一種病毒感染阻斷劑、其藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種病毒感染阻斷劑、其藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及一種病毒感染阻斷劑及其應(yīng)用，具體而言，本申請涉及N末端和C末端均修飾的可阻斷HBV感染的多肽。
背景技術(shù)：
1. HBV的流行病學(xué)HBV感染是全球最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，是僅次于性病和水痘的第三常見疾病。全球約有20億人感染過HBV，75 %的世界人口生活在乙型肝炎高發(fā)區(qū)，慢性HBV感染者超過3. 5億。每年與HBV感染相關(guān)的死亡人數(shù)高達(dá)100萬，每年新增感染估計是HIV新增感染的2. 5 4倍。世界上75%的HBV慢性感染者集中在亞洲(約為2. 87億)，中國是乙型肝炎的高流行區(qū)，70年代末、90年代初和最近的三次全國肝炎流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，我國感染過HBV者6. 9億，感染率為57. 6%，全國長期攜帶HBV者0. 87億，現(xiàn)有的慢性乙型肝炎患者2000余萬。2. HBV感染的預(yù)防與治療現(xiàn)狀HBV的重要性早已在世界范圍內(nèi)得到廣泛公認(rèn)，其預(yù)防和治療也被置于優(yōu)先地位。 但迄今尚缺乏可清除體內(nèi)HBV的藥物，療效相對確切的抗病毒藥物主要是α干擾素和核苷類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和特必夫定等)。α干擾素主要通過免疫調(diào)節(jié)和誘生靶細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白而發(fā)揮抗病毒作用；核苷類似物則作用于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制病毒 DNA鏈的合成，從而抑制HBV DNA的復(fù)制。經(jīng)過1年的標(biāo)準(zhǔn)療程治療，約33%的α干擾素治療患者和約16%的拉米夫定治療患者可獲得徹底或部分血清學(xué)應(yīng)答(HBsiVg轉(zhuǎn)陰、HBeAg 均轉(zhuǎn)陰、出現(xiàn)或不出現(xiàn)抗-HBe抗體)、完全的病毒學(xué)應(yīng)答(HBV DNA轉(zhuǎn)陰)和生化應(yīng)答(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶間隔1個月連續(xù)2次檢測均正常，肝功能復(fù)常)。自從1970年Krugman獲得最早的乙型肝炎疫苗后，各國相繼利用無癥狀HBsAg攜帶者的血漿提取血源性HBsAg制備HBV疫苗。血源性HBV疫苗經(jīng)過長期使用被證明安全有效，但由于其來源有限，制備成本高昂，已被基因重組HBV疫苗取代。目前主要的重組疫苗包括酵母和中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的重組乙肝疫苗。這些疫苗免疫原性強(qiáng)，3針全程免疫后抗HBsAg抗體陽轉(zhuǎn)率不低于85%。但其主要缺點(diǎn)是抗體應(yīng)答較遲，HBV感染產(chǎn)婦的新生兒初次免疫若超過7天以上，則失去HBV疫苗對新生兒阻斷垂直傳播的作用。而且10% 15%接種者不產(chǎn)生應(yīng)答或低應(yīng)答，該人群仍可被HBV感染。乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用經(jīng)乙型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效價血漿或血清分離提取制備的免疫球蛋白制劑，其抗體效價在100IU/ml以上。適用于突發(fā)意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染產(chǎn)婦新生兒的被動免疫預(yù)防。我國的慢性HBV 感染者約有30% -50%通過母嬰傳播，為阻斷HBV母嬰圍產(chǎn)期傳播，普遍將HBIG與乙肝疫苗聯(lián)合應(yīng)用，雖然保護(hù)率可達(dá)80%以上，但HBIG提供的阻斷貢獻(xiàn)并不明顯，聯(lián)合應(yīng)用僅較乙肝疫苗單用提高5% 10%的阻斷率，而且聯(lián)合應(yīng)用后HBV感染產(chǎn)婦新生兒HBV感染率仍較健康產(chǎn)婦新生兒高4倍。近年發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染可能是母嬰傳播的重要途徑，HBV感染孕婦引產(chǎn)胎兒肝臟或血液的HBV感染標(biāo)志檢出率可達(dá)40%，HBsAg陽性母親的嬰兒的宮內(nèi)感染率約16%。因此國內(nèi)有些醫(yī)院在妊娠的最后3 4個月中對HBV感染孕婦每月一次注射大于200IU的HBIG，以期預(yù)防胎兒HBV宮內(nèi)感染。