一種板層組織工程角膜支架及其制作方法與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種板層組織工程角膜支架及其制作方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)的板層組織工程角膜支架，尤其是涉及一種用于治療角 膜外傷、腫瘤、化學(xué)燒傷(堿燒傷)、血管化嚴(yán)重干眼癥、角膜緣干細(xì)胞缺乏、免疫性疾病如 Stevens-Johnson綜合征(SJS)、眼部類天皰瘡、單純皰疹病毒性角膜白斑、角膜移植排斥 反應(yīng)等致盲性眼病的板層角膜組織工程材料及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，每年因角膜潰 瘍、眼外傷等造成的新增角膜盲為150萬至200萬，兒童盲的主要病因是麻疹導(dǎo)致的角膜 白斑。治療角膜盲的唯一有效方法是角膜移植術(shù)。但是由于宗教信仰、風(fēng)俗習(xí)慣的影響， 身故后捐獻(xiàn)角膜者甚少；加上人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒 可以通過植片傳播、角膜屈光手術(shù)、人口老齡化等原因使角膜供體材料嚴(yán)重不足，極大地限 制了角膜盲患者脫盲。隨著人們對視覺質(zhì)量要求的日益提高，角膜移植技術(shù)也得到不斷改 進(jìn)和更新，而目前供體來源不足、免疫排斥反應(yīng)、角膜移植并發(fā)癥等又限制了此項技術(shù)的 開展。隨著角膜外傷、腫瘤、化學(xué)燒傷(堿燒傷)、血管化嚴(yán)重干眼癥、角膜緣干細(xì)胞缺乏、 免疫性疾病、角膜移植排斥反應(yīng)等患者人數(shù)的增多，角膜材料的來源也就成為目前眼科醫(yī) 生存在的一個棘手的問題。如何高質(zhì)量長時間維持板層角膜替代物在眼內(nèi)的功能，尋找一 種能達(dá)到理想狀態(tài)的角膜替代物也就成了當(dāng)前眼科界研究的一個熱點。然而，目前國內(nèi)外 研制的各種種子細(xì)胞支架材料在角膜曲率及地形圖，生物相容性，強(qiáng)度，降解率，透明性， 同源性，抗原性及病原性等性能方面均存在著部分缺陷。豬角膜來源廣泛，價格便宜，角 膜厚度，地形圖和屈光方面與人角膜極為相似([IlLiu W，McLaughlin CR, Fagerholm P， Lagali NS, Heyne B, et al. Collagen-phoshphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes. Biomaterials,2009. p. 1551-9 ； [2]Biomaterials and Culture Methods. Res 2008 ;63 :535_544 ; [3]recombinant humancollagen-based corneal substitutes for I mplantation !performance of type I versus type IIIcollagen. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008 ；49 3887-3894 ； [4]Li F, Lohmann C, Suuronen Ε, VascottoS, Kobuch K, et al. Cellular and nerve regeneration within a biosynthetic extracellular matrix forcorneal transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:15346-15351 ； [5]Gilbert Tff,BadylakSF. Decellualrization of tissues and organs. Biomaterials 2006 ；27 :3675_3683)，越來越受到科學(xué)家的重視，而目前豬 的其他器官已經(jīng)用于異種移植([6] Sykes M, Sandrin M. Position paper of theEthics Committee of the International Xenotransplantation Association. Transplantation 2004 ；78 1101-1107 ； [7]Kampmeier J, Birngruber R, Brinkmann R. Thermal and biomechanical parametersof porcine cornea. 2000 ;19 :355_363)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與現(xiàn)有材料相比，來源豐富、透明度高、生物相容性好、 性能與新鮮角膜接近、脫細(xì)胞徹底、安全性強(qiáng)，能被廣大患者接受并長期應(yīng)用于臨床的板層 組織工程角膜支架及其制作方法與應(yīng)用。所述一種板層組織工程角膜支架可用于角膜移植各種供體材料的替代物。所述一種板層組織工程角膜支架為動物源性脫細(xì)胞板層角膜基質(zhì)片，不含細(xì)胞成 分，膠原纖維排列整齊，間隙規(guī)則，角膜透光率為80% 95%，拉伸強(qiáng)度為2 5N/mm2。所述板層組織工程角膜支架可包括未干燥板層角膜支架、干燥板層角膜支架或復(fù) 水板層角膜支架等。所述未干燥板層角膜支架的含水量和膨脹率為75% 90%。所述干燥板層角膜支架是以未干燥板層角膜支架為基礎(chǔ)，經(jīng)過干燥處理的板層角 膜支架，所述干燥處理可為真空凍干，真空晾干，干燥無水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干， 30 60°C恒溫箱內(nèi)烘干等中的至少一種。