專利名稱：利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方 法。
背景技術(shù)：
新疆紫草Arnebia euchroma(Royle) Johnst是多年生藥用植物，紫草的主要成分 為紫草素，是萘醌類化合物，是紫草中臨床藥效最好的一種，其有效成分為紫草素及其衍生 物，具有顯著的抗生育、抗炎、抗腫瘤、殺菌抗病毒、保肝和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，同時(shí)作為 色素可用于化妝品、食品及印染，在醫(yī)藥、食品、化妝品、印染領(lǐng)域有著巨大的市場(chǎng)潛力。新 疆紫草占全國資源量的80%以上，是國內(nèi)外商品紫草的主要來源。但新疆紫草依賴種子繁 殖，生長(zhǎng)3-5年才開花、結(jié)果，且種子成熟度和發(fā)芽率較低，自然修復(fù)緩慢，加之近年來大規(guī) 模的無序采挖，產(chǎn)量也直線下降，年采挖量不足20噸，使新疆紫草野生資源處于瀕危的邊 緣，對(duì)新疆的生態(tài)環(huán)境已造成極大破壞，為此，我國早在1996年就已將新疆紫草列為國家 二級(jí)保護(hù)植物。為拓寬新疆紫草的開發(fā)利用途徑，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了硬紫草的田間栽培、新 疆紫草及硬紫草的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、紫草素人工合成等許多研究。目前新疆紫草大面積人 工栽培尚未見報(bào)道，且由于此法占用耕地、生長(zhǎng)緩慢，藥材產(chǎn)量低，有效成分低，受生態(tài)環(huán)境 影響，同時(shí)藥用植物的大田栽培往往使用大量的農(nóng)藥，造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留和重金屬殘留 問題，不能滿足市場(chǎng)需求而受到限制。日本早在20世紀(jì)80年代中期已實(shí)現(xiàn)了紫草細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)紫草素。但是，利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素還存在一些問題，如細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞 容易聚集，細(xì)胞遺傳與生理易變異，細(xì)胞代謝途徑和代謝產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系復(fù)雜，隨 生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大紫草素產(chǎn)量不穩(wěn)定或呈降低趨勢(shì)，生產(chǎn)時(shí)間過長(zhǎng)和生產(chǎn)成本過高等問題， 限制了其工業(yè)化的發(fā)展。因此，尋找一種新的生產(chǎn)紫草素及其衍生物的方法以解決市場(chǎng)的 需求勢(shì)在必行。毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri質(zhì)粒誘發(fā)的結(jié)果，具 有生長(zhǎng)迅速，分支多，在無激素培養(yǎng)基上能夠自主、持續(xù)生長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定 的特性，為藥用植物次生代謝產(chǎn)物(如藥物、天然色素、香料、天然調(diào)味品等)的工業(yè)化生產(chǎn) 提供了一條有效途徑。目前轉(zhuǎn)化成功的植物已有200多種，人參、黃連等已能通過毛狀根培 養(yǎng)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。新疆紫草毛狀根國內(nèi)未見報(bào)道。利用新疆紫草毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)， 以代替天然新疆紫草，生產(chǎn)有效成分紫草素，對(duì)保護(hù)其野生資源和生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)新疆紫草 的產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，該方法包 括新疆紫草外植體的選擇和處理、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)、子葉外植體的感染和毛狀根的 誘導(dǎo)、無菌新疆紫草毛狀根根系的獲得及新疆紫草毛狀根的液體培養(yǎng)及紫草素的提取等步 驟，是利用生長(zhǎng)階段快速繁殖的毛狀根為試材，采用M-9液體培養(yǎng)基作為生產(chǎn)紫草素的培 養(yǎng)基，從而利用培養(yǎng)的毛狀根達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫草素的目的。由于誘導(dǎo)出的毛狀根具有在培養(yǎng)基上快速自主生長(zhǎng)的特性，因而它能克服利用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)緩慢、需外 加激素維持其生長(zhǎng)的不足，而且具有培養(yǎng)時(shí)操作簡(jiǎn)便、紫草素產(chǎn)量穩(wěn)定、成本低、不受氣候、 土地等自然條件的限制等優(yōu)點(diǎn)。尤其為利用毛狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)紫草素提供了一種穩(wěn)定、可 持續(xù)的新型藥源，為今后應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行紫草素規(guī)模化生產(chǎn)提供了可靠的材料來源和 物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)保護(hù)新疆紫草野生資源及其進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。