但該方法宮內(nèi)傳播阻斷效果并不理想，且可能導(dǎo)致HBV S區(qū)變異株的出現(xiàn)和免疫復(fù)合物病理免疫反應(yīng)的發(fā)生。HBIG還廣泛應(yīng)用于乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV感染復(fù)發(fā)的預(yù)防。在沒有預(yù)防措施的情況下，乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后6個月內(nèi)HBV再感染率高達(dá)約40%，2年內(nèi)再感染率高達(dá)約60%。多數(shù)再感染病例歷經(jīng)急性、慢性肝炎而發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳，需再次肝移植。單獨(dú)采用拉米夫定預(yù)防肝移植術(shù)后乙型肝炎復(fù)發(fā)，其長期HBV-DNA、 HBeAg及HBsAg轉(zhuǎn)陰率約60 70%，且易發(fā)生HBV基因突變，YMDD耐藥變異率高達(dá)21 %。 加之患者移植前多長期使用抗病毒藥物，多數(shù)出現(xiàn)抗病毒藥物抵抗現(xiàn)象，增加了移植后病毒感染復(fù)發(fā)率和預(yù)防的難度。因此國外加用大劑量HBIG以預(yù)防乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)。肝移植術(shù)后沒有接受HBIG治療的受者中，術(shù)后早期體內(nèi)出現(xiàn)不同滴度的HBsAb， 隨后血清HBsAb逐漸消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能長期維持較高滴度。高劑量無限制性HBIG單一治療能阻止65% 80%患者復(fù)發(fā)，但HBIG價格昂貴，費(fèi)用每年高達(dá)約130 萬元人民幣。國內(nèi)采用拉米夫定與小劑量HBIG聯(lián)合應(yīng)用阻止移植后HBV感染復(fù)發(fā)的療效雖然顯示良好，但未經(jīng)大樣本臨床試驗(yàn)證實(shí)。且長期應(yīng)用HBIG帶來的免疫壓力會造成HBV 基因變異而出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象，使HBIG用于乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV再感染的預(yù)防受到很大限制。綜上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸類似抑制物、抗病毒細(xì)胞因子和中和性抗體的主動被動免疫，缺少對HBV病毒其他感染環(huán)節(jié)的抑制手段。本發(fā)明所涉及的多肽可與肝細(xì)胞結(jié)合，直接阻斷病毒對肝細(xì)胞的感染，為HBV感染的治療和預(yù)防提供新的手段。3.關(guān)于本發(fā)明公開的可阻斷HBV感染的多肽HBV病毒包膜含有大(L)、中(M)、小(S)三種表面抗原蛋白，這些蛋白由具有3個不同翻譯起始位點(diǎn)的S區(qū)基因單一開放閱讀框編碼，即LO^re-Sl+PreSZ+S)、M(Pre S2+S) 和。HBV的L蛋白區(qū)存在與肝細(xì)胞特異性受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸序列，本發(fā)明合成關(guān)鍵序列多肽，并對其兩端進(jìn)行修飾改造，提高了多肽對HBV感染阻斷的效能，增強(qiáng)了多肽的穩(wěn)定性。目前治療HBV慢性感染的藥物均作用于HBV細(xì)胞內(nèi)復(fù)制環(huán)節(jié)，而本發(fā)明涉及的多肽可高效直接抑制HBV對細(xì)胞的感染，且十分穩(wěn)定，為HBV感染的防治提供了優(yōu)良的藥用化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種可阻斷HBV感染的多肽，該多肽自N端至C端具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，其N端被疏水集團(tuán)修飾，其C端被穩(wěn)定化修飾。在一個實(shí)施例中，所述多肽的N端被豆蔻酰化修飾、硬脂酸修飾、棕櫚酸修飾、膽固醇修飾，其C端被酰胺化(Amidation，氨基化)修飾、或異戊二醇化修飾。其中N端的疏水基團(tuán)修飾可增強(qiáng)所述多肽阻斷HBV感染的效能，而C端的穩(wěn)定性修飾可增強(qiáng)所述多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明公開的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及所述多肽在制備預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥劑中的用途。