所述復(fù)水板層角膜支架是以干燥板層角膜支架為基礎(chǔ)，經(jīng)過復(fù)水過程處理的板層 角膜支架，所述復(fù)水過程處理所用的復(fù)水劑選自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培養(yǎng) 液，短、中期角膜保存液等中的至少一種，含水量和膨脹率為75% 90%。所述板層組織工程角膜支架的制作方法包括以下步驟1)將新鮮動物眼球經(jīng)過碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，沖洗；2)消毒后用濾紙覆蓋于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮細(xì)胞層；3)在手術(shù)顯微鏡下作角膜緣切口，伸入虹膜恢復(fù)器分離前層角膜，分離完全后用 角膜剪剪下前層角膜，或直接用板層角膜分離刀分離前板層角膜；4)將分離的前板層角膜放于角膜枕上，前彈力層面朝下，然后用角膜環(huán)鉆取3 IOmm直徑的板層角膜基質(zhì)片(10-0尼龍線標(biāo)記上皮面)；將去上皮后的新鮮板層角膜基質(zhì) 片直接放于密閉無菌的凍存管內(nèi)給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為1 5min，復(fù)溫時間 為3 15min，循環(huán)次數(shù)為1 5次；5)將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于低滲液中浸泡20 120min ；6)將經(jīng)過步驟5)處理過的板層角膜基質(zhì)片放于30 40°C恒溫箱中，先后于 DNA酶孵育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同時在各自的緩沖液中加入0. 5 2. 5ug/ml的蛋白酶抑制劑，每毫克角膜基質(zhì)干重含1. 10士0. 25 μ g DNA，角膜基質(zhì)含水量為 50% 80% ；7)將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片放置于電泳液TA液中(作好角膜的電泳方向 標(biāo)記)，然后將整個電泳槽放于密閉消毒盒內(nèi)，0 10°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳；8)將電泳完畢的板層角膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜 支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆茫?)將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行干燥處理，即得到干燥板層組織工程 角膜支架；10)將干燥板層組織工程角膜支架進(jìn)行鈷60消毒，進(jìn)行復(fù)水處理，得復(fù)水板層角 膜支架。在步驟1)中，所述碘伏，可采用質(zhì)量百分濃度為0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的時間可為2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的時間可為5 lOmin，所述PBS沖 洗，可沖洗3次，每次沖洗的時間可為5min ；所述抗菌素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布 霉素或100mg/L鏈霉素等。在步驟2)中，所述濾紙，最好是蘸有質(zhì)量百分濃度為15% 30%酒精的濾紙；所 述直接浸泡的時間可為1 5min ；所述擦除上皮細(xì)胞層，可采用棉簽或角膜上皮刀擦除上 皮細(xì)胞層。在步驟3)中，所述在手術(shù)顯微鏡下作角膜緣切口，可采用寶石刀作深度為3 4mm,厚度為0. 8 1. 2mm,長為2. 5 3. 5mm的角膜緣切口 ；所述直接用板層角膜分離刀分 離前板層角膜的前板層角膜的深度可為3 4mm，厚度可為0. 8 1. 2mm。在步驟5)中，所述低滲液，可選自雙蒸水或三蒸水等。在步驟6)中，所述酶與緩沖液的體積比可為1 50，DNA酶與RNA酶的體積比 可為10 1 ；所述蛋白酶抑制劑可采用roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin, Trypsin 等蛋白酶。在步驟7)中，所述冰浴電泳的時間可為1 4h，所述電泳可為單相水平電泳或雙 相電泳，電泳的條件為100 180￥/011，1\14溶液配置方法將4. 84g TrisBase溶于100ml 雙蒸水中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加雙蒸水至IL ；在步驟9)中，所述干燥處理可為真空凍干，真空晾干，干燥無水Cacl2真空干燥，自 然晾干，吹干，30 60°C恒溫箱內(nèi)烘干等中的至少一種，所述干燥處理的時間可為6 24h。在步驟10)中，所述復(fù)水處理所采用的復(fù)水劑可選自林格氏液，平衡液，IXPBS溶 液，DMEM培養(yǎng)液，短期角膜保存液，中期角膜保存液等中的至少一種。本發(fā)明所述一種板層組織工程角膜支架可用于角膜移植各種供體材料的替代物， 可在治療角膜外傷及化學(xué)燒傷系列疾病，角膜腫瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反應(yīng)系列疾病等角膜病變中應(yīng)用。