本發(fā)明所述的一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，下列步驟進(jìn)行新疆紫草毛狀根的誘導(dǎo)a、將新疆紫草種子用75%酒精消毒30s-60s，再用0. 升汞表面消毒5-lOmin， 無菌水充分漂洗后過夜，再用抗生素頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上， 溫度25°C 士 1°C，黑暗環(huán)境培養(yǎng)15-20d，得到無菌苗，切取無菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固 體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑暗環(huán)境中1/2MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，待用；b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落 接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，轉(zhuǎn)速160-180r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，所得菌液置于溫 度4°C，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心5-lOmin，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于 感染；C、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固 體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑 暗培養(yǎng)形成毛狀根；d、將步驟c的毛狀根剪取2-3cm，轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行 單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無菌為止，再采用PCR、rolC基因 序列分析和Southern分子雜交對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)e、將步驟d毛狀根接種于無銨的MS或SH或1/2MS液體培養(yǎng)基中，加入0. 5_lg/ L酸水解酪蛋白，肌醇lg/L，15-30g/L的蔗糖，pH值5. 6-6.0，溫度25士 1 °C，轉(zhuǎn)速為 100-120r/min的條件下進(jìn)行振蕩、黑暗培養(yǎng)12_15d ；新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素f、將步驟e生長(zhǎng)的毛狀根接種于含酸水解酪蛋白0.5-lg/L和蔗糖15_30g/L 的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-15d，添加大孔吸附樹脂NKA-91g/瓶，pH值為5. 6-6. 0，溫度 25士 1°C，轉(zhuǎn)速100-120rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，25_30d為一個(gè)培養(yǎng)周期，取出毛狀根，溫度 50°C烘干，研磨成粉，用濃度95%乙醇浸提3次，合并提取液，濃縮，即可得到紫草膏。步驟a中子葉切塊是在無菌條件下，將子葉切成0. 2-0. 5cm2的小塊或?qū)⒆尤~周圍 切除。步驟a、步驟c和步驟b中所用抗生素頭孢噻肟鈉的濃度為500-1000mg/L。本發(fā)明所述的方法，所述步驟a的子葉外植體在預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行的黑暗培養(yǎng)是將 外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，時(shí)間24-48h，所述的預(yù)培養(yǎng)基為1/2MS固體培
養(yǎng)基；所述步驟b發(fā)根農(nóng)桿菌菌液是將發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440菌株置于YEB液體培養(yǎng)基中， 在溫度28°C、160-180r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；然后將菌液進(jìn)行離心棄上清液，用 無激素MS培養(yǎng)基重懸并稀釋到OD = 0. 3-0. 7，所述OD值為農(nóng)桿菌菌液在600nm光波下的光吸收值；所述步驟c中的預(yù)培養(yǎng)子葉外植體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是將預(yù)培養(yǎng)后的子 葉外植體浸泡到發(fā)根農(nóng)桿菌(MSU440)菌液中，浸泡5-15min，以進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；所述步 驟c中的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植體的共培養(yǎng)是將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植 體接種于共培養(yǎng)基上，在25°C 士 1°C下24-48h ；其中共培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基；所述步驟c中的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植體進(jìn)行共培養(yǎng)后的外植體再進(jìn)行抑菌 繼代培養(yǎng)是將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植體進(jìn)行共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中，在 250C 士 1°C黑暗中進(jìn)行至少五次繼代抑菌培養(yǎng)，直至將菌除凈；所述的抑菌培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，其中大量元素減半、抗生素頭孢噻肟鈉 500-1000mg/L ；所述步驟e中將具有毛狀根的外植體接入毛狀根生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò) 大培養(yǎng)是將抑菌培養(yǎng)的具有毛狀根的外植體轉(zhuǎn)入毛狀根生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，溫度25V 士 1°C、 轉(zhuǎn)速100-120r/min、黑暗中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)，液體培養(yǎng)12_15d后毛狀根的生長(zhǎng)量達(dá) 峰值，是起始接種量的20-30倍。所述的毛狀根生長(zhǎng)培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基、酸水解酪蛋白0. 