專利名稱：絲素蛋白多孔三維材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多孔材料及其制備方法，特別涉及一種以絲素蛋白為原料，制備 多孔三維材料的技術(shù)，所制備的材料可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、組織工程等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)用材料特別是組織工程支架材料、組織修復(fù)再生材料等，要求所使用的材 料不僅具有良好的生物相容性，同時(shí)必須具備合適的三維多孔結(jié)構(gòu)、可控的生物降解性、一 定的力學(xué)強(qiáng)度、以及可以釋放因子或者其它相關(guān)藥物的性能。對(duì)于制備生物醫(yī)用材料的方法，尤其是制備生物材料多孔支架的方法，要求制備 過程應(yīng)當(dāng)盡可能溫和，并盡量避免毒性有機(jī)溶劑的使用，這樣保護(hù)其生物相容性和可能加 載藥物的活性；同時(shí)，也要求有溫和有效的方法來調(diào)控生物材料的結(jié)構(gòu)，從而有效控制材料 的降解行為以適應(yīng)不同組織的正常再生。中國(guó)是蠶絲的發(fā)源地和主要生產(chǎn)國(guó)。蠶絲主要由70%的絲素蛋白和25%的絲膠 蛋白組成，其中的絲素蛋白具有優(yōu)異的生物相容性、機(jī)械性能和可降解性，是一種非常有前 途的組織工程支架材料。大量研究證明，絲素蛋白基組織工程支架能夠應(yīng)用于骨、皮膚、血 管、神經(jīng)、肝、軟骨、韌帶多種組織的再生。同時(shí)，絲素蛋白開始被應(yīng)用于藥物緩釋領(lǐng)域，絲素 蛋白薄膜或凝膠作為藥物釋放的載體，表現(xiàn)出良好的控釋效果。因此，絲素蛋白有可能同時(shí) 作為支架材料和藥物載體，避免藥物載體同支架的不相容問題。作為一種普適的生物材料， 絲素蛋白在不同領(lǐng)域都表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)主要有絲素I(Silk I)和絲素II(Silk II)兩種。其中絲 素II結(jié)晶是一種伸展的反平行β-折疊結(jié)構(gòu)，絲素I結(jié)晶則是介于蛋白質(zhì)β-折疊結(jié)構(gòu)和 α-螺旋結(jié)構(gòu)中間的一種曲柄型結(jié)構(gòu)。蠶絲纖維中絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)主要是絲素II結(jié) 晶，從5齡蠶的絹絲腺中得到的液態(tài)絲素蛋白不做拉伸或者化學(xué)處理，在0 40°C緩慢干 燥可以得到絲素I結(jié)晶。作為生物材料使用的絲素蛋白，必然涉及到這兩種主要的絲素蛋 白結(jié)晶結(jié)構(gòu)。蠶絲纖維的降解速度比較緩慢，這是由于反平行折疊結(jié)構(gòu)比較規(guī)整緊密。 非結(jié)晶結(jié)構(gòu)的增多可以提高降解速度，但是非結(jié)晶結(jié)構(gòu)過多的絲素蛋白可溶于水，作為材 料使用時(shí)需要使用交聯(lián)劑來降低其水溶性，而這有可能會(huì)降低其良好的生物相容性。絲素 I結(jié)晶作為一種結(jié)晶結(jié)構(gòu)，同樣不溶于水；但因其結(jié)構(gòu)比絲素II疏松，所以具有一定的生物 可降解性。其生物降解速度介于非結(jié)晶結(jié)構(gòu)和絲素II結(jié)晶結(jié)構(gòu)的絲素蛋白之間，可以在幾 個(gè)月內(nèi)完全降解。因此，可以通過調(diào)控兩種結(jié)晶結(jié)構(gòu)的比例來獲得所需要的材料性能現(xiàn)有技術(shù)中，采用絲素蛋白制備三維多孔支架的方法有鹽析法、冷凍干燥法、靜電 紡絲法以及相分離法等，其中，冷凍干燥法的現(xiàn)有技術(shù)主要有以下報(bào)道，例如(1)公開號(hào)為CN101502669A的中國(guó)發(fā)明專利“絲素蛋白多孔三維支架及其制備方 法”中，公開了一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，先將家蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析、濃 縮后得到質(zhì)量濃度為1 30%的絲素蛋白溶液，其特征在于再進(jìn)行如下步驟的加工第一 步將絲素蛋白溶液注入金屬模具中，在-10 -80°C的低溫條件下經(jīng)1 24小時(shí)的快速冷凍，得到冷凍體；第二步在溫度為_5 _25°C的條件下將上述冷凍體低溫保存2 60天， 得到冷凍結(jié)晶體；第三步對(duì)冷凍結(jié)晶體進(jìn)行解凍處理，得到濕態(tài)絲素蛋白多孔三維材料， 再經(jīng)干燥處理，得到干態(tài)絲素蛋白多孔三維材料。上述技術(shù)方案，采用冷凍干燥法制備三維支架，避免了有機(jī)溶劑使用，但因?yàn)闆]有 對(duì)絲素蛋白溶液進(jìn)行處理，溶液中絲素蛋白沒有形成規(guī)則的納米結(jié)構(gòu)，而冷凍干燥過程中 片狀結(jié)構(gòu)的形成同絲素蛋白在溶液中的微觀納米結(jié)構(gòu)相關(guān)，觀察其電鏡圖片仍可知，所得 支架中仍然存在分離片狀結(jié)構(gòu)，且該技術(shù)方案中蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)無法調(diào)控。(2)公開號(hào)為CN1262579C的中國(guó)發(fā)明專利“絲素蛋白海綿狀三維多孔材料制備方 法”中，需要采用甲醇或者乙醇作為變性劑，促使絲素II結(jié)構(gòu)形成，提高絲素蛋白在水中穩(wěn) 定性，但是，因?yàn)橹饕越z素II結(jié)構(gòu)為主，所以降解緩慢，并且不可調(diào)控微結(jié)構(gòu)中絲素I和 絲素II結(jié)構(gòu)的比例。