具體而言，本申請?zhí)峁┮环N多肽，該多肽選自(I)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(2)在SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上具有1_3個氨基酸取代、缺失或插入、并保持SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的阻斷HBV感染的活性的氨基酸序列；其中，該多肽N端帶有疏水基團(tuán)修飾且C端被穩(wěn)定化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述的N端疏水性修飾為豆蔻?；揎?、或硬脂酸修飾、或棕櫚酸修飾、或膽固醇修飾。在一具體實(shí)施例中，所述的C端穩(wěn)定化修飾為酰胺化修飾或異戊二醇化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述的N端疏水性修飾為豆蔻?；揎?，所述的C端穩(wěn)定化修飾為酰胺化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、3或4所示。在一具體實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、3或4所示，所述多肽的N 端為豆蔻?；揎?、C端為酰胺化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端為豆蔻酰化修飾、C端為酰胺化修飾。本申請?zhí)峁┮环N藥物組合物，該藥物組合物含有本申請所述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。在一具體實(shí)施例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1_4中任一條序列所述。在一具體實(shí)施例中，所述藥物組合物含有至少一條SEQ ID NO 1-4所示的氨基酸序列。在一具體實(shí)施例中，所述藥物組合物中的多肽為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列， 其N端為豆蔻?；揎棥端為酰胺化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端為豆蔻?；揎?、C端為酰胺化修飾。在一具體實(shí)施例中，藥物組合物中多肽的濃度為大于等于20ng/ml，優(yōu)選為大于等于 100ng/ml。本申請還涉及所述的多肽在制備治療HBV感染用的藥劑中的用途。在一具體實(shí)施例中，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端為豆蔻?；揎?、C端為酰胺化修飾。在一具體實(shí)施例中，所述對象為已感染HBV或可能感染HBV的人。


圖1顯示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，C端酰胺化修飾，N端疏水基團(tuán)修飾的多肽對HBV感染的阻斷。圖2顯示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻?；揎?，C端穩(wěn)定化修飾的多肽的穩(wěn)定性。圖3顯示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻?；揎?，C端穩(wěn)定化修飾的多肽對HBV感染的阻斷。圖4顯示氨基酸突變對SEQ ID NO 1-4氨基酸序列多肽阻斷HBV感染的影響和穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式如上所述，本發(fā)明提供了一種可抑制HBV感染的多肽。該多肽自N端至C端具有 SEQ ID NO :1所示氨基酸序列，其N端帶有疏水基團(tuán)修飾，其C端被穩(wěn)定化修飾。以上所述的 N端疏水基團(tuán)修飾，這些疏水基團(tuán)優(yōu)選地是豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、膽固醇、 花生四烯酸及其類似基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選地為豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸或膽固醇，更優(yōu)選地為豆蔻酸。以上所述的C端穩(wěn)定化修飾，這些穩(wěn)定化修飾包括酰胺化修飾(即氨基化修飾)、 異戊二醇化修飾及其他多肽C端穩(wěn)定化修飾。優(yōu)選地為酰胺化修飾(即氨基化修飾)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，序列為SEQ ID NO=I的多肽的C末端經(jīng)酰胺化修飾， 而其N末端分別進(jìn)行了豆蔻?；⒂仓?、棕櫚酸和膽固醇修飾，其中優(yōu)選地N端豆蔻?；揎椀亩嚯木哂懈叩牟《靖腥疽种苹钚浴Ｔ诹硗庖粋€優(yōu)選方案中，序列為SEQ ID NO 1 的多肽的N末端經(jīng)豆蔻酰化修飾，而其C末端分別進(jìn)行了酰胺化修飾和異戊二醇化修飾，其中優(yōu)選地C端酰胺化修飾的多肽具有更高的病毒感染抑制活性和優(yōu)良的穩(wěn)定性。