5-lg/L、肌醇lg/L 和蔗糖15-30g/L。所述步驟f中經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)接入紫草素生產(chǎn)培養(yǎng)基中進(jìn)行紫草素 的生產(chǎn)，是將在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入紫草素生產(chǎn)培養(yǎng)基中，溫度 250C 士 1°C，轉(zhuǎn)速100-120r/min、黑暗中進(jìn)行紫草素生產(chǎn)，培養(yǎng)25-30d時(shí)紫草素含量達(dá)峰 值，為干重的1-1.5%，用95%的乙醇提取毛狀根中的紫草素。所述的毛狀根生產(chǎn)培養(yǎng)基為M-9基本培養(yǎng)基，酸水解酪蛋白0. 5-lg/L和蔗糖 15-30g/L。本發(fā)明所述的方法中，MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog 1962)是本領(lǐng)域常用培 養(yǎng)基；YEB培養(yǎng)基是基因工程領(lǐng)域常用的用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基；本實(shí)驗(yàn)所選用的發(fā)根農(nóng) 桿菌MSU440菌株由朱金虎博士惠贈(zèng)；rolC基因引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成； Marker 2000購自北京天為科技時(shí)代；所用抗生素頭孢噻肟鈉由醫(yī)院藥房購得。本發(fā)明所述的利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，該方法中對(duì)新疆紫草毛狀 根生長(zhǎng)和新疆紫草毛狀根紫草素生產(chǎn)的條件為1、新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)的條件通過對(duì)不同溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基、pH值、碳源等影響毛狀根生長(zhǎng)因子的研究，結(jié)果表 明，毛狀根接種量為0. 5g，接種于裝有50mL無銨的SH液體培養(yǎng)基的IOOmL錐形瓶中，加入 lg/L酸水解酪蛋白替代NH4+,肌醇lg/L，15g/L的蔗糖，pH值為5. 8，于25 士 1 °C，120 士 5rpm 的條件下可促進(jìn)和調(diào)控毛狀根生長(zhǎng)，12d為一個(gè)培養(yǎng)周期，毛狀根增殖10. 26倍，為毛狀根 紫草素生產(chǎn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。2、新疆紫草毛狀根紫草素生產(chǎn)條件通過對(duì)培養(yǎng)基、L-苯丙氨酸、瓊脂糖、油菜素內(nèi)酯、酸水解酪蛋白、真菌誘導(dǎo)子等影 響毛狀根紫草素合成因子的研究，并采用浸提法提取紫草素，分光光度法測(cè)定紫草素含量， 結(jié)果表明，將經(jīng)過一個(gè)生長(zhǎng)周期生長(zhǎng)的毛狀根按接種量為3g接種于裝有50mL M-9液體培 養(yǎng)基的IOOmL錐形瓶中，并添加0. 5g/L酸水解酪蛋白，25g/L的蔗糖，pH值為5. 8，培養(yǎng)在25 士 1°C，120 士 5rpm的條件下，25d為一個(gè)培養(yǎng)周期，使毛狀根中紫草素含量從固體培養(yǎng)及 生長(zhǎng)階段的0. 33%左右提高到1. 20%，紫草素含量最高達(dá)1. 60%，說明毛狀根紫草素含量 可通過理化因子進(jìn)行調(diào)控。3、大孔吸附樹脂對(duì)毛狀根紫草素含量的影響通過在M-9液體培養(yǎng)中添加大孔吸附樹脂并進(jìn)行不同型號(hào)、添加時(shí)間及IAA、真菌 誘導(dǎo)子等條件優(yōu)化研究，采用柱層析、浸提法提取紫草素，分光光度法測(cè)定紫草素含量，結(jié) 果表明，毛狀根在M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOd時(shí)添加大孔吸附樹脂NKA-91g/瓶，培養(yǎng)35d 后收獲毛狀根，大孔吸附樹脂及毛狀根中的紫草素總含量為3. 64%，最高達(dá)3. 90%。說明 大孔吸附樹脂可明顯提高紫草素含量，是提高紫草素含量的 主要調(diào)控因子。4、毛狀根中紫草素的RP-HPLC測(cè)定RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆紫草毛狀根Aehrf07株系、原產(chǎn)地溫泉野生根的總紫草 素中有效成分_乙酰紫草素和β，β ‘ -二甲基丙烯酰紫草素的含量，結(jié)果表明，毛狀根中 β，β ‘ - 二甲基丙烯酰紫草素含量較低，為0.010% ；添加大孔吸附樹脂和黑曲霉誘導(dǎo)子 培養(yǎng)得到的毛狀根中乙酰紫草素的含量最高(0.932%)，接近原植物根中的含量。采用石 油醚提取毛狀根中總紫草素，提取物中β，β' -二甲基丙烯酰紫草素和乙酰紫草素的提 取率比用乙醇試驗(yàn)提取率高。本發(fā)明所述的利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法與已有技術(shù)相比其特點(diǎn) 為(1)應(yīng)用新疆紫草毛狀根大量培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素與栽培和野生的植物相比，可獲得 穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受環(huán)境氣候的限制。(2)由發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的新疆紫草毛狀根在無激素培養(yǎng)基上能夠快速、自主生長(zhǎng)， 因而它克服了利用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)緩慢、需外加激素維持其生長(zhǎng)，以及容易產(chǎn) 生生理變異的不足，因而使得紫草素的質(zhì)量和產(chǎn)量可持續(xù)獲得。(3)利用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素，不占用耕地，可在室內(nèi)進(jìn)行工廠化、規(guī)?；a(chǎn)。(3)可以通過調(diào)控毛狀根的生長(zhǎng)和紫草素的合成以提高紫草素的產(chǎn)量。