因此，需要研究發(fā)明一種在綠色溫和條件下制備絲蛋白三維支架的方法，并且可 以通過調(diào)節(jié)制備工藝調(diào)控多孔支架材料的孔徑尺寸，二級(jí)結(jié)構(gòu)的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中所得 絲素蛋白多孔三維材料存在分離片狀結(jié)構(gòu)的缺陷，以及所得絲素蛋白多孔三維材料中絲素 I和絲素II結(jié)構(gòu)的比例無法調(diào)節(jié)的缺陷。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種絲素蛋白多孔三維材料的制備 方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，所述絲素 蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0. 5% 10% ；然后于25 80°C，對(duì)絲素蛋白水溶液進(jìn)行密封培 育處理48 200小時(shí)；(2)將醇和絲素蛋白水溶液混合均勻得到絲素蛋白溶液，所述醇為異丙醇、丙三 醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇或乙二醇中的一種或兩種以上的混合物；(3)將絲素蛋白溶液注入模具中，進(jìn)行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進(jìn)行冷凍 干燥處理，獲得干態(tài)的絲素蛋白多孔材料，所述絲素蛋白多孔材料不溶于水并且含有醇；(4)將絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；(5)將去除醇的絲素蛋白多孔材料再進(jìn)行冷凍干燥處理獲得干態(tài)的純絲素蛋白多 孔材料。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，進(jìn)行透析處理主要是為了過濾除去無機(jī)鹽等雜質(zhì) 分子從而獲得純的絲素蛋白水溶液；在密封培育過程中，絲素蛋白可以自組裝形成納米球， 并且由于密封時(shí)，溶劑水不會(huì)減少，因此形成的納米球之間不會(huì)發(fā)生結(jié)合團(tuán)聚，最終培育得 到了穩(wěn)定的絲素蛋白納米球水溶液，而冷凍干燥過程中片狀結(jié)構(gòu)的形成同絲素蛋白在溶液 中的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，從而避免了分離片狀結(jié)構(gòu)的形成。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，按照質(zhì)量比，絲素蛋白醇=0.05 20 1。隨 著醇含量的提高，有利于結(jié)晶結(jié)構(gòu)Silk I和Silk II的形成；同時(shí)醇種類的變化同樣可以 影響絲素蛋白晶體結(jié)構(gòu)，丙三醇的加入更有利于Silk I的形成，而乙二醇的加入則會(huì)促進(jìn) Silk II含量的提高。
上述技術(shù)方案中，步驟(3)中，冷凍處理的溫度為-10°C _80°C，冷凍處理時(shí)間為 1 48小時(shí)；低溫有利于冰晶的快速形成，從而降低凍干后的孔徑，同時(shí)低溫會(huì)在一定程度 上抑制絲素蛋白結(jié)晶的形成，進(jìn)一步調(diào)控絲素蛋白的晶體組成。根據(jù)實(shí)際需要，優(yōu)選地，冷 凍處理的溫度為_20°C _60°C。上述技術(shù)方案中，步驟(4)中，絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡時(shí)間為0.5 24 小時(shí)。上述技術(shù)方案中，所述冷凍干燥處理是在凍干機(jī)中進(jìn)行的，冷凍干燥又稱升華干 燥，將含水物料冷凍到冰點(diǎn)以下，使水轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，然后在較高真空下將冰轉(zhuǎn)變?yōu)檎魵舛?的干燥方法；該方法的優(yōu)點(diǎn)是在低溫高真空的條件下使樣品中的水分由冰直接升華達(dá)到干 燥的目的，在干燥的過程中不受表面張力的作用，樣品不變形。上述技術(shù)方案中，按常規(guī)方法制備絲素蛋白水溶液的具體方法為以天然家蠶絲 為原料，絲經(jīng)脫膠，中性鹽溶液溶解后用去離子水透析獲得絲素蛋白水溶液；或者以再生絲 素為原料配制絲素蛋白水溶液；優(yōu)選天然家蠶絲。進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案中，在步驟(3)和步驟(4)之間，對(duì)步驟(3)所得絲素蛋 白多孔材料進(jìn)行處理，所述處理方法選自以下處理方法中的一種或兩種以上的組合①采 用真空水蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時(shí)；②采用真空甲醇蒸氣或乙醇蒸氣處 理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時(shí)；③將絲素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇中10分 鐘 24小時(shí)；④將絲素蛋白多孔材料進(jìn)行力學(xué)拉伸處理，拉伸后增加的長(zhǎng)度為材料原長(zhǎng)度 的20% 300%。其中真空水蒸氣處理能夠同時(shí)提高Silk I和Silk II的含量，而其它處 理方式主要提高Silk II的含量，不同處理方式相互結(jié)合，可以對(duì)絲素蛋白中晶體含量進(jìn)行 進(jìn)一步調(diào)控。本發(fā)明的原理是絲素蛋白在水溶液中存在緩慢的自組裝過程，而冷凍干燥過程 中片狀結(jié)構(gòu)的形成同絲素蛋白在溶液中的微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)，本發(fā)明中絲素蛋白溶液的密封培 育過程，調(diào)控絲素蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，使其形成規(guī)則的納米球結(jié)構(gòu)，抑制片狀分離結(jié)構(gòu)的形 成，然后通過冷凍干燥法可以獲得具有良好孔結(jié)構(gòu)的三維多孔支架；同時(shí)絲素蛋白的聚集 態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過在培育過的絲素蛋白水溶液中加入多元醇來調(diào)控，可以促進(jìn)并控制絲素I 和II型晶體結(jié)構(gòu)的形成。