專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種新型骨生物修復(fù)復(fù)合材料，通過(guò)組織工 程學(xué)方法構(gòu)建可注射、原位固化磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
因先天性、外傷、感染、腫瘤等原因造成的骨缺損是臨床常見(jiàn)問(wèn)題。目前多采用自 體骨移植、異體骨移植和人工合成骨填充材料等方法填充修復(fù)骨缺損，但仍存在很多不足。 自體骨移植供區(qū)疼痛、失血、感染、結(jié)構(gòu)被破壞功能影響、取骨數(shù)量有限，異體骨免疫排 斥反應(yīng)，疾病傳染，人工合成骨填充材料目前仍舊只能起到骨缺損填充、支持作用，骨誘導(dǎo) 能力較弱。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生活的發(fā)展，骨折和骨缺損的發(fā)病率逐年上升，據(jù)保守估計(jì)，美 國(guó)每年大約有700萬(wàn)因骨科疾病就診，醫(yī)療消耗約2150億美元。我國(guó)每年需要進(jìn)行骨移 植的患者也已超過(guò)百萬(wàn)。因此，如何更好的修復(fù)骨組織缺損，一直是修復(fù)重建研究領(lǐng)域的熱 點(diǎn)ο應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)技術(shù)、原理研究開(kāi)發(fā)替代用組織工程骨為骨缺損的修復(fù)開(kāi)辟 了新途徑、新方法。近年來(lái)，組織工程骨研究發(fā)展迅速，種子細(xì)胞、生物材料支架和生長(zhǎng)因子 為組織工程骨修復(fù)骨缺損，再生新骨形成提供了符合生物學(xué)規(guī)律的研究思路，多項(xiàng)組織工 程骨研究表明合理的種子細(xì)胞在體外生物材料支架中能夠粘附、生長(zhǎng)并具有成骨性能，最 終在體內(nèi)再生成新骨組織。但由于骨組織再生過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，仍有很多機(jī)理尚待進(jìn)一步研 究，隨著骨再生研究的深入，目前多認(rèn)為骨再生修復(fù)過(guò)程中的塑形重建是構(gòu)建骨組織質(zhì)量 和功能的關(guān)鍵因素。隨著干細(xì)胞、生物材料和基因修飾技術(shù)的研究發(fā)展，又為組織工程骨研究提供了 新的思路和方法。生物材料支架是組織工程骨研究的主要內(nèi)容之一，目前主要有兩大類(lèi)材 料應(yīng)用于組織工程骨的支架研究(1)可用于微創(chuàng)外科的可注射型骨修復(fù)材料，較常見(jiàn)如 各類(lèi)型水凝膠攜帶種子細(xì)胞合并各種生長(zhǎng)因子、注射、原位交聯(lián)后形成細(xì)胞-支架三維結(jié) 構(gòu)。但多數(shù)材料的力學(xué)性能偏低，目前仍無(wú)法達(dá)到真正骨組織的物理和力學(xué)性能，因此尚 未能在承重骨骨缺損修復(fù)中廣泛應(yīng)用。(2)預(yù)成形支架骨修復(fù)材料，較常見(jiàn)如各類(lèi)型高分 子聚合物、仿生礦物復(fù)合物和金屬材料支架。這類(lèi)型材料支架雖然具有良好的力學(xué)性能，但 術(shù)前和/或術(shù)中需經(jīng)重新加工定型來(lái)滿(mǎn)足骨缺損處完全填充的需要，并且不具備可注射填 充能力，攜帶細(xì)胞能力仍不足。因此，目前也未能在微創(chuàng)外科中得到廣泛應(yīng)用。磷酸鈣骨水 泥(Calcium phosphate cement, CPC)因具有可注射性能、可原位塑形固化、凝固后可轉(zhuǎn)化 為具有骨誘導(dǎo)能力的羥基磷灰石(hydr0Xyapatite，HA)等特性而受到關(guān)注，并于1996年獲 得美國(guó)FDA批準(zhǔn)正式應(yīng)用于盧面部非承重骨缺損的修復(fù)，但因力學(xué)性能偏低應(yīng)用受到了限 制。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)系全能干細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和體 外長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍具有可誘導(dǎo)產(chǎn)生從滋養(yǎng)層到內(nèi)、中、外胚層所有細(xì)胞的能力，但由于倫理學(xué)和致畸發(fā)生率偏高等原因使得基于ESCs的組織工程骨研究相對(duì)滯后。間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs)能在體外增殖維持非分化狀態(tài)并具有分化成骨、軟 骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織的潛能，目前已在機(jī)體多個(gè)組織器官 中成功提取到具有分化潛能的MSCs，在多來(lái)源的MSCs中，又以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,bMSCs)較多被應(yīng)用于組織工程骨的研究。由于bMSCs存在提取 時(shí)需有創(chuàng)操作，一次提取細(xì)胞數(shù)量少和分化潛能會(huì)隨著傳代次數(shù)增加而衰減等不足，因此， 探尋理想的種子細(xì)胞一直是組織工程骨研究中的熱點(diǎn)之一。近期研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于臍帶基質(zhì) 組織的間充質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)MSCs細(xì)胞表型并能分化成骨、軟骨、脂肪和真皮等中胚層組織， 被稱(chēng)為臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord matrix stem cells，hUCMSCs)。 