專利名稱：利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗的新方法，尤 其是公開一種利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法，屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，用于遺傳性疾病基因治療和重組活載體疫苗構(gòu)建的載體系統(tǒng)有十余種，其 中DNA病毒載體在疫苗研究中最為常用，主要有腺病毒、皰疹病毒、痘病毒和桿狀病毒等。重組DNA病毒的構(gòu)建策略過去主要基于同源重組原理，包括①細(xì)胞內(nèi)同源重組， 即在兩段基因組DNA分子之間進(jìn)行重組。一旦發(fā)生同源重組，即可得到預(yù)期的重組病毒，無 需純化，但是，重組效率較低。②位點(diǎn)特異性同源重組，即發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的 重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn))和位點(diǎn)特異性的蛋白因子 即重組酶參與催化。重組酶只能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其它任何兩條同源或 非同源序列之間的重組。③細(xì)菌內(nèi)同源重組，即在大腸桿菌內(nèi)通過同源重組的方法構(gòu)建重 組病毒質(zhì)粒載體，經(jīng)酶切線性化后再轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞系，從而得到重組病毒。與哺乳動物 細(xì)胞比較，在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行挑克隆、鑒定等操作更加便利，但是，由于在大腸桿菌中病毒 序列的遺傳選擇壓力較小，發(fā)生突變導(dǎo)致病毒活力下降的可能性高于細(xì)胞內(nèi)重組。④酶切 連接，即在病毒質(zhì)粒中通過連接反應(yīng)插入一個表達(dá)盒，而不是進(jìn)行同源重組。其優(yōu)點(diǎn)是質(zhì) 粒的構(gòu)建和擴(kuò)增快速，轉(zhuǎn)染效率高。不足之處在于在大腸桿菌中病毒序列的遺傳選擇壓力 較小，發(fā)生突變導(dǎo)致病毒活力下降的可能性要高于真核細(xì)胞內(nèi)重組；單一酶切位點(diǎn)比較稀 少，且稀有內(nèi)切酶的價格昂貴。目前，已報道的狂犬病-犬2型腺病毒活載體重組疫苗(扈榮良等，prevention ofrabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2encodingthe rabies virus glycoprotein. Microbes and Infection,2006 ；8 (4) 1090-1097)釆用的是細(xì)菌內(nèi)同源重組和酶切連接方式獲得重組病毒；狂犬病-皰疹病毒I 型^舌^^體重組疫苗(/S榮良等，a recombinant pseudorabies virus expressing rabies virusglycoprotein :safety and immunogenicity in dogs.Vaccine. 2008 ；26 (10) 1314-21)采用的是細(xì)胞內(nèi)同源重組技術(shù)。以上重組病毒的構(gòu)建方法與本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)座機(jī) 制相比，存在重組效率低或易發(fā)生突變的缺點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子(Transposon)又稱跳躍因子，是不必借助于同源片段，在轉(zhuǎn)座酶 (Transposase)的介導(dǎo)下便可在質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與基因組之間轉(zhuǎn)移位置的DNA片段。因?yàn)?具有隨機(jī)重組的特性，轉(zhuǎn)座子已廣泛應(yīng)用于新基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究，以及培育轉(zhuǎn)基因動物等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法，具有高效、廉價和 穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的采用以下技術(shù)解決方案將平行表達(dá)報告基因(如綠色熒光蛋白基因)和保護(hù)性抗原基因(如狂犬病病 毒糖蛋白基因、豬瘟E2基因)的表達(dá)盒通過常規(guī)的分子克隆手段插入帶有轉(zhuǎn)座子序列的穿 梭載體(如PM0D-2<MCS>)，該插入位點(diǎn)的兩側(cè)為轉(zhuǎn)座子序列；然后，利用限制性內(nèi)切酶將 帶有基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子從穿梭載體游離，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化；再利用轉(zhuǎn)座酶反應(yīng) 體系處理(37°C，2小時)純化的轉(zhuǎn)座子和載體病毒的全基因組，反應(yīng)結(jié)束后加入終止液，并 經(jīng)70°C滅活10分鐘；最后，利用脂質(zhì)體等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑將反應(yīng)物轉(zhuǎn)染載體病毒的包裝 細(xì)胞，獲得表達(dá)外源基因的重組病毒；經(jīng)蝕斑克隆或有限稀釋法純化后，即可作為重組疫苗 免疫動物。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法，其特征在于在轉(zhuǎn)座酶的作 用下，使攜帶外源基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子與載體病毒的全基因組發(fā)生重組，然后將重組產(chǎn)物 轉(zhuǎn)染病毒的包裝細(xì)胞，獲得表達(dá)外源基因的重組病毒，經(jīng)常純化后制成重組疫苗。所述的方法，其特征在于利用轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的DNA重組機(jī)制，構(gòu)建犬2型 腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗。所述的方法，其特征在于利用綠色熒光蛋白報告基因和狂犬病病毒糖蛋白保護(hù) 性抗原基因、豬瘟病毒E2保護(hù)性抗原基因，在轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)作用下，將平行表達(dá) 報告基因和保護(hù)性抗原基因的表達(dá)盒插入載體病毒的全基因組，并在細(xì)胞中獲得表達(dá)。所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒I型DNA病毒，在轉(zhuǎn)座子 和轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)作用下，對其基因組進(jìn)行改造，并獲得表達(dá)外源基因的重組病毒。所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒的包裝細(xì)胞MDCK和 Vero，將轉(zhuǎn)座子與載體病毒全基因組的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝出重組病毒。本發(fā)明的具體構(gòu)建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗的方法，包括以 下步驟1.