經(jīng)過對(duì)上述兩個(gè)過程中的參數(shù)進(jìn)行調(diào)控，就可以直接通過冷凍干 燥法制得具有良好孔結(jié)構(gòu)的不溶于水的絲素蛋白多孔支架材料。另外，通過不同的后處理 過程，對(duì)絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控，就可以獲得具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)和降解性能 的絲素蛋白三維多孔材料。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明通過密封培育過程對(duì)絲素蛋白進(jìn)行調(diào)控，通過形成絲素蛋白納米球 的方法，有效抑制了片狀結(jié)構(gòu)的形成，因此所獲得的多孔支架同其它方法制備的支架相比， 具有更加均勻、結(jié)構(gòu)更好的多孔形態(tài)。2、由于本發(fā)明在制備過程中將無毒的醇添加到絲素蛋白溶液中，促使絲素II結(jié) 構(gòu)形成，從而能夠通過冷凍干燥法直接制得不溶于水的絲素蛋白多孔支架，而不需添加其 它化學(xué)試劑，且醇可通過在水溶液中浸泡直接去除，不會(huì)引起絲素蛋白生物相容性的降低。3、本發(fā)明可以在制備過程中，通過調(diào)節(jié)冷凍溫度、絲素蛋白濃度等工藝參數(shù)，控制 孔的大小，滿足不同應(yīng)用的需要。
4、本發(fā)明可以通過采用可選的后處理過程，進(jìn)一步調(diào)節(jié)絲素蛋白多孔支架的二級(jí) 結(jié)構(gòu)，從而獲得不同的降解性能和力學(xué)性能，以滿足不同組織再生或者不同藥物釋放的要 求。
圖1為實(shí)施例一經(jīng)過密封處理后的絲素蛋白溶液中絲素蛋白的納米結(jié)構(gòu)原子力 顯微鏡照片；圖2為實(shí)施例一和二所得絲蛋白支架材料的紅外光譜圖 得絲素蛋白支架材料；b代表實(shí)施例二所得絲素蛋白支架材料；圖3為實(shí)施例一所得絲蛋白支架材料的電鏡照片；圖4為實(shí)施例八和九所得絲蛋白支架材料的紅外光譜圖 得絲素蛋白支架材料；b代表實(shí)施例七所得絲素蛋白支架材料；圖5為實(shí)施例八所得絲蛋白支架材料的電鏡照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液10mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液，所述絲素蛋白納米球的原子力顯微鏡圖見圖1(由圖1可知，絲素蛋 白主要以納米球形態(tài)存在)；然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍24小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，再冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。對(duì)上述絲蛋白三維支架此支架進(jìn)行電鏡掃描和紅外測(cè)試，結(jié)果見圖2和圖3，從圖 2可見，上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間，從圖2中的a曲線可知，材 料在1646cm—1處有吸收峰，這是Silk I結(jié)構(gòu)的特征峰，所以絲蛋白三維支架的結(jié)構(gòu)主要為 Silk I結(jié)構(gòu)。實(shí)施例二 將50g左右生絲浸入2L 0. 5% Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出， 用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液10mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量60 %的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙
；其中a代表實(shí)施例一所 ；其中a代表實(shí)施例六所烯模具再放入_20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲 素三維支架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支
^K O對(duì)上述絲蛋白三維支架此支架進(jìn)行紅外測(cè)試，結(jié)果見圖2，從圖2中的b曲線可知， 材料在1646CHT1和1629CHT1處有吸收峰，它們分別是SilkI和SilkII結(jié)構(gòu)的特征吸收峰， 因此絲蛋白三維支架的結(jié)構(gòu)主要為Silk I和Silk II結(jié)構(gòu)。上述絲蛋白三維支架中的孔 直徑在100 300微米之間。實(shí)施例三將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液10mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。 然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量40 %的乙二醇，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，在冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架中的 孔直徑在100 300微米之間，主要為Silk I和Silk II。實(shí)施例四將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液10mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-80°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架 中的孔直徑在100 200微米之間，主要為Silk I和Silk II結(jié)構(gòu)。實(shí)施例五將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為1.5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在20 °C密封培育，培育時(shí)間為200小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。