因此在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方案中，序列為SEQ ID NO :1的多肽的C末端經(jīng)酰胺化修飾，而且N末端進(jìn)行了豆蔻?；揎棥１旧暾埶婕岸嚯牡娜魏瓮滴锞鶠楸旧暾埖囊徊糠?，包括經(jīng)過一個或多個氨基酸突變，如包括1-10個氨基酸、較佳1-8個氨基酸、更佳1-5個氨基酸、更佳1-3個氨基酸的刪除、保守/非保守氨基酸替換、或插入而獲得的多肽序列。這里的“同系物”還包括與本申請涉及多肽具有大于30% (如40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更大) 同源性的多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，對序列為SEQ ID NO :1的多肽進(jìn)行1-3個氨基酸的突變獲得的多肽序列(SEQ ID NO 2-4)。具體而言，氨基酸一般被分成四類(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例如，有理由預(yù)測單獨(dú)用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸取代類似的保守的氨基酸，這樣的替代將不會對生物活性有重要影響。本申請還包括將提供的多肽用作阻斷或防止HBV感染的藥物以及與適當(dāng)藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物制劑。本申請還包括含有所述多肽的藥物組合物。 本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物含有有效量的本發(fā)明多肽。如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。例如，對于液體制劑或組合物而言，所述多肽的濃度可以為20ng/ml以上，例如50ng/ml以上、80ng/ ml以上、100ng/ml以上或更高。 所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等?？刹捎帽绢I(lǐng)域各種常規(guī)的合適方式給予對象本發(fā)明的藥物組合物或藥物制劑，所述方式包括但不限于口服、皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。本申請也包括以所提供的多肽作為治療或預(yù)防HBV感染的措施，以及涉及本申請多肽在內(nèi)的患者所需要的任何預(yù)防、治療措施。本申請?zhí)貏e包含本申請多肽體內(nèi)抑制HBV 感染的預(yù)防和治療措施，其中包括阻止HBV傳播到生物體未受感染的細(xì)胞中。這里的預(yù)防措施是指降低或避免患者感染HBV的可能性，治療措施是指改善或穩(wěn)定患者狀況的所有措施。所指的患者是任何被HBV感染、可能被HBV感染和可能即將被HBV感染的人。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，C端酰胺化修飾，N端疏水基團(tuán)修飾的多肽對HBV感染的阻斷1、多肽的制備和修飾以AB 431A型多肽合成儀按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，以0. 25mM樹脂起始，按照SEQ ID NO 1序列自羧基端向氨基端逐個殘基延伸合成，最后添加疏水集團(tuán)修飾。肽合成結(jié)束后，經(jīng)切割液切割，G6玻砂漏斗濾除樹脂，濾液真空抽干，多肽的C末端進(jìn)一步酰胺化。無離子水溶解多肽產(chǎn)物，AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀C18柱純化，分步收集主峰。目標(biāo)峰收集樣以Delta 600型反相高壓液相色譜Symmetry C18分析柱純度鑒定，API 2000LC/MS/ MS型質(zhì)譜儀分子量鑒定。中壓液相色譜純化所得的收集液凍干，溶于PBS形成多肽儲存液， 0. 20 μ M過濾除菌，-80°C凍存。2、樹駒原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)樹駒麻醉后經(jīng)門靜脈插管，按照BD公司肝細(xì)胞培養(yǎng)基使用手冊提供的經(jīng)典兩步灌注法消化肝臟組織，分離原代肝細(xì)胞，經(jīng)洗滌后鋪板于肝細(xì)胞培養(yǎng)板(BD公司產(chǎn)品 BD354408)，采用肝細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(BD公司產(chǎn)品BD355056)，每3天更換培養(yǎng)基，37度、5% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)。3、HBV病毒對肝細(xì)胞的感染。將我國臨床收集的混合的HBV感染患者的病毒血清2ml加入培養(yǎng)3天的樹駒原代肝細(xì)胞，37°C孵育感染12小時。