目前發(fā)現(xiàn)hUCMSCs具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)組織來(lái)源豐富；(2)提取細(xì)胞操作相對(duì)簡(jiǎn)便、消耗少； (3)屬于無(wú)創(chuàng)操作；(4)不存在倫理學(xué)問(wèn)題；(5)具有較高的誘導(dǎo)分化能力；(6)無(wú)免疫排斥 反應(yīng)。因此，有可能成為組織工程骨研究中較為理想的種子細(xì)胞之一。盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)強(qiáng)化CPC力學(xué)性能進(jìn)行了較深入的研究，但目前尚缺乏有關(guān)干 細(xì)胞在CPC中釋放和成骨作用的研究。其中可能的原因是CPC攜帶細(xì)胞能力偏低。因 此，本項(xiàng)目擬聯(lián)合應(yīng)用(1)聚合物殼聚糖(Chitosan)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)纖維增強(qiáng)CPC的力學(xué)性能，(2)海藻酸鈉水凝 膠hUCMSCs微囊釋放載體，攜帶更多種子干細(xì)胞進(jìn)入CPC內(nèi)部，構(gòu)建可用于微創(chuàng)外科的新型 強(qiáng)化型可注射、原位塑形、可降解組織工程骨，并通過(guò)影像學(xué)、組織學(xué)等方法觀察新型組織 工程骨對(duì)標(biāo)準(zhǔn)骨缺損鼠骨缺損的修復(fù)作用。項(xiàng)目設(shè)想早期聚合物殼聚糖和納米纖維可強(qiáng)化 CPC組織工程骨力學(xué)性能，但不影響其可注射、原位固化成形特性，干細(xì)胞微囊可攜帶大量 種子細(xì)胞進(jìn)入CPC復(fù)合物內(nèi)部，隨著纖維降解會(huì)在CPC組織工程骨中形成大而長(zhǎng)的孔隙，隨 著水凝膠微囊降解會(huì)形成小而均一的孔隙，進(jìn)而可形成類(lèi)似于松質(zhì)骨的空間結(jié)構(gòu)，伴隨干 細(xì)胞釋放進(jìn)入組織工程骨，更有助于后期新生骨形成。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有磷石灰組織工程骨力學(xué)性能的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種易 于操作、塑型方便、減少創(chuàng)傷、降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、減少感染危險(xiǎn)、疤痕形成和治 療費(fèi)用的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨。本發(fā)明的另一目的在于提供上述可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠 微囊組織工程骨的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)單、易于控制。本發(fā)明的目的還在于提供上述可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微 囊組織工程骨作為骨缺損修復(fù)材料的用途。本發(fā)明提供的一種可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，由以下重量百 分?jǐn)?shù)含量的組分制備而成 磷酸鈣骨水泥20 75 %殼聚糖20 75%PLGA 電紡絲1 10%hUCMSCs水凝膠微囊 3 15%。本發(fā)明所述的磷酸鈣骨水泥(Calcium phosphate cement, CPC)由磷酸四鈣(TTCP)和無(wú)水磷酸氫鈣(DCPA)混合制備而成，所述的磷酸四鈣(TTCP)和無(wú)水磷酸氫鈣 (DCPA)的摩爾質(zhì)量比為1 3 3 1。本發(fā)明所述的殼聚糖(Chitosan)的重量濃度為10 30%。本發(fā)明所述的PLGA電紡絲的直徑為200nm 10 μ m。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的PLGA電紡絲通過(guò)如下的電紡絲技術(shù)制備獲 得電紡絲設(shè)備由可調(diào)高壓電輸出裝置、接地電極、圓筒狀收集器和PLGA微量泵裝置構(gòu)成， 取重量濃度10 20%的PLGA由PLGA微量泵持續(xù)泵出，泵出速度1 10mL/h，工作電壓 1 30KV，注射針頭至收集器間工作距離8 10cm，收集器滾軸轉(zhuǎn)速1 20m/s，即可獲得。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的hUCMSCs水凝膠微囊通過(guò)如下的方法制備獲 得采用同軸氣流微囊發(fā)生設(shè)備制備形態(tài)均一的直徑為200 500 μ m的海藻酸鈉水凝膠微 囊，海藻酸鈉水凝膠的重量濃度為1 5%，0. IM CaCl2作為凝膠形成劑；選取第一代至第 五代臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord matrix stem cells, hUCMSCs)中的 任一代懸浮于海藻酸鈉水凝膠中，其中hUCMSCs細(xì)胞濃度為1 25M/ml，采用同軸氣流微囊 發(fā)生設(shè)備制備獲得hUCMSCs水凝膠微囊。