然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-80°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架 中的孔直徑在100 200微米之間，主要為Silk I和Silk II結(jié)構(gòu)。實(shí)施例六將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為0. 5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在60 °C密封培育，培育時(shí)間為200小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架 中的孔直徑在500微米以上，主要為Silk I和SilkII結(jié)構(gòu)。實(shí)施例七將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為4小時(shí)，培育后得到絲素蛋 白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架，然后用去離子水將甘油浸泡出來，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架 中的孔直徑在100-300微米之間，主要為Silk I結(jié)構(gòu)。實(shí)施例八將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，加入去離子水將 濃度調(diào)整為2% (調(diào)整濃度主要是為了調(diào)整制備支架的孔徑，對(duì)其他沒有顯著影響)。培育 后得到絲素蛋白納米球的水溶液。加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。將此支架利用真空水蒸氣處理方法處理6小時(shí)后，用去離子水浸泡24小時(shí)，去除甘油， 再冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。對(duì)上述絲蛋白三維支架此支架進(jìn)行電鏡掃描和紅外測(cè)試，結(jié)果見圖4和圖5，從圖 5可見，上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間，從圖4中的a曲線可知，材 料在1648cm—1和1629cm—1處有吸收峰，分別是Silk I和Silk II結(jié)構(gòu)的特征峰，所以絲蛋 白三維支架的晶體結(jié)構(gòu)主要為Silk I和SilkII結(jié)構(gòu)。實(shí)施例九將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為1.5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為48小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量60%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架。用乙醇溶液替代水溶液，用真空乙醇蒸氣處理6小時(shí)后，用去離子水浸泡20小時(shí)，去除 甘油，進(jìn)一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。對(duì)上述絲蛋白三維支架此支架進(jìn)行紅外測(cè)試，結(jié)果見圖4，從圖4中的b曲線可知， 材料在1629CHT1處有吸收峰，是SilkII結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，因此絲蛋白三維支架的結(jié)構(gòu)主 要為Silk II結(jié)構(gòu)。上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間。實(shí)施例十將50g左右生絲浸入2L 0.5% NaCO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白水溶液濃度為1.5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在30 °C密封培育，培育時(shí)間為200小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量40 %的乙二醇，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-60°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的絲素三維支架，將此 支架在甲醇溶液中直接浸泡0.5小時(shí)，促進(jìn)Silk II的形成。隨后將此在去離子水中浸泡 12小時(shí)，去除乙二醇和甲醇，再次冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架中的孔直徑 在100 300微米之間，主要為SiIkII。實(shí)施例i^一將50g左右生絲浸入2L 0.5% NaCO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中，60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C密封培育12小時(shí)，然后加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì) 量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具，放入-60°C下冷凍48小時(shí)，培育后得到絲素蛋 白納米球的水溶液。