感染完成后移除感染血清，洗滌細(xì)胞3次，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)12天。4、HBV感染后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg通過三明治夾心法(in-house sandwich)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)檢測。lug/ml抗HBsAg單克隆抗體37°C包被96孔板2小時。充分洗滌后(0. 1% Tween 20PBS洗滌3次、PBS洗滌2次)，10%胎牛血清37°C封閉1小時。去除封閉液，加入 HBV感染的肝細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μ 1 4°C孵育12小時。去除培養(yǎng)上清，充分洗滌，加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗HBsiVg抗體37°C孵育1小時。去除多余抗體，加入苯二胺-H2O2反應(yīng)底物室溫反應(yīng)15分鐘，2N H2SO4中止反應(yīng)，測定反應(yīng)產(chǎn)物的0D492，計算感染上清中HBsAg含量。5、具有SEQ ID NO 1氨基酸序列、C端酰胺化修飾、N端疏水基團(tuán)修飾的多肽對HBV
7感染的阻斷樹駒原代肝細(xì)胞于M孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，在HBV病毒感染的同時，在感染上清中加入不同N端修飾的多肽各20ng/ml，共同孵育12小時。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。 繼續(xù)培養(yǎng)12天后檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖IA所示，以未受多肽處理肝細(xì)胞的HBV感染為對照，帶有N端不同疏水基團(tuán)修飾的多肽對HBV感染肝細(xì)胞具有不同程度的阻斷效應(yīng)，其中N末端為豆蔻酸修飾、硬脂酸修飾、棕櫚酸修飾、膽固醇修飾和N末端無修飾的多肽分別可抑制HBV對肝細(xì)胞感染的57. 4%、49. 2%、46. 8% 43. 2%和9. 7%?？梢?， N末端為豆蔻酸修飾的多肽具有較高的HBV感染抑制效應(yīng)，且FITC熒光標(biāo)記的N、C末端為豆蔻酸和酰胺化修飾的SEQ ID NO 1多肽可與原代肝細(xì)胞結(jié)合(圖1B)。實(shí)施例二 具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻?；揎棧珻端穩(wěn)定化修飾的多肽的穩(wěn)定性1、多肽的制備和修飾以AB 431A型多肽合成儀按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，以0. 25mM樹脂起始，按照SEQ ID NO 1序列自羧基端向氨基端逐個殘基延伸合成，最后豆蔻酸修飾。肽合成結(jié)束后，經(jīng)切割液切割，G6玻砂漏斗濾除樹脂，濾液真空抽干，多肽的C末端進(jìn)一步酰胺化、或異戊二醇化修飾、 或C端不修飾。無離子水溶解多肽產(chǎn)物，Akta explorer 100型中壓液相色譜儀C18柱純化，分步收集主峰。目標(biāo)峰收集樣以Delta 600型反相高壓液相色譜Symmetry C18分析柱純度鑒定，API 2000LC/MS/MS型質(zhì)譜儀分子量鑒定。中壓液相色譜純化所得的收集液凍干，溶于PBS形成多肽儲存液，0. 20 μ M過濾除菌，_80°C凍存。2、多肽的穩(wěn)定性多肽溶于0.02M PBS，形成0. 25mg/ml濃度溶液，置于37度放置3天。采用Luna C18，150X4. 6mm, 5 μ , 100Α色譜柱，采用Delta 600型反相高壓液相色譜儀分別進(jìn)行HPLC 純度分析。如圖2所示，N端均經(jīng)豆蔻?；揎棧鳦末端分別酰胺化修飾、異戊二醇化修飾和C末端未修飾的多肽37度放置前純度分別為98. 2%、98. 7%和98. 3% (圖2A) ；37度放置12小時后純度分別為95. 4%、95. 6%和95. 5% (圖2B) ；37度放置3天后純度分別降低至83. 9%、87. 7%和43. 9% (圖2C)?？梢奀端未修飾的多肽缺乏穩(wěn)定性，而經(jīng)C端酰胺化修飾和異戊二醇化修飾后多肽穩(wěn)定性明顯增加。實(shí)施例三具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻?；揎?，C端穩(wěn)定化修飾的多肽對HBV感染的阻斷1、多肽的制備和修飾(同實(shí)例二 )。2、樹駒原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)和HBV病毒的感染(同實(shí)施例一)3、HBV感染后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的檢測(同實(shí)施例一)4、具有SEQ ID NO :1氨基酸序列，N端豆蔻?