本發(fā)明提供的一種可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨的制備方法 是將經(jīng)消毒滅菌處理的CPC粉末、Chitosan和電紡PLGA纖維絲攪拌，混合均勻，制備成 CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物，然后加入hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電 紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合，最終形成可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨。上述制備方法中，所述的CPC粉末、Chitosan和電紡PLGA纖維絲的攪拌時(shí)間為 3 5分鐘，所述的加入hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物的攪拌混 合時(shí)間為10 30秒。本發(fā)明提供的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其主要組分包括固 相粉料磷酸四鈣、無(wú)水磷酸氫鈣、水凝膠微囊和PLGA電紡絲，液相天然生物高分子聚合 物殼聚糖。它們?cè)从谔烊?、安全無(wú)毒、具有良好的生物相容性、生物降解性，磷酸四鈣、無(wú)水 磷酸氫鈣復(fù)合物與人體骨組織的無(wú)機(jī)成分基本一致，并具有骨誘導(dǎo)性和一定的骨傳導(dǎo)性。 海藻酸鈉水凝膠作為種子細(xì)胞釋放載體，攜帶更多種子干細(xì)胞進(jìn)入CPC內(nèi)部，凝膠中含一 定量的水分，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴(kuò)散。隨著纖維降解會(huì)在CPC組織工程骨中形成大而 長(zhǎng)的孔隙，水凝膠微囊降解會(huì)形成小而均一的孔隙，進(jìn)而可形成類(lèi)似于松質(zhì)骨的空間結(jié)構(gòu)， 可為骨的再生和重建提供物理支架和最佳的化學(xué)環(huán)境，伴隨干細(xì)胞釋放進(jìn)入組織工程骨， 更有助于后期新生骨形成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)(1)材料均為安全無(wú)毒的純天然聚合物體系。磷酸四鈣、無(wú)水磷酸氫鈣源于天然 礦物，海藻酸鈉為源于海藻的天然多糖、明膠為源于動(dòng)物膠原的蛋白質(zhì)，均為安全無(wú)毒的的 天然成分。(2)組織工程骨的可注射性和原位固化、塑形?？商畛淙魏涡螤畹墓侨睋p，能和周 圍組織緊密接觸。易于操作、原位塑形、最大限度減少創(chuàng)傷，降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、 減少感染危險(xiǎn)、疤痕形成和治療費(fèi)用。(3)殼聚糖，PLGA電紡絲可顯著提高組織工程骨的材料力學(xué)性能，使CPC復(fù)合組織 工程骨在修復(fù)負(fù)重區(qū)骨缺損中的應(yīng)用成為可能。海藻酸鈉水凝膠作為種子細(xì)胞釋放載體， 可攜帶大量種子細(xì)胞進(jìn)入CPC內(nèi)部，凝膠中含一定量的水分，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴(kuò)散，并且由于未使用時(shí)是液態(tài)，可跟生物活性分子、治療藥物等均勻混合后再注入固化。(4)隨著纖維降解會(huì)在CPC組織工程骨中形成大而長(zhǎng)的孔隙，水凝膠微囊降解也 會(huì)形成小而均一的孔隙，進(jìn)而可形成類(lèi)似于松質(zhì)骨的空間結(jié)構(gòu)，可為骨的再生和重建提供 最佳的空間環(huán)境，伴隨干細(xì)胞釋放進(jìn)入組織工程骨，更有助于后期新生骨形成。為骨的再生 和重建提供最佳的物理化學(xué)環(huán)境，模擬了天然骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分，使材料具有優(yōu)異 的生物相容性及可調(diào)的物理機(jī)械性能、生物降解性能。綜上所述，本發(fā)明制備的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨的有益效 果不僅保留磷石灰原有的良好生物相容性和成骨誘導(dǎo)性能，而且顯著提高了磷石灰組織工 程骨的力學(xué)性能和攜帶種子細(xì)胞能力。具有優(yōu)異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細(xì)胞， 用作注入型可降解骨組織工程骨，用于由腫瘤、外傷、嚴(yán)重感染、先天畸形等多種疾病造成 的骨缺損或骨量不足的治療。組織工程骨的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)單、易于控制。操 作簡(jiǎn)便、塑型方便、最大限度減少創(chuàng)傷，降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、減少感染危險(xiǎn)、疤痕 形成和治療費(fèi)用。在組織工程骨研究領(lǐng)域具有一定的先進(jìn)性和創(chuàng)新性，可為組織工程骨研 究和臨床應(yīng)用提供新思路和新方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 8 克 CPC (TTCP/DCPA =1:1)粉末、0. 9 克 15% Chitosan 和0. 0884gPLGA電紡絲(長(zhǎng)度3mm)攪拌3分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan比例 2:1，PLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例10%的CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合 物。