本發(fā)明從詳細(xì)分析目前常用去細(xì)胞方法出發(fā)，并根據(jù)各自的優(yōu)缺點進(jìn)行嚴(yán)格篩選 和有效組合，最后選出了對組織結(jié)構(gòu)影響較小的凍融法破壞崩解細(xì)胞膜，用低滲法來脹破 核膜，采用對膠原纖維蛋白支架沒有影響DNA/RNA酶破壞和消化殘留的核酸，并在緩沖液 中加入了蛋白酶抑制劑，減少了角膜基質(zhì)骨架細(xì)胞外基質(zhì)(主要是糖胺聚糖)的破壞，利用 單相/雙相電泳的方法將細(xì)胞殘留碎屑和帶電成分去除干凈，達(dá)到徹底去除了支架材料的 抗原成分的目的，通過完全電泳出殘留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的 病原性。為了能達(dá)到開發(fā)產(chǎn)品的要求，在脫細(xì)胞處理的各個環(huán)節(jié)如時間、溫度、電壓、如何保 證無菌及電解液的配置等方面均經(jīng)過詳細(xì)周密的設(shè)計和反復(fù)嚴(yán)格的摸索；通過一系列制作 過程的反復(fù)改良和優(yōu)化，使本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，制作流程簡單可靠，時間短且易于實施；2)板層組織工程角膜支架來源廣泛，成本低，使用方便；3)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，脫細(xì)胞徹底，最小的減少角膜基質(zhì)骨架細(xì)胞外基質(zhì)的 破壞，膠原排列規(guī)則，間隙均勻，不留有任何核酸物質(zhì)及可溶性蛋白成分，表面由IV型膠原 構(gòu)成的前彈力層以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自體細(xì)胞增 殖爬行，而蛋白酶抑制劑的應(yīng)用，最大限度的保護(hù)了基質(zhì)的膠原蛋白；
4)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的板層組織工程角膜支架，生物學(xué)性質(zhì)檢測(透明 度、含水量、膨脹率、最大拉伸長度)，超微結(jié)構(gòu)觀察及視光學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種材料與人 角膜基質(zhì)極其相近；5)本發(fā)明不僅有利于優(yōu)化動物角膜基質(zhì)脫細(xì)胞條件，同時將為組織工程角膜產(chǎn)業(yè) 化提供重要的技術(shù)支持。


圖1是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥脫細(xì)胞豬板層角膜基質(zhì)片的DAPI染色結(jié)果。圖2是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥脫細(xì)胞豬板層角膜基質(zhì)片的DNAGel結(jié)果。圖3是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的脫細(xì)胞豬板層角膜基質(zhì)片的透明度情況。圖4是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥脫細(xì)胞豬板層角膜基質(zhì)片的透射電鏡下超 微結(jié)構(gòu)結(jié)果。圖5是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥豬板層角膜基質(zhì)片(直徑為9cm)兔頸背部 植入術(shù)后8月的裂隙燈照片。圖6是經(jīng)過本發(fā)明方法制作未干燥豬板層角膜基質(zhì)片兔眼前房內(nèi)植入2月的的裂 隙燈照片。圖7是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥豬板層角膜基質(zhì)片在兔角膜中央囊袋平鋪 術(shù)后3月后的裂隙燈照片。圖8是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥豬板層角膜基質(zhì)片用于兔眼角膜移植10天 的裂隙燈照片。圖9為本發(fā)明制備的未干燥豬板層組織工程角膜支架和新鮮豬板層組織工程角 膜支架用于兔眼角膜移植12天內(nèi)角膜上皮修復(fù)的對比曲線。在圖9中，橫坐標(biāo)為修復(fù)時間 time (day)，縱坐標(biāo)為角膜上皮已修復(fù)的比例Accumulation repair ；▲為未處理組，■為實驗組。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明所述板層組織工程角膜支架，以干燥后復(fù)水的板層角膜支架為例，包括以 下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過碘伏消毒后經(jīng)過酒精處理及刮除法去凈上皮細(xì)胞，分離出板 層角膜，取下板層角膜基質(zhì)片，將其放于角膜枕上用角膜環(huán)鉆取下不同直徑的板層角膜片， 通過反復(fù)規(guī)律密閉凍融、低滲溶脹，DNA、RNA酶消化、密閉消毒盒內(nèi)冰浴電泳法、24孔板內(nèi) 干燥技術(shù)及鈷60消毒技術(shù)等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片即 得所述板層組織工程角膜基質(zhì)支架。保存?zhèn)溆?，用前可適當(dāng)加入所需的生長因子等。制備方法一，包括以下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的濾紙覆蓋于角膜表面3min，然后用棉簽/角膜上皮刀輕輕的擦除上皮細(xì)胞 層；在手術(shù)顯微鏡下用寶石刀作深約3/4 (厚約0. 8 1. 2mm)，長約3mm的角膜緣切口，伸 入虹膜恢復(fù)器分離前層角膜，厚度約為0. 8 1. 