；揎?，C端穩(wěn)定化修飾的多肽對HBV 感染的阻斷1)多肽低濃度下對HBV感染的阻斷效應(yīng)樹駒原代肝細(xì)胞于M孔培養(yǎng)板中培養(yǎng) 3天，在HBV病毒感染的同時，在感染上清中加入不同C端修飾的多肽各20ng/ml，共同孵育 12小時。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)12天后檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖3A所示，以未受多肽處理肝細(xì)胞的HBV感染為對照，N末端均被豆蔻?；揎椂鳦 端帶有不同穩(wěn)定化修飾和C端未修飾的多肽對HBV感染肝細(xì)胞具有不同程度的阻斷效應(yīng)，其中C末端為酰胺化修飾、異戊二醇化修飾和C端未修飾的多肽分別可抑制HBV對肝細(xì)胞感染的55. 9%、42. 4%和57. 3%。可見，在低濃度條件下C末端酰胺修飾多肽與C端未修飾多肽對HBV感染的阻斷效應(yīng)相當(dāng)，而C末端異戊二醇化修飾則影響多肽對病毒感染的阻斷效應(yīng)。2)多肽高濃度下對HBV感染的阻斷效應(yīng)樹駒原代肝細(xì)胞于M孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3 天，在HBV病毒感染的同時，在感染上清中加入不同C端修飾的多肽各lOOng/ml，共同孵育 12小時。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)12天后檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖:3B所示，以未受多肽處理肝細(xì)胞的HBV感染為對照，N末端均被豆蔻?；揎椂鳦 端為酰胺化修飾、異戊二醇化修飾和C端未修飾的多肽對HBV感染肝細(xì)胞具有不同程度的阻斷效應(yīng)，其中C末端為酰胺化修飾、異戊二醇化修飾和C端未修飾的多肽分別可抑制HBV 對肝細(xì)胞感染的95. 1%、60. 9%和81. 5%?？梢姡珻末端異戊二醇化修飾阻斷HBV效應(yīng)仍不及C端未修飾的多肽。而出乎意料地，C末端酰胺化修飾的多肽在高濃度時較C端未修飾的多肽阻斷HBV效應(yīng)明顯提高。這種增強(qiáng)效應(yīng)可能存在兩方面原因1)多肽經(jīng)酰胺化修飾后，半衰期延長，使試驗(yàn)阻斷時間(12小時)內(nèi)的多肽有效濃度增加。但實(shí)施例二中穩(wěn)定性的研究卻顯示，12小時末C端未修飾與C端酰胺化修飾的多肽相比，降解無差別。因此不能用半衰期優(yōu)勢解釋高濃度條件下C端酰胺化修飾對多肽病毒阻斷能力的增強(qiáng)作用。2) C端酰胺化修飾增強(qiáng)了多肽的某些生物學(xué)性狀(如分子空間結(jié)構(gòu)、親疏水性、高濃度條件下的多聚體等)，更適合與HBV競爭，進(jìn)而增強(qiáng)了多肽阻斷感染的效應(yīng)。但由于目前該多肽的生物學(xué)性狀尚不了解，因此無法預(yù)料和解釋高濃度條件下C端酰胺化修飾對多肽病毒阻斷能力的增強(qiáng)作用。實(shí)施例四氨基酸突變對SEQ ID NO=I氨基酸序列多肽阻斷HBV感染的影響1、多肽的制備和修飾以AB 431A型多肽合成儀按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，以0. 25mM樹脂起始，按照SEQ ID NO 2-4序列(分別帶有1個突變F13L，2個突變F13L、H39Q和3個突變F13L、H39Q、N44D)自羧基端向氨基端逐個殘基延伸合成，最后豆蔻酸修飾。肽合成結(jié)束后，經(jīng)切割液切割，G6玻砂漏斗濾除樹脂，濾液真空抽干，多肽的C末端進(jìn)一步酰胺化修飾。無離子水溶解多肽產(chǎn)物，AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀C18柱純化，分步收集主峰。目標(biāo)峰收集樣以 Delta 600型反相高壓液相色譜Symmetry C18分析柱純度鑒定，API 2000LC/MS/MS型質(zhì)譜儀分子量鑒定。中壓液相色譜純化所得的收集液凍干，溶于PBS形成多肽儲存液，0. 20 μ M 過濾除菌，_80°C凍存。2、樹駒原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)和HBV病毒的感染(同實(shí)施例一)。3、HBV感染后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的檢測(同實(shí)施例一)。4、具有SEQ ID NO :1_4氨基酸序列，N端豆蔻酰胺化修飾，C端酰胺化修飾的多肽對HBV感染的阻斷1)樹駒原代肝細(xì)胞于M孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，在HBV病毒感染的同時，在感染上清中加入SEQ ID NO :1-4序列的多肽各20ng/ml，共同孵育12小時。