立即加入0. 092g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢攪 拌混合15秒，形成CPC與Chitosan比例2:1，PLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠微 囊分別占人工骨總體積比例10%和10%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠 微囊組織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入 細(xì)胞孵育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例2將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 8 克 CPC (TTCP/DCPA =1:1)粉末、0. 9 克 15% Chitosan 和0. 0884gPLGA電紡絲(3mm)攪拌3分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan比例2:1， PLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例10%的CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物。立 即加入0. 184g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合 15秒，形成CPC與Chitosan比例2 LPLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠微囊分別 占人工骨總體積比例10%和20%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組 織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入細(xì)胞孵 育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例3將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 8 克 CPC (TTCP/DCPA =1:1)粉末、0. 9 克 15% Chitosan 和0. 0884gPLGA電紡絲(3mm)攪拌3分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan比例2:1， PLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例10%的CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物。立 即加入0. 276g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合15秒，形成CPC與Chitosan比例2 LPLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠微囊分別 占人工骨總體積比例10%和30%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組 織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入細(xì)胞孵 育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例4將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 8 克 CPC (TTCP/DCPA =1:1)粉末、0. 9 克 15% Chitosan 和0. 0884gPLGA電紡絲(3mm)攪拌3分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan比例2:1， PLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例10%的CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物。立 即加入0. 368g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合 15秒，形成CPC與Chitosan比例2 LPLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠微囊分別 占人工骨總體積比例10%和40%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組 織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入細(xì)胞孵 育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例5將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 8 克 CPC (TTCP/DCPA =1:1)粉末、0. 9 克 15% Chitosan 和0. 0884gPLGA電紡絲(3mm)攪拌3分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan比例2:1， PLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例10%的CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物。立 即加入0. 