2mm，分離完全后用角膜剪剪下前層角膜； 將分離下前板層角膜放于角膜枕上(前彈力層面朝下)，然后用角膜環(huán)鉆取3 IOmm直徑 的板層角膜基質(zhì)片(10 0尼龍線標(biāo)記上皮面)。將去上皮后的新鮮板層角膜基質(zhì)片直接放于密閉無菌的2ml凍存管內(nèi)給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為2min，復(fù)溫時間為5min， 循環(huán)次數(shù)為3次；然后將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡60min。然后將經(jīng)過 上述處理的基質(zhì)片放于37°C溫箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同時 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制劑，其中酶與buffer的比例為1 50，DNA 酶與RNA酶的用量比例為10 1，每毫克角膜基質(zhì)干重含約1. 10士0.25 μ gDNA，角膜基質(zhì) 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制劑是roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片放置于特殊的電泳 液TA液中(做好角膜的電泳方向標(biāo)記)，然后將整個單相水平電泳槽放于密閉消毒盒內(nèi)， 4°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳1 4h，電泳的條件為100 180V/cm ；將電泳完畢的板層角 膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保 存?zhèn)溆?；然后將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行無水Cacl2真空干燥，時間為12h，即 得到干燥板層組織工程角膜支架；干燥后的樣品進(jìn)行鈷60消毒，用時進(jìn)行林格氏液復(fù)水處 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片即為所述板層組織工 程角膜基質(zhì)支架。保存?zhèn)溆茫们翱蛇m當(dāng)加入所需的生長因子等。制備方法二，包括以下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的濾紙覆蓋于角膜表面3min，然后用棉簽/角膜上皮刀輕輕的擦除上皮細(xì)胞 層；在手術(shù)顯微鏡下直接用板層角膜分離刀分離深約3/4 (厚約0. 8 1. 2mm)的前板層角 膜；將分離下前板層角膜放于角膜枕上(前彈力層面朝下)，然后用角膜環(huán)鉆取3 IOmm直 徑的板層角膜基質(zhì)片(10 0尼龍線標(biāo)記上皮面)。將去上皮后的新鮮板層角膜基質(zhì)片直接 放于密閉無菌的2ml凍存管內(nèi)給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為2min，復(fù)溫時間為5min， 循環(huán)次數(shù)為3次；然后將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡60min。然后將經(jīng)過 上述處理的基質(zhì)片放于37°C溫箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同時 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制劑，其中酶與buffer的比例為1 50，DNA 酶與RNA酶的用量比例為10 1，每毫克角膜基質(zhì)干重含約1.10士0.25 μ g DNA，角膜基質(zhì) 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制劑是roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片放置于特殊的電泳 液TA液中(做好角膜的電泳方向標(biāo)記)，然后將整個單相水平電泳槽放于密閉消毒盒內(nèi)， 4°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳1 4h，電泳的條件為100 180V/cm ；將電泳完畢的板層角 膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保 存?zhèn)溆茫蝗缓髮⑽锤稍锝悄せ|(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行無水CaCl2真空干燥，時間為12h，即 得到干燥板層組織工程角膜支架；干燥后的樣品進(jìn)行鈷60消毒，用時進(jìn)行林格氏液復(fù)水處 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片即為所述板層組織工 程角膜基質(zhì)支架。保存?zhèn)溆?，用前可適當(dāng)加入所需的生長因子等。實施例2本發(fā)明所述板層組織工程角膜支架，以干燥后復(fù)水的板層角膜支架為例，包括以 下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過抗菌素消毒后經(jīng)過酒精處理及刮除法去凈上皮細(xì)胞，分離出 板層角膜，取下板層角膜基質(zhì)片，將其放于角膜枕上用角膜環(huán)鉆取下不同直徑的板層角膜片，通過反復(fù)規(guī)律密閉凍融、低滲溶脹，DNA、RNA酶消化、密閉消毒盒內(nèi)冰浴電泳法、24孔板 內(nèi)干燥技術(shù)及鈷60消毒技術(shù)等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片 即得所述板層組織工程角膜基質(zhì)支架。