(4)該項(xiàng)技術(shù)不使用光照，在黑暗中進(jìn)行毛狀根培養(yǎng)，可節(jié)省電力，減少成本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1a、將新疆紫草種子用75%酒精消毒30s，再用0. 1 %升汞表面消毒5min，無菌水充 分漂洗后過夜，再用500mg/L的頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度 250C 士 1°C，黑暗環(huán)境培養(yǎng)15d，得到所需的無菌苗待用，切取0. 2cm2的小塊無菌苗幼嫩子 葉，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑暗環(huán)境預(yù)培養(yǎng)2d，待用；b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落 接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，轉(zhuǎn)速120r/min，振蕩培養(yǎng)一晝夜，所得菌液置于溫度 4°C，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心5min，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于感染；C、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，于室溫下浸泡5min取出，用無 菌濾紙吸干表面多余水分和菌液，于1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟 鈉500mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑暗培養(yǎng)形成毛狀根，2周后，從子葉外植體傷口處產(chǎn)生紅色的根，產(chǎn)生毛狀根的子葉外植體百分?jǐn)?shù)約為19% ；d、將步驟c的毛狀根剪取2cm，轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉500mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無菌為止，再用PCR技 術(shù)對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；對(duì)毛狀根進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢 測(cè)，以確定T-DNA的插入，以發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440菌株為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)化根為陰性對(duì)照，設(shè) 計(jì)roLC基因的特異性引物，利用PCR技術(shù)，從毛狀根的總DNA中擴(kuò)增到586bp的特異DNA 片段，從分子水平證明了 RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色體組中；同時(shí)將經(jīng)過PCR擴(kuò)增的呈陰性的新疆紫草毛狀根中rolC基因進(jìn)行正反鏈測(cè)序， 結(jié)果兩個(gè)序列有97%相吻合，其中正向測(cè)序序列與GENEBANK中Slightom J. L.等報(bào)道的 pRiA4質(zhì)粒rolC基因序列完全一致，同源性達(dá)到100%，進(jìn)一步確認(rèn)了 rolC基因被整合進(jìn) 了新疆紫草毛狀根中；對(duì)PCR陽性株進(jìn)行Southern斑點(diǎn)雜交，結(jié)果顯示呈陽性，最終確認(rèn) rolC基因被整合進(jìn)了新疆紫草毛狀根中；新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)e、將步驟d毛狀根接種于50mL無銨的MS液體培養(yǎng)基中，加入0. 5g/L酸水解酪蛋 白、肌醇lg/L和15g/L的蔗糖，pH值5. 6，溫度25士 1°C，轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下進(jìn)行振 蕩、黑暗培養(yǎng)12d;新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素f、將步驟e除菌完全、生長(zhǎng)速度快、PCR檢測(cè)呈陽性的毛狀根接種于50mL含0. 5g/ L酸水解酪蛋白和蔗糖15g/L的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，添加大孔吸附樹脂NKA-91g/ 瓶，PH值為5. 6，溫度25士 1°C，轉(zhuǎn)速IOOrpm的條件下進(jìn)行振蕩、黑暗培養(yǎng)，25d為一個(gè)培養(yǎng) 周期，取出毛狀根，溫度50°C烘干，研磨成粉80目，用濃度95%乙醇浸提3次，合并提取液， 濃縮，即可得到紫草膏，用分光光度法測(cè)定毛狀根中紫草素含量為干重的1-1.5%。實(shí)施例2a、將新疆紫草種子用75%酒精消毒45s，再用0. 1 %升汞表面消毒滅菌8min，無菌 水充分漂洗后過夜，再用500mg/L的頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上至 萌發(fā)，再將無菌苗幼嫩子葉子葉周圍切除，并接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上溫度25°C 士 1°C， 黑暗環(huán)境培養(yǎng)18d，切取0. 5cm2的小塊無菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度 250C 士 1°C，黑暗環(huán)境預(yù)培養(yǎng)2d，待用；b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落 接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，轉(zhuǎn)速135r/min，振蕩培養(yǎng)一晝夜，所得菌液置于溫度 4°C，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心8min，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于感染；C、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，于室溫下浸泡IOmin取出，用無 菌濾紙吸干表面多余水分和菌液，與1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟 鈉800mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑暗培養(yǎng)形成毛狀根，2周后，從子葉 外植體傷口處產(chǎn)生紅色的根，產(chǎn)生毛狀根的子葉外植體百分?jǐn)?shù)約為19% ；d、將步驟c的毛狀根剪取3cm，轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉800mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基 上，進(jìn)行單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無菌為止，再用PCR技 術(shù)對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；對(duì)毛狀根進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢 測(cè)，以確定T-DNA的插入，以發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440菌株為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)化根為陰性對(duì)照，設(shè)計(jì)rolC基因的引物，利用PCR技術(shù)，從毛狀根的總DNA中擴(kuò)增到586bp的特異DNA片段，從 分子水平證明了 RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色體組中；同時(shí)將經(jīng)過PCR擴(kuò)增的呈陽性的新疆紫草毛狀根中rolC基因進(jìn)行正反鏈測(cè)序， 結(jié)果兩個(gè)序列有97%相吻合，其中正向測(cè)序序列與GENEBANK中Slightom J. L.等報(bào)道的 pRiA4質(zhì)粒rolC基因序列完全一致，同源性達(dá)到100%，進(jìn)一步確認(rèn)了 rolC基因被整合進(jìn) 了新疆紫草毛狀根中；
新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)e、將步驟d毛狀根接種于50mL無銨的SH基本培養(yǎng)基上，加入酸水解酪蛋白0. Sg/ L、肌醇lg/L和蔗糖25g/L，pH值5.8，溫度25 士 1°C，轉(zhuǎn)速為llOr/min的條件下進(jìn)行振蕩、 黑暗培養(yǎng)14d ；新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素f、將步驟e除菌完全、生長(zhǎng)速度快、PCR檢測(cè)呈陽性的毛狀根接種于50mL含0. Sg/ L酸水解酪蛋白和蔗糖23g/L的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，添加大孔吸附樹脂NKA_91g/ 瓶，PH值為5. 8，溫度25 士 1°C，轉(zhuǎn)速IlOrpm的條件下進(jìn)行振蕩黑暗培養(yǎng)，28d為一個(gè)培養(yǎng)周 期，取出毛狀根，50°C烘干，研磨成粉90目，用濃度95%乙醇浸提3次，合并提取液，濃縮，即 可得到紫草膏，用分光光度法測(cè)定毛狀根中紫草素含量為干重的1-1. 5%。實(shí)施例3a、將新疆紫草種子用75%酒精消毒60s，再用0. 升汞表面消毒滅菌lOmin， 無菌水充分漂洗后過夜，再用500mg/L的頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng) 基上至萌發(fā)，再將無菌苗幼嫩子葉切成0. 5cm2的小塊，并接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上溫度 250C 士 1°C，黑暗環(huán)境培養(yǎng)20d，得到所需的無菌苗待用；切取子葉周圍切除無菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度 250C 士 1°C，黑暗環(huán)境預(yù)培養(yǎng)2d，待用；b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落 接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，轉(zhuǎn)速150r/min，振蕩培養(yǎng)一晝夜，所得菌液置于溫度 4°C，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心lOmin，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于感 染；C、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，于室溫下浸泡15min取出，用無 菌濾紙吸干表面多余水分和菌液，與1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟 鈉1000mg/L的V2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25°C 士 1°C，黑暗培養(yǎng)形成毛狀根，2周后，從子葉 外植體傷口處產(chǎn)生紅色的根，產(chǎn)生毛狀根的子葉外植體百分?jǐn)?shù)約為19% ；d、將步驟c的毛狀根剪取2. 5cm,轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉1000mg/L的1/2MS固體培養(yǎng) 基上，進(jìn)行單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無菌為止，再用PCR技 術(shù)對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；對(duì)毛狀根進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢 測(cè)，以確定T-DNA的插入，以發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440菌株為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)化根為陰性對(duì)照，設(shè) 計(jì)rolC基因的引物，利用PCR技術(shù)，從毛狀根的總DNA中擴(kuò)增到586bp的特異DNA片段，從 分子水平證明了 RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色體組中；同時(shí)將經(jīng)過PCR擴(kuò)增的呈陽性的新疆紫草毛狀根中rolC基因進(jìn)行正反鏈測(cè)序， 結(jié)果兩個(gè)序列有97%相吻合，其中正向測(cè)序序列與GENEBANK中Slightom J. L.等報(bào)道的pRiA4質(zhì)粒rolC基因序列完全一致，同源性達(dá)到100%，進(jìn)一步確認(rèn)了 rolC基因被整合進(jìn) 了新疆紫草毛狀根中；新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)