46g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合15 秒，形成CPC與Chitosan比例2:1，PLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠微囊分別占 人工骨總體積比例10%和50%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷磷石灰/水凝膠微囊組 織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入細(xì)胞孵 育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例6將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 316克CPC(TTCP/DCPA = 3:1)粉末、0. 466克15 % Chitosan和0. 084gPLGA電紡絲(長(zhǎng)度3mm)攪拌5分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan 比例3 LPLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例20% CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù) 合物。立即加入0. 062g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢 攪拌混合15秒，形成CPC與Chitosan比例3:1，PLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠 微囊分別占人工骨總體積比例20%和10%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝 膠微囊組織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置 入細(xì)胞孵育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37 °C、CO2濃度90 %。實(shí)施例7將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 316克CPC(TTCP/DCPA = 3 1)粉末、0. 466克15 % Chitosan和0. 084gPLGA電紡絲(長(zhǎng)度3mm)攪拌5分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan 比例3 LPLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例20% CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù) 合物。立即加入0. 124g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢 攪拌混合15秒，形成CPC與Chitosan比例3:1，PLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠 微囊分別占人工骨總體積比例20%和20%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝 膠微囊組織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置入細(xì)胞孵育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37°C、CO2濃度90 %。實(shí)施例8將經(jīng)消毒滅菌處理的1. 316克CPC(TTCP/DCPA = 3:1)粉末、0. 466克15 % Chitosan和0. 084gPLGA電紡絲(長(zhǎng)度3mm)攪拌5分鐘，混合均勻，制備成CPC與Chitosan 比例3 LPLGA電紡絲體積比例占復(fù)合物總體積比例20% CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù) 合物。立即加入0. 186g的hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物緩慢 攪拌混合15秒，形成CPC與Chitosan比例3:1，PLGA電紡絲體積比例和hUCMSCs水凝膠 微囊分別占人工骨總體積比例20%和30%的可注射、可塑形、可降解強(qiáng)化型磷石灰/水凝 膠微囊組織工程骨。置入注射器內(nèi)待用，或37°C靜置，30分鐘內(nèi)凝固塑形，加入培養(yǎng)液，置 入細(xì)胞孵育箱備用，培養(yǎng)條件溫度37°C、CO2濃度90 %。以上實(shí)施例1-8中所述的磷酸鈣骨水泥(Calcium phosphate cement, CPC)由 磷酸四鈣(TTCP)和無(wú)水磷酸氫鈣(DCPA)按摩爾質(zhì)量比為1 1或3 1混合制備而成。 所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polydactic-co-glycolic acid), PLGA)電紡絲通過(guò)如 下的電紡絲技術(shù)制備獲得電紡絲設(shè)備由可調(diào)高壓電輸出裝置、接地電極、圓筒狀收集器和 PLGA微量泵裝置構(gòu)成，取重量濃度10 20%的PLGA由PLGA微量泵持續(xù)泵出，泵出速度 1 10mL/h，工作電壓1 30KV，注射針頭至收集器間工作距離8 10cm，收集器滾軸轉(zhuǎn)速 1 20m/s，即可獲得直徑為200nm 10 μ m的PLGA電紡絲。所述的hUCMSCs水凝膠微囊通 過(guò)如下的方法制備獲得采用同軸氣流微囊發(fā)生設(shè)備制備形態(tài)均一的直徑為200 500 μ m 的海藻酸鈉水凝膠微囊，海藻酸鈉水凝膠的重量濃度為1 5%，0. IM CaCl2作為凝膠形 成劑；選取第四代臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord matrix stem cells, hUCMSCs)懸浮于海藻酸鈉水凝膠中，其中hUCMSCs細(xì)胞濃度為1 25M/ml，采用上述同軸 氣流微囊發(fā)生設(shè)備制備獲得hUCMSCs水凝膠微囊。以上實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以上實(shí)施 例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明的目的。