保存?zhèn)溆?，用前可適當(dāng)加入所需的生長因子等。制備方法一，包括以下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS沖洗3次X 5min。所用的抗菌素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈 霉素；消毒后用蘸有20%酒精的濾紙覆蓋于角膜表面3min，然后用棉簽/角膜上皮刀輕輕 的擦除上皮細(xì)胞層；在手術(shù)顯微鏡下用寶石刀作深約3/4 (厚約0. 8 1. 2mm)，長約3mm的 角膜緣切口，伸入虹膜恢復(fù)器分離前層角膜，厚度約為0. 8 1. 2mm,分離完全后用角膜剪 剪下前層角膜；將分離下前板層角膜放于角膜枕上(前彈力層面朝下)，然后用角膜環(huán)鉆取 3 IOmm直徑的板層角膜基質(zhì)片(10-0尼龍線標(biāo)記上皮面)。將去上皮后的新鮮板層角膜 基質(zhì)片直接放于密閉無菌的2ml凍存管內(nèi)給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為2min，復(fù)溫 時間為5min，循環(huán)次數(shù)為3次；然后將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡60min。 然后將經(jīng)過上述處理的基質(zhì)片放于37°C溫箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育 120min,同時在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制劑，其中酶與buffer的比例為 1 50，DNA酶與RNA酶的用量比例為10 1，每毫克角膜基質(zhì)干重含約1. 10士0. 25 μ g DNA,角膜基質(zhì)含水量在50-80%之間，蛋白酶抑制劑是roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA，能抑 ffj[J Protease, Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte, Elastase, pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片 放置于特殊的電泳液TA液中(做好角膜的電泳方向標(biāo)記)，然后將整個單相水平電泳槽放 于密閉消毒盒內(nèi)，4°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳1 4h，電泳的條件為100 180V/cm ；將電 泳完畢的板層角膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧 乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆?；然后將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行無水CaCl2真空干 燥，時間為12h，即得到干燥板層組織工程角膜支架；干燥后的樣品進(jìn)行鈷60消毒，用時進(jìn) 行林格氏液復(fù)水處理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片即 為所述板層組織工程角膜基質(zhì)支架，保存?zhèn)溆?。制備方法二，包括以下步驟將新鮮動物眼球經(jīng)過用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS沖洗3次X5min。所用的抗菌素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，IOOmg/ L鏈霉素；消毒后用蘸有20%酒精的濾紙覆蓋于角膜表面3min，然后用棉簽/角膜上皮刀 輕輕的擦除上皮細(xì)胞層；在手術(shù)顯微鏡下直接用板層角膜分離刀分離深約3/4 (厚約0. 8 1. 2mm)的前板層角膜；將分離下前板層角膜放于角膜枕上(前彈力層面朝下)，然后用角膜 環(huán)鉆取3-10mm直徑的板層角膜基質(zhì)片(10-0尼龍線標(biāo)記上皮面)。將去上皮后的新鮮板層 角膜基質(zhì)片直接放于密閉無菌的2ml凍存管內(nèi)給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為2min， 復(fù)溫時間為5min，循環(huán)次數(shù)為3次；然后將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡 60min。然后將經(jīng)過上述處理的基質(zhì)片放于37°C溫箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶 中孵育120min，同時在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制劑，其中酶與buffer的 比例為1 50，DNA酶與RNA酶的用量比例為10 1，每毫克角膜基質(zhì)干重含約1. 10士0. 