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)12天后檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖4A所示，以未受多肽處理肝細(xì)胞的HBV感染為對照，SEQID NO :1_4序列的多肽分別可抑制HBV對肝細(xì)胞感染的56. 7%、55. 9%、59. 3%和52. 6%?？梢?，1-3個氨基酸序列的突變不影響SEQ ID NO 1序列的多肽阻斷HBV感染的效應(yīng)。2)樹駒原代肝細(xì)胞于M孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，在HBV病毒感染的同時，在感染上清中加入SEQ ID NO :1-4序列的多肽各lOOng/ml，共同孵育12小時。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)12天后檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖4B所示，以未受多肽處理肝細(xì)胞的HBV感染為對照，SEQID NO :1_4序列的多肽分別可抑制HBV對肝細(xì)胞感染的94. 7%、96. 2%、95. 7%和93. 9%。可見，1-3個氨基酸序列的突變不影響SEQ ID NO 1 序列的多肽阻斷HBV感染的效應(yīng)。5、突變多肽的穩(wěn)定性多肽溶于0.02M PBS，形成0. 25mg/ml濃度溶液，置于37度放置3天。采用Luna C18，150X4. 6mm, 5 μ , IOOA色譜柱，采用Delta 600型反相高壓液相色譜儀分別進(jìn)行HPLC 純度分析。SEQ ID NO :1-4多肽37度放置前純度分別為98. 2%、98. 9%、98. 6%和98.8%， 如圖4C所示，37度放置3天后純度分別降低至83. 9%、84. 1%、82. 7%和83. 2%?？梢?， 1-3個氨基酸序列的突變不影響SEQ ID NO :1序列的多肽穩(wěn)定性。上述具體實(shí)施例僅僅是闡述性的，而非限制性的。本申請的保護(hù)范圍將由權(quán)利要求來限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明的技術(shù)方案作出各種修改和變動，這些修改和變動依然包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種多肽，選自(1)SEQID NO 1所示的氨基酸序列；或(2)在SEQID NO :1所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上具有1-3個氨基酸取代、缺失或插入、并保持SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的阻斷HBV感染的活性的氨基酸序列；其中，該多肽N端帶有疏水基團(tuán)修飾且C端被穩(wěn)定化修飾。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的N端疏水性修飾為豆蔻?；揎棥⒒蛴仓嵝揎?、或棕櫚酸修飾、或膽固醇修飾。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的C端穩(wěn)定化修飾為酰胺化修飾、或異戊二醇化修飾。
4.權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的N端疏水性修飾為豆蔻?；揎?、所述的C端穩(wěn)定化修飾為酰胺化修飾。
5.權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDN0:2、3或4 所示。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的N端為豆蔻?；揎?、C端為酰胺化修飾。
7.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，其N端為豆蔻?；揎?、C端為酰胺化修飾。
8.—種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1-7中任一項所述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
9.權(quán)利要求1-7中任一項所述的多肽在制備治療HBV感染用的藥劑中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，其N端為豆蔻?；揎棥端為酰胺化修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療病毒感染的阻斷劑。改變該阻斷劑的N末端和C末端的修飾，可明顯影響該阻斷劑的穩(wěn)定性和阻斷病毒感染的有效性。本發(fā)明還涉及該阻斷劑用于預(yù)防、治療病毒感染的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/16GK102241744SQ201010174788
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者劉宏利 申請人:上海賀普生物科技有限公司