然后再放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。將此支架固 定在雙向拉伸裝置上，雙向拉伸100%。隨后在去離子水中浸泡10小時(shí)，去除甘油，進(jìn)一步 冷凍干燥即得到絲蛋白三維支架。此支架中絲素蛋白主要為Silk II結(jié)構(gòu)。實(shí)施例十二 將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個(gè)小時(shí)。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調(diào)整絲素蛋白濃度到6%。取上述絲蛋白溶液20mL，在60°C密封培育，培育時(shí)間為96小時(shí)，培育后得到絲素 蛋白納米球的水溶液。加入占干態(tài)下多孔支架質(zhì)量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時(shí)。然后放入凍干機(jī)干燥48小時(shí)，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。 將此支架利用真空水蒸氣處理方法處理6小時(shí)后，用去離子水浸泡24小時(shí)，去除甘油，再冷 凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此絲素蛋白支架孔徑在100微米以下，主要由SilkI 晶體組成。上述實(shí)施例所得絲素蛋白三維支架材料可應(yīng)用于骨、軟骨、韌帶、神經(jīng)、皮膚等組 織修復(fù)以及藥物緩釋的載體等。
權(quán)利要求
一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，所述絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0.1％～10％；然后于25～80℃，對(duì)絲素蛋白水溶液進(jìn)行密封培育處理48～200小時(shí)；(2)將醇和絲素蛋白水溶液混合均勻得到絲素蛋白溶液，所述醇為異丙醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇或乙二醇中的一種或兩種以上的混合物；(3)將絲素蛋白溶液注入模具中，進(jìn)行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得干態(tài)的絲素蛋白多孔材料，所述絲素蛋白多孔材料不溶于水并且含有醇；(4)將絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；(5)將去除醇的絲素蛋白多孔材料再進(jìn)行冷凍干燥處理獲得干態(tài)的純絲素蛋白多孔材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(1)中，密封培育的溫度為0°C 80°C，密封培育時(shí)間為1 240小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中，按照質(zhì)量比，絲素蛋白醇 =0.05 20 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(3)中，冷凍處理的溫度 為-10°C _80°C，冷凍處理時(shí)間為1 48小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(4)中，絲素蛋白多孔材料在水溶 液中浸泡時(shí)間為0. 5 24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，在步驟(3)和步驟⑷之間，對(duì)步驟(3) 所得絲素蛋白多孔材料進(jìn)行處理，所述處理方法選自以下處理方法中的一種或兩種以上的 組合①采用真空水蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時(shí)；②采用真空甲醇蒸氣或乙 醇蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時(shí)；③將絲素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇 中10分鐘 24小時(shí)；④將絲素蛋白多孔材料進(jìn)行力學(xué)拉伸處理，拉伸后增加的長(zhǎng)度為材料 原長(zhǎng)度的20% 300%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多孔材料及其制備方法，公開了一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，將絲素蛋白水溶液密封培育之后，與醇混合均勻后進(jìn)行冷凍，直接獲得不溶于水的絲素蛋白多孔支架材料，再選擇性地使用后處理手段調(diào)控多孔支架的二級(jí)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，并可通過改變絲蛋白濃度、冷凍溫度等參數(shù)控制多孔材料的孔隙率和孔徑尺寸等，最后將醇去除，獲得純的絲素蛋白多孔支架。本發(fā)明所述制備過程條件溫和，無需加入任何交聯(lián)劑、制孔劑、和其它毒性有機(jī)溶劑，簡(jiǎn)便可控，易于產(chǎn)業(yè)化，并能有效保持絲素蛋白的生物相容性，可應(yīng)用于骨、軟骨、韌帶、神經(jīng)、皮膚等組織修復(fù)以及藥物緩釋的載體等。
文檔編號(hào)A61L27/22GK101891962SQ20101023343
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者盧神州, 呂強(qiáng), 張冰, 李明忠, 王建南 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)