e、將步驟d毛狀根接種于50mL無銨的1/2MS液體培養(yǎng)基中，加入lg/L酸水解酪 蛋白、肌醇lg/L和30g/L的蔗糖，pH值6.0，溫度25士 1°C，轉(zhuǎn)速為-120r/min的條件下進(jìn) 行振蕩、黑暗培養(yǎng)15d; 新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素 f、將步驟e除菌完全、生長(zhǎng)速度快、PCR檢測(cè)呈陽性的毛狀根接種于50mL含lg/L 酸水解酪蛋白和蔗糖30g/L的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d，添加大孔吸附樹脂NKA-91g/瓶， PH值為6.0，溫度25士 TC，轉(zhuǎn)速120rpm的條件下進(jìn)行振蕩、黑暗培養(yǎng)，30d為一個(gè)培養(yǎng)周 期，取出毛狀根，50°C烘干，研磨成粉100目，用濃度95%乙醇浸提3次，合并提取液，濃縮， 即可得到紫草膏，用分光光度法測(cè)定毛狀根中紫草素含量為干重的1-1. 5%。
權(quán)利要求
一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行新疆紫草毛狀根的誘導(dǎo)a、將新疆紫草種子用75％酒精消毒30s-60s，再用0.1％升汞表面消毒5-10min，無菌水充分漂洗后過夜，再用抗生素頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗環(huán)境培養(yǎng)15-20d，得到無菌苗，切取無菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗環(huán)境中1/2MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，待用；b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28℃，轉(zhuǎn)速160-180r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，所得菌液置于溫度4℃，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心5-10min，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于感染；c、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗培養(yǎng)形成毛狀根；d、將步驟c的毛狀根剪取2-3cm，轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無菌為止，再采用PCR、rolC基因序列分析和Southern分子雜交對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)e、將步驟d毛狀根接種于無銨的MS或SH或1/2MS液體培養(yǎng)基中，加入0.5-1g/L酸水解酪蛋白，肌醇1g/L，15-30g/L的蔗糖，pH值5.6-6.0，溫度25±1℃，轉(zhuǎn)速為100-120r/min的條件下進(jìn)行振蕩、黑暗培養(yǎng)12-15d；新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素f、將步驟e生長(zhǎng)的毛狀根接種于含酸水解酪蛋白0.5-1g/L和蔗糖15-30g/L的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-15d，添加大孔吸附樹脂NKA-9 1g/瓶，pH值為5.6-6.0，溫度25±1℃，轉(zhuǎn)速100-120rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，25-30d為一個(gè)培養(yǎng)周期，取出毛狀根，溫度50℃烘干，研磨成粉，用濃度95％乙醇浸提3次，合并提取液，濃縮，即可得到紫草膏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中子葉切塊是在無菌條件下，將子葉 切成0. 2-0. 5cm2的小塊或?qū)⒆尤~周圍切除。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a、步驟c和步驟d中所用抗生素頭孢 噻肟鈉的濃度為500-1000mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，該方法包括新疆紫草外植體的選擇和處理、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)、子葉外植體的感染和毛狀根的誘導(dǎo)、無菌新疆紫草毛狀根根系的獲得及新疆紫草毛狀根的液體培養(yǎng)及紫草素等步驟。由于所使用的毛狀根具備在無外源激素培養(yǎng)基上快速、自主生長(zhǎng)的特性，因此該方法不僅能克服利用細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草素時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)緩慢、需外加激素維持其生長(zhǎng)的不足，而且具有紫草素產(chǎn)出率穩(wěn)定、培養(yǎng)時(shí)操作簡(jiǎn)便、成本較低、不受氣候、土地等自然條件的限制等優(yōu)點(diǎn)。尤其為利用毛狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)紫草素提供了一種穩(wěn)定、可持續(xù)的新型藥源，為今后應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行紫草素規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的來源和物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101869591SQ20101019102
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者王芳, 蘆葦華, 陳永芳, 麻浩 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)