權(quán)利要求
一種可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于由以下重量百分?jǐn)?shù)含量的組分制備而成磷酸鈣骨水泥 20～75％殼聚糖 20～75％PLGA電紡絲 1～10％hUCMSCs水凝膠微囊 3～15％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的磷酸鈣骨水泥由磷酸四鈣和無(wú)水磷酸氫鈣混合制備而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的磷酸四鈣和無(wú)水磷酸氫鈣的摩爾質(zhì)量比為1 3 3 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的殼聚糖的重量濃度為10 30%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的PLGA電紡絲的直徑為200nm 10 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的PLGA電紡絲通過(guò)如下的電紡絲技術(shù)制備獲得電紡絲設(shè)備由可調(diào)高壓電輸出裝置、 接地電極、圓筒狀收集器和PLGA微量泵裝置構(gòu)成，取重量濃度10 20%的PLGA由PLGA 微量泵持續(xù)泵出，泵出速度1 10mL/h，工作電壓1 30KV，注射針頭至收集器間工作距離 8 10cm，收集器滾軸轉(zhuǎn)速1 20m/s，即可獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，其特征在于 所述的hUCMSCs水凝膠微囊通過(guò)如下的方法制備獲得采用同軸氣流微囊發(fā)生設(shè)備制備形 態(tài)均一的直徑為200 500 μ m的海藻酸鈉水凝膠微囊，海藻酸鈉水凝膠的重量濃度為1 5%,0. IM CaCl2作為凝膠形成劑；選取第一代至第五代臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞hUCMSCs中 的任一代懸浮于海藻酸鈉水凝膠中，其中hUCMSCs細(xì)胞濃度為1 25M/ml，采用同軸氣流微 囊發(fā)生設(shè)備制備獲得hUCMSCs水凝膠微囊。
8.權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨的制備方法，其特 征在于將經(jīng)消毒滅菌處理的CPC粉末、Chitosan和電紡PLGA纖維絲攪拌，混合均勻，制備 成CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物，然后加入hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA 電紡絲復(fù)合物緩慢攪拌混合，最終形成可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨的制備方法， 其特征在于所述的CPC粉末、Chitosan和電紡PLGA纖維絲的攪拌時(shí)間為3 5分鐘，所述 的加入hUCMSCs水凝膠微囊與CPC-Chitosan-PLGA電紡絲復(fù)合物的攪拌混合時(shí)間為10 30秒。
10.權(quán)利要求1所述的可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨作為骨缺損修復(fù) 材料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可注射強(qiáng)化型磷石灰/水凝膠微囊組織工程骨，由以下重量百分?jǐn)?shù)含量的組分制備而成磷酸鈣骨水泥20～75％、殼聚糖20～75％、PLGA電紡絲1～10％、hUCMSCs水凝膠微囊3～15％。本發(fā)明還公開(kāi)了該組織工程骨的制備方法及作為骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。本發(fā)明不僅保留磷石灰原有的良好生物相容性和成骨誘導(dǎo)性能，而且顯著提高了磷石灰組織工程骨的力學(xué)性能和攜帶種子細(xì)胞能力，具有優(yōu)異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細(xì)胞，用作注入型可降解骨組織工程骨，可用于多種疾病造成的骨缺損或骨量不足的治療，具有易于操作、塑型方便、最大限度減少創(chuàng)傷、降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、減少感染危險(xiǎn)和疤痕形成等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/52GK101934095SQ20101027041
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者趙亮 申請(qǐng)人:趙亮