基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用商品化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESneo，通過常規(guī)的分子克隆技術(shù)構(gòu)建平行表 達(dá)報告基因(如綠色熒光蛋白基因)和保護(hù)性抗原基因(如狂犬病病毒糖蛋白基因、豬 瘟E2基因)的表達(dá)盒。2.重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過常規(guī)的酶切、連接和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將表達(dá)盒克隆至帶有轉(zhuǎn)座子序列的商品化穿 梭載體pM0D-2<MCS>，插入位點(diǎn)為兩段轉(zhuǎn)座子序列之間的多克隆酶切位點(diǎn)(圖1)。3.轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)酶切游離(圖1)和瓊脂糖凝 膠電泳純化后，與載體病毒全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系，37°C反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束 后加入終止液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性。4.重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與載體病毒全基因組的反應(yīng)物，在轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體等)的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染 載體病毒的包裝細(xì)胞，包裝重組病毒。5.重組病毒的純化與鑒定利用蝕斑克隆或有限稀釋法對重組病毒進(jìn)行亞克隆3 5次，獲得純化的重組病毒。利用針對外源基因的免疫學(xué)方法(抗原或抗體檢測)或Southern雜交對重組病毒進(jìn) 行鑒定。
圖1為EPICENTRE Biotechnologies公司的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體；圖2為CL0NTECH公司的真核表達(dá)質(zhì)粒載體。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而 非對本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1 狂犬病-重組犬2型腺病毒的制備方法1.綠色熒光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用商品化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點(diǎn)EcoRV和 BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列參照GenBank :M31046)，利用Sma I和Xbal位點(diǎn) 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質(zhì)粒pEGPF-Cl)，構(gòu)建平行表達(dá)糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達(dá)盒。2.重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過Nru I和Bstll07 I位點(diǎn)將基因表達(dá)盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉(zhuǎn)座子序列之間的Sma I位點(diǎn)(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)座子。3.轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)商品化轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與犬2型腺病毒全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系中，37°C反應(yīng)2 小時，反應(yīng)結(jié)束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性。轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系(lOiU) 反應(yīng)緩沖液，0. 2iig腺病毒基因組DNA，0. 2iig重 組轉(zhuǎn)座子DNA，5U轉(zhuǎn)座酶，滅菌四餾水補(bǔ)至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與犬2型腺病毒全基因組的重組產(chǎn)物，在脂質(zhì)體2000 (Invitrogen產(chǎn)品) 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，直到出現(xiàn)典型葡萄串狀細(xì)胞病變。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細(xì)胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進(jìn)行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細(xì)胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5條狂犬病抗體陰性成年犬(雌雄隨機(jī))，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)檢 測血清狂犬病中和抗體滴度，以中和抗體有無為標(biāo)準(zhǔn)，判定重組病毒是否表達(dá)狂犬病病毒 糖蛋白(表1)。表1重組犬腺病毒免疫試驗(yàn) 以上結(jié)果表明，重組病毒在犬體內(nèi)表達(dá)了糖蛋白，并能誘導(dǎo)抗狂犬病病毒感染的 免疫反應(yīng)。實(shí)施例2 狂犬病-重組皰疹病毒I型的制備方法1.綠色熒光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用商品化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點(diǎn)EcoRV和 BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列參照GenBank :M31046)，利用Sma I和Xba I位點(diǎn) 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質(zhì)粒pEGPF-Cl)，構(gòu)建平行表達(dá)糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達(dá)盒。2.重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過Nru I和Bstll07 I位點(diǎn)將基因表達(dá)盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉(zhuǎn)座子序列之間的Sma I位點(diǎn)(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)座子。3.轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)商品化轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)PvuII酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與皰疹病毒I型全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系中，37°C反應(yīng)2 小時，反應(yīng)結(jié)束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性。轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系(10 ill) 反應(yīng)緩沖液，0. 2iig皰疹病毒基因組DNA，0. 2iig 重組轉(zhuǎn)座子DNA，5U轉(zhuǎn)座酶，滅菌四餾水補(bǔ)至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與皰疹病毒I型全基因組的重組產(chǎn)物，在脂質(zhì)體2000 (Invitrogen產(chǎn)品) 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，直到出現(xiàn)典型病變(細(xì)胞變圓脫落)。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細(xì)胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進(jìn)行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細(xì)胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5條狂犬病抗體陰性成年犬(雌雄隨機(jī))，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)檢 測血清狂犬病中和抗體滴度，以中和抗體有無為標(biāo)準(zhǔn)，判定重組病毒是否表達(dá)狂犬病病毒 糖蛋白(表2)。表2重組皰疹病毒免疫試驗(yàn) 以上結(jié)果表明，重組病毒在犬體內(nèi)表達(dá)了糖蛋白，并能誘導(dǎo)抗狂犬病病毒感染的 免疫反應(yīng)。實(shí)施例3 豬瘟-重組犬2型腺病毒的制備方法1.綠色熒光蛋白和豬瘟病毒E2蛋白基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用商品化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點(diǎn)EcoRV和 BamHI插入豬瘟病毒E2蛋白基因(序列參照GenBank :AF091507)，利用Smal和Xbal位點(diǎn) 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質(zhì)粒pEGPF-Cl)，構(gòu)建平行表達(dá)糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達(dá)盒。2.重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過Nru I和Bstll07 I位點(diǎn)將基因表達(dá)盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉(zhuǎn)座子序列之間的Sma I位點(diǎn)(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)座子。3.轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)商品化轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與犬2型腺病毒全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系中，37°C反應(yīng)2 小時，反應(yīng)結(jié)束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性。轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系(lOiU) 反應(yīng)緩沖液，0. 2iig腺病毒基因組DNA，0. 2iig重 組轉(zhuǎn)座子DNA，5U轉(zhuǎn)座酶，滅菌四餾水補(bǔ)至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與犬2型腺病毒全基因組的重組產(chǎn)物，在脂質(zhì)體2000 (Invitrogen產(chǎn)品) 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，直到出現(xiàn)典型葡萄串狀細(xì)胞病變。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細(xì)胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進(jìn)行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細(xì)胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5頭豬瘟抗體陰性的試驗(yàn)豬(雌雄隨機(jī))，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用細(xì)胞中和試驗(yàn)和直接免疫熒光法檢測血清 豬瘟病毒中和抗體滴度(以血清稀釋度1 2X表示)，以中和抗體有無為標(biāo)準(zhǔn)，判定重組病 毒是否表達(dá)E2蛋白(表3)。表3重組犬2型病毒免疫試驗(yàn) 以上結(jié)果表明，重組病毒在豬體內(nèi)表達(dá)了 E2蛋白，并能誘導(dǎo)抗豬瘟病毒感染的免 疫反應(yīng)。實(shí)施例4 豬瘟-重組皰疹病毒I型的制備方法1.綠色熒光蛋白和豬瘟病毒E2蛋白基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用商品化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點(diǎn)EcoRV和 BamHI插入豬瘟病毒E2蛋白基因(序列參照GenBank :AF091507)，利用Sma I和Xba I位 點(diǎn)插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質(zhì)粒PEGPF-C1)，構(gòu)建平行表達(dá)糖蛋白和綠 色熒光蛋白基因的表達(dá)盒。2.重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過Nru I和Bstll07 I位點(diǎn)將基因表達(dá)盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉(zhuǎn)座子序列之間的Sma I位點(diǎn)(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)座子。3.轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)商品化轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與皰疹病毒I型全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系中，37°C反應(yīng)2 小時，反應(yīng)結(jié)束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性。轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系(10 ill) 反應(yīng)緩沖液，0. 2iig皰疹病毒基因組DNA，0. 2iig 重組轉(zhuǎn)座子DNA，5U轉(zhuǎn)座酶，滅菌四餾水補(bǔ)至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與皰疹病毒I型全基因組的重組產(chǎn)物，在脂質(zhì)體2000 (Invitrogen產(chǎn)品) 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，直到出現(xiàn)典型病變(細(xì)胞變圓脫落)。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細(xì)胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進(jìn)行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細(xì)胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5頭豬瘟抗體陰性的試驗(yàn)豬(雌雄隨機(jī))，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用細(xì)胞中和試驗(yàn)和直接免疫熒光法檢測血清 中的豬瘟病毒中和抗體滴度(以血清稀釋度1 2X表示)，以中和抗體有無為標(biāo)準(zhǔn)，判定重 組病毒是否表達(dá)E2蛋白(表4)。表4重組皰疹病毒I型免疫試驗(yàn) 以上結(jié)果表明，重組病毒在豬體內(nèi)表達(dá)了 E2蛋白，并能誘導(dǎo)抗豬瘟病毒感染的免 疫反應(yīng)。
權(quán)利要求
一種利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法，其特征為在轉(zhuǎn)座酶的作用下，使攜帶外源基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子與載體病毒的全基因組發(fā)生重組，然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)染病毒的包裝細(xì)胞，獲得表達(dá)外源基因的重組病毒，經(jīng)常純化后制成重組疫苗。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的DNA重組機(jī)制，構(gòu) 建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用綠色熒光蛋白報告基因和狂犬病病毒糖 蛋白保護(hù)性抗原基因、豬瘟病毒E2保護(hù)性抗原基因，在轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)作用下，將 平行表達(dá)報告基因和保護(hù)性抗原基因的表達(dá)盒插入載體病毒的全基因組，并在細(xì)胞中獲得 表達(dá)。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒I型DNA病毒， 在轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)作用下，對其基因組進(jìn)行改造，并獲得表達(dá)外源基因的重組病毒。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒的包裝細(xì)胞 MDCK和Vero，將轉(zhuǎn)座子與載體病毒全基因組的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝出重組病毒。
6.權(quán)利要求1所述的方法，包括以下步驟1)基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESneo，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建平行表達(dá)報告基因(如綠 色熒光蛋白基因)和保護(hù)性抗原基因(如狂犬病病毒糖蛋白基因、豬瘟E2基因)的表達(dá).品. 2)重組轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建通過常規(guī)的酶切、連接和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將表達(dá)盒克隆至帶有轉(zhuǎn)座子序列的商品化穿梭載 體pM0D-2<MCS>，插入位點(diǎn)為兩段轉(zhuǎn)座子序列之間的多克隆酶切位點(diǎn)；3)轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉(zhuǎn)座子經(jīng)酶切游離和瓊脂糖凝膠電泳純化 后，與載體病毒全基因組等量加入轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)體系，37°C反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后加入終止 液，70°C 10分鐘滅活轉(zhuǎn)座酶活性；4)重組病毒的包裝將轉(zhuǎn)座子與載體病毒全基因組的反應(yīng)物，在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染載體病毒的包裝 細(xì)胞，包裝重組病毒；5)重組病毒的純化與鑒定利用蝕斑克隆或有限稀釋法對重組病毒進(jìn)行亞克隆3 5次，獲得純化的重組病毒；利 用針對外源基因的免疫學(xué)方法或Southern雜交對重組病毒進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病毒活載體重組疫苗的方法，以綠色熒光蛋白為報告基因、分別構(gòu)建表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白和豬瘟E2蛋白基因的表達(dá)盒，并克隆至轉(zhuǎn)座子穿梭載體，在轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)作用下，分別與提純的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型全基因組發(fā)生重組，再利用轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體等)將重組產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)染MDCK和Vero細(xì)胞，即可獲得4株以綠色熒光蛋白為報告基因的重組病毒，即表達(dá)糖蛋白的重組犬2型腺病毒、表達(dá)E2蛋白的重組犬2型腺病毒、表達(dá)糖蛋白的重組皰疹病毒I型和表達(dá)E2蛋白的重組皰疹病毒I型。免疫試驗(yàn)證明，表達(dá)E2基因的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗均可在豬體內(nèi)誘導(dǎo)抗豬瘟病毒感染的免疫反應(yīng)，表達(dá)糖蛋白基因的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗均可在犬體內(nèi)誘導(dǎo)抗狂犬病病毒感染的免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K39/187GK101850116SQ20101020232
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者劉曄, 張守峰, 張菲, 扈榮良, 范志強(qiáng) 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所