25 微克DNA，角膜基質(zhì)含水量在50-80%之間，蛋白酶抑制劑是roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA， f^itprtjlJ Protease,Calpain II,Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片放置于特殊的電泳液TA液中(做好角膜的電泳方向標(biāo)記)，然后將整個單相水平電泳槽放 于密閉消毒盒內(nèi)，4°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳1 4h，電泳的條件為100 180V/cm ；將電 泳完畢的板層角膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧 乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆?；然后將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行無水CaCl2真空干 燥，時間為12h，即得到干燥板層組織工程角膜支架；干燥后的樣品進(jìn)行鈷60消毒，用時進(jìn) 行林格氏液復(fù)水處理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后復(fù)水的板層角膜基質(zhì)片即 為所述板層組織工程角膜基質(zhì)支架。保存?zhèn)溆?，用前可適當(dāng)加入所需的生長因子等。本發(fā)明詳細(xì)分析目前常用去細(xì)胞方法，并根據(jù)各自的優(yōu)缺點進(jìn)行嚴(yán)格篩選和有效 組合，最后選出了對組織結(jié)構(gòu)影響較小的凍融法破壞崩解細(xì)胞膜，用低滲法來脹破核膜，采 用對膠原纖維蛋白支架沒有影響DNA/RNA酶破壞和消化殘留的核仁，并在緩沖液中加入了 蛋白抑制劑，減少了角膜基質(zhì)骨架ECM的破壞，低溫下利用單相/雙相電泳的方法將細(xì)胞殘 留碎屑和帶電成分去除干凈，達(dá)到徹底去除了支架材料的抗原成分的目的，通過完全電泳 出殘留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的病原性。為了能達(dá)到開發(fā)產(chǎn)品的 要求，在脫細(xì)胞處理的各個環(huán)節(jié)如時間、溫度、電壓、如何保證無菌及電解液的配置等方面 均經(jīng)過詳細(xì)周密的設(shè)計和反復(fù)嚴(yán)格的摸索；通過一系列制作過程的反復(fù)改良和優(yōu)化，使本 發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，制作流程簡單可靠，時間短且易于實施； (2)板層組織工程角膜支架來源廣泛，成本低，取材和使用方便；(3)經(jīng)過DAPI染色及DNA Gel結(jié)果顯示(圖1和2)，本發(fā)明方法制作的豬板層角膜基質(zhì)，脫細(xì)胞徹底，最小的減少角 膜基質(zhì)ECM的破壞，不留有任何核酸成分及可溶性蛋白，表面由IV型膠原構(gòu)成的前彈力層 以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自體細(xì)胞增殖爬行；(4)采用 本發(fā)明技術(shù)方案制作的豬板層組織工程角膜支架，透明度高(參見圖3)，生物學(xué)性質(zhì)檢測 包括透明度、含水量、膨脹率、最大拉伸長度等測量(參見表1)，超微結(jié)構(gòu)觀察(參見圖4) 及視光學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種材料與人角膜基質(zhì)極其相近，膠原排列規(guī)則，間隙均勻；(5) 采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的未干燥豬板層組織工程角膜支架，植入于兔皮下8個月(參見 圖5)，兔眼前房內(nèi)(參見圖6)6月均顯示其具有良好組織相容性，沒有見明顯的炎癥反應(yīng) 和排斥反應(yīng)；(6)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的未干燥豬板層組織工程角膜支架，用于兔角 膜中央平鋪術(shù)后3月(參見圖7)，發(fā)現(xiàn)角膜較為透明，不影響其透明度，未見明顯的炎癥反 應(yīng)和排斥反應(yīng)；(7)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的豬板層組織工程角膜支架，用于兔角膜移 植術(shù)后10天(參見圖8)，熒光素染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后10天角膜上皮在其表面生長完好(參見圖 9)，角膜逐漸透明，未見明顯的炎癥反應(yīng)和排斥反應(yīng)；(7)本發(fā)明不僅有利于優(yōu)化動物角膜 基質(zhì)脫細(xì)胞條件，同時將為組織工程角膜產(chǎn)業(yè)化提供重要的技術(shù)支持。表 1
10
注拉伸強(qiáng)度的單位為N/mm2，含水率、膨脹率和透光率的單位均為％。各種疾病造成的角膜透明度下降，角膜基質(zhì)不可逆性混濁是視力喪失的主要原 因，在致盲病因中位居第二，僅次于白內(nèi)障。角膜盲最有效的治療方法是穿透性角膜移植， 但是供體來源不足、免疫排斥反應(yīng)、角膜移植并發(fā)癥等限制了此項技術(shù)的開展。因此尋找一 種新的角膜替代材料就顯得尤為重要。角膜替代物主要分為二類人工角膜和組織工程角 膜等效物(TECE)。TECE是以細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的活性替代物，主要由天然角膜的三種細(xì)胞和 膠原成分構(gòu)成。構(gòu)建組織工程角膜等效物的關(guān)鍵是支持細(xì)胞三維生長的支架材料。以膠原 為基礎(chǔ)的天然生物聚合膠表現(xiàn)了極好的生物學(xué)特性，支持細(xì)胞三維生長，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用 于組織工程技術(shù)。