(xué)給大鼠注射Exendin-4及其融合蛋白(折合含Exendin-4為0. 5mg/kg)，分別于注射前及注射后0. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時后于眼叢靜脈取血約0. ^il,制備血清備用。Exendin-4濃度測定方法采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測小鼠血清中融合蛋白的濃度，操作如下4°C離心分離血漿。用羊抗鼠的Exendin-4濃度測定試劑盒(R&D System Co.，Ltd)對鼠血漿中的Exendin-4融合蛋白的濃度進(jìn)行測定。將1 1稀釋后的鼠血漿樣品加入96孔板，加入同體積的Exendin-4抗體后，37°C孵育1小時。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP后孵育30分鐘。同樣的方法對96孔板進(jìn)行清洗，然后加入50 μ 1 底物A及底物B，37°C孵育10分鐘。用硫酸中止反應(yīng)后測定450-570nm值，并與標(biāo)準(zhǔn)濃度的 Exendin-4進(jìn)行比對及根據(jù)ELISA結(jié)果計算藥代動力學(xué)參數(shù)。融合蛋白的體內(nèi)藥代動力學(xué)結(jié)果見表1，結(jié)果顯示本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的半衰期較單獨的Exendin-4明顯延長，具有長效特性。表1融合蛋白在大鼠體內(nèi)的末相半衰期
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin_4-連接肽-Exendin_4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4 (I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源蛋白為HSA。
3.編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列。
4.包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸序列的重組載體。
5.包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括在表達(dá)可檢測量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求3所述的核酸序列的步驟。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟幻的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、權(quán)利要求3所述的核酸序列、權(quán)利要求4所述的重組載體或權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的Exendin-4融合蛋白，所述融合蛋白由通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4(I)其中，連接肽為GGGGS；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。本Exendin-4融合蛋白能夠有效增加Exendin-4的血液半衰期，克服其因為半衰期短而無法在臨床上使用的現(xiàn)狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領(lǐng)域較有應(yīng)用前景。本發(fā)明還公開了所述融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
文檔編號A61K38/22GK102453094SQ20101052643
公開日2012年5月16日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者付剛, 劉鵬, 徐為人, 湯立達(dá), 王玉麗, 鄭學(xué)敏, 龔珉 申請人:天津藥物研究院