目前尚無以此構(gòu)建的TECE臨床應(yīng)用的報道，主要原因是膠原韌性差，不 耐受縫合。去細(xì)胞處理的異種組織主要成分為膠原、彈力纖維等，形態(tài)與韌性變化較小。而 且去細(xì)胞處理可以降低異種組織的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)，擴(kuò)充組織來源。在組織工程 技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)研究中，去細(xì)胞生物支架材料如心臟瓣膜、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌、腱膜、 韌帶、小腸粘膜下組織、膀胱和肝臟，已經(jīng)進(jìn)入臨床前期動物實驗或臨床治療階段。但目前 的研究中多聯(lián)合應(yīng)用物理、化學(xué)及去污劑等方法去除基質(zhì)細(xì)胞，雖然盡可能的去除了細(xì)胞 成分，對角膜基質(zhì)骨架和ECM損傷較大，嚴(yán)重影響了基質(zhì)片的透明度和韌性。組織工程構(gòu)建角膜的關(guān)鍵技術(shù)是形成角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與生物 支架三維復(fù)合體。支架材料是組織工程領(lǐng)域研究的主要內(nèi)容，也是組織工程角膜的基本要 素之一。支架材料的特性直接影響著復(fù)合的種子細(xì)胞能否正常黏附、生長和分化。理想的TECE的支架材料應(yīng)具備以下特點1)良好的生物相容性，角膜的各種細(xì)胞能在其上或其中良好的生長。2)具有三維立體結(jié)構(gòu)并攜帶具有生物誘導(dǎo)性的多種化學(xué)信號可誘導(dǎo)種子細(xì)胞沿 支架材料生長并向角膜細(xì)胞分化。3)支架材料的降解速率與植入的種子細(xì)胞所形成組織的速率相匹配，可逐漸被降 解吸收或成為與新生組織相互融合的組成部分，可按病損角膜的缺損情況進(jìn)行塑行，達(dá)到 完善的形態(tài)修復(fù)。4)具有一定的強(qiáng)度和韌性，能抵抗眼內(nèi)壓。5)能逐漸透明化。而理想的方法需要對角膜基質(zhì)溫和(減少步驟，操作盡可能少，時間盡可能短，溫度盡可能低)，盡可能去除了細(xì)胞但不損傷基質(zhì)骨架及細(xì)胞外基質(zhì)，使角 膜基質(zhì)保留原有的生物學(xué)及力學(xué)特性，同時還不影響組織的透明度。為滿足上述大部分的 要求，我們詳細(xì)分析目前常用去細(xì)胞方法，并根據(jù)各自的優(yōu)缺點進(jìn)行嚴(yán)格篩選和有效組合， 最后發(fā)明出上述制作流程。 采用本發(fā)明制作的未干燥豬板層組織工程角膜支架，植入于兔皮下8個月，兔眼 前房內(nèi)6月均顯示其具有良好組織相容性，沒有見明顯的炎癥反應(yīng)和排斥反應(yīng)，明顯優(yōu)有 未處理的豬板層角膜基質(zhì)片植入結(jié)果，同時將其用于兔角膜中央及周邊囊袋內(nèi)平鋪術(shù)后3 月和角膜移植術(shù)后10天均發(fā)現(xiàn)角膜逐漸透明，未見明顯的炎癥反應(yīng)和排斥反應(yīng)，明顯優(yōu)有 未處理的豬板層角膜基質(zhì)片植入結(jié)果，熒光素染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后10天角膜上皮在其表面生長 完好。
權(quán)利要求
一種板層組織工程角膜支架，其特征在于為動物源性脫細(xì)胞板層角膜基質(zhì)片，不含細(xì)胞成分，膠原纖維排列整齊，間隙規(guī)則，角膜透光率為80％～95％，拉伸強(qiáng)度為2～5N/mm2。
2.如權(quán)利要求1所述的一種板層組織工程角膜支架，其特征在于所述板層組織工程角 膜支架包括未干燥板層角膜支架、干燥板層角膜支架或復(fù)水板層角膜支架；所述未干燥板 層角膜支架的含水量和膨脹率為75% 90%;所述干燥板層角膜支架是以未干燥板層角膜 支架為基礎(chǔ)，經(jīng)過干燥處理的板層角膜支架，所述干燥處理為真空凍干，真空晾干，干燥無 水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒溫箱內(nèi)烘干中的至少一種；所述復(fù)水板層 角膜支架是以干燥板層角膜支架為基礎(chǔ)，經(jīng)過復(fù)水過程處理的板層角膜支架，所述復(fù)水過 程處理所用的復(fù)水劑選自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培養(yǎng)液，短、中期角膜保存 液中的至少一種，含水量和膨脹率為75% 90%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于包括以下 步驟1)將新鮮動物眼球經(jīng)過碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，沖洗；2)消毒后用濾紙覆蓋于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮細(xì)胞層；3)在手術(shù)顯微鏡下作角膜緣切口，伸入虹膜恢復(fù)器分離前層角膜，分離完全后用角膜 剪剪下前層角膜，或直接用板層角膜分離刀分離前板層角膜；4)將分離的前板層角膜放于角膜枕上，前彈力層面朝下，然后用角膜環(huán)鉆取3 IOmm 直徑的板層角膜基質(zhì)片；將去上皮后的新鮮板層角膜基質(zhì)片直接放于密閉無菌的凍存管內(nèi) 給予反復(fù)凍融復(fù)溫處理，冷凍時間為1 5min，復(fù)溫時間為3 15min，循環(huán)次數(shù)為1 5 次；5)將凍融的板層角膜基質(zhì)片放置于低滲液中浸泡20 120min；6)將經(jīng)過步驟5)處理過的板層角膜基質(zhì)片放于30 40°C恒溫箱中，先后于DNA酶孵 育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同時在各自的緩沖液中加入0. 5 2. 5ug/ml 的蛋白酶抑制劑，每毫克角膜基質(zhì)干重含1. 10 士 0.25yg DNA，角膜基質(zhì)含水量為50% 80% ；7)將經(jīng)過酶消化的板層角膜基質(zhì)片放置于電泳液TA液中(作好角膜的電泳方向標(biāo) 記)，然后將整個電泳槽放于密閉消毒盒內(nèi)，0 10°C恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰浴電泳；8)將電泳完畢的板層角膜基質(zhì)片進(jìn)行梯度脫水，即得到未干燥板層組織工程角膜支 架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆茫?)將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進(jìn)行干燥處理，即得到干燥板層組織工程角膜 支架；10)將干燥板層組織工程角膜支架進(jìn)行鈷60消毒，進(jìn)行復(fù)水處理，得復(fù)水板層角膜支架。
4.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟 1)中，所述碘伏，是采用質(zhì)量百分濃度為0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的時間為2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的時間為5 lOmin，所述PBS沖洗，是沖洗3次，每次沖 洗的時間為5min ；所述抗菌素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素或100mg/L鏈霉素。
5.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟2)中，所述濾紙，是蘸有質(zhì)量百分濃度為15% 30%酒精的濾紙；所述直接浸泡的時間為1 5min;所述擦除上皮細(xì)胞層，是采用棉簽或角膜上皮刀擦除上皮細(xì)胞層。
6.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟 3)中，所述在手術(shù)顯微鏡下作角膜緣切口，是采用寶石刀作深度為3 4mm，厚度為0. 8 1. 2mm，長為2. 5 3. 5mm的角膜緣切口 ；所述直接用板層角膜分離刀分離前板層角膜的前 板層角膜的深度為3 4mm，厚度為0. 8 1. 2mm。
7.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟5) 中，所述低滲液，選自雙蒸水或三蒸水。
8.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟6) 中，所述酶與緩沖液的體積比為1 50，DNA酶與RNA酶的體積比為10 1 ；所述蛋白酶抑 制劑采用roche公司的產(chǎn)品，不含EDTA ；在步驟7)中，所述冰浴電泳的時間為1 4h，所述電泳為單相水平電泳或雙相電泳， 電泳的條件為100 180￥/011，1\14溶液配置方法將4. 84g TrisBase溶于IOOml雙蒸水 中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加雙蒸水至IL0
9.如權(quán)利要求3所述的一種板層組織工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步驟9) 中，所述干燥處理為真空凍干，真空晾干，干燥無水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒溫箱內(nèi)烘干中的至少一種，所述干燥處理的時間為6 24h ；在步驟10)中，所述復(fù) 水處理所采用的復(fù)水劑選自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培養(yǎng)液，短期角膜保存 液，中期角膜保存液中的至少一種。
10.如權(quán)利要求1所述一種板層組織工程角膜支架用于角膜移植各種供體材料的替代 物，在治療角膜外傷及化學(xué)燒傷系列疾病，角膜腫瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反應(yīng)系列疾病中應(yīng)用。
全文摘要
一種板層組織工程角膜支架及其制作方法與應(yīng)用，涉及一種生物醫(yī)學(xué)的板層組織工程角膜支架。提供一種與現(xiàn)有材料相比，來源豐富、透明度高、生物相容性好、性能與新鮮角膜接近、脫細(xì)胞徹底、安全性強(qiáng)，能被廣大患者接受并長期應(yīng)用于臨床的板層組織工程角膜支架及其制作方法與應(yīng)用。所述一種板層組織工程角膜支架為動物源性脫細(xì)胞板層角膜基質(zhì)片，不含細(xì)胞成分，膠原纖維排列整齊，間隙規(guī)則，角膜透光率為80％～95％，拉伸強(qiáng)度為2～5N/mm2?？捎糜诮悄ひ浦哺鞣N供體材料的替代物，可在治療角膜外傷及化學(xué)燒傷系列疾病，角膜腫瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反應(yīng)系列疾病等角膜病變中應(yīng)用。
文檔編號A61L27/38GK101947144SQ20101029643
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者劉祖國, 李煒, 梁凌毅, 許傳超, 邵毅 申請人:廈門大學(xué)