專利名稱：一種用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，具體涉及一種用于向原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)及其制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
隨著人類生存環(huán)境的惡化，誘發(fā)癌癥的因素越來越多，癌癥的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢。癌癥已成為威脅人類健康和生命的主要疾病。淋巴轉(zhuǎn)移是實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑， 也是腫瘤導(dǎo)致患者死亡的重要原因。淋巴轉(zhuǎn)移一般發(fā)生在腫瘤早期或中期，如不及時控制， 可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴回流至血流擴(kuò)散，引發(fā)更廣泛的腫瘤轉(zhuǎn)移。據(jù)臨床研究統(tǒng)計(jì)，60% 惡性腫瘤患者初診時即已發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。目前臨床上對腫瘤的常規(guī)治療方法是切除原發(fā)瘤和淋巴清掃之后，進(jìn)行全身化療或放療。但是，外科手術(shù)不能徹底清除腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)， 從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)；化療藥物靜注后，藥物到達(dá)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的幾率很小，目前尚無有效的手段加以控制和治療。因此，對淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)行靶向治療具有重要的臨床現(xiàn)實(shí)意義。鑒于機(jī)體組織間隙生理學(xué)特點(diǎn)(含眾多有親水性孔道(約IOOnm)，毛細(xì)淋巴管壁孔隙(30-120nm)大于毛細(xì)血管壁孔隙(< lOnm))，通過組織間隙注射一定納米尺度(如 SOnm左右)的載藥系統(tǒng)，可以將其靶向至淋巴系統(tǒng)。目前用于靶向淋巴系統(tǒng)遞藥的納米載體包括活性炭、硅粒、高分子聚合物、脂質(zhì)體、納米粒、納米乳和聚合物膠束等。在各種納米載體中，脂質(zhì)體以其天然結(jié)構(gòu)特性、便于修飾、易于粒徑控制和親水親脂性藥物兼可包載等的優(yōu)越性，被認(rèn)為是最適合的淋巴系統(tǒng)靶向載體。但在脂質(zhì)體具體實(shí)施淋巴系統(tǒng)靶向過程中普遍存在如下問題①脂質(zhì)體經(jīng)組織間隙注射后，淋巴吸收不完全，部分滯留于注射部位組織間隙，滯留量約為總給藥劑量的10-40%，反復(fù)注射含抗腫瘤藥物脂質(zhì)體，會導(dǎo)致局部組織損傷甚至壞死；②進(jìn)入淋巴系統(tǒng)的脂質(zhì)體因機(jī)械截留或巨噬細(xì)胞吞噬而在正常淋巴結(jié)中蓄積，易造成正常淋巴組織損傷；③脂質(zhì)體在淋巴結(jié)中蓄積是一個被動過程，對正常淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)沒有選擇性，甚至?xí)蚰[瘤轉(zhuǎn)移所致淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞而無法截留或吞噬脂質(zhì)體時，被腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)攝取脂質(zhì)體量反而低于正常淋巴結(jié)，影響其靶向治療效果。 其中，前兩個問題有研究已采用"壓力補(bǔ)償"和"飽和巨噬細(xì)胞"策略對其給予了較好的解決并獲得中國發(fā)明專利(ZL2005100M046. 8)。但第三個問題-脂質(zhì)體對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的靶向遞藥問題仍未得到有效解決。近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管新生現(xiàn)象是促進(jìn)腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的重要因素，并發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種蛋白VEGFR-3和VEGFR-2是淋巴管新生過程中所需受體，故有研究者利用VEGFR-3和VEGFR-2的抑制劑來抑制腫瘤組織和淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴管新生，從而達(dá)到抑制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的目的。結(jié)果表明，這種治療方法對前期腫瘤治療效果良好，能有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，但對已發(fā)生淋巴管增生或者發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤則基本無效。LyP-I是一種通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的環(huán)狀九肽，其不僅對原位腫瘤具有靶向性，而且對淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤也具有靶向能力。LyP-I能靶向的腫瘤包括黑色素瘤(MDA-MB-435)、乳腺癌(MMTV-PyMT)、前列腺癌(TRAMP)、皮膚癌(K14-HPV16)、骨肉瘤 (KRIB)等；LyP-I對淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的靶向性是基于其與腫瘤細(xì)胞和腫瘤內(nèi)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異親和性識別。現(xiàn)有研究者利用LyP-I修飾白蛋白納米粒和疊氮納米粒，還有研究者制備了能夠表達(dá)LyP-I的病毒性載體，所有這些載藥系統(tǒng)都表現(xiàn)出良好的主動靶向至原位腫瘤的效果。目前還未見將LyP-I用于修飾脂質(zhì)體的報(bào)道，也未見將其用于原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，具體涉及一種用于向原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明構(gòu)建了一種由含LyP_l(氨基酸序列為CGNKRTRGC)序列的多肽與脂質(zhì)體組成，其中LyP-I序列多肽由兩個半胱氨酸通過二硫鍵連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可用于實(shí)現(xiàn)向原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的靶向遞藥。本發(fā)明的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，可通過皮下組織間隙注射或肌肉注射將脂質(zhì)體被動弓I 流至淋巴系統(tǒng)內(nèi)，通過LyP-I的介導(dǎo)作用靶向至腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。該系統(tǒng)也可直接通過靜脈注射給藥，通過腫瘤EI^R效應(yīng)和LyP-I介導(dǎo)作用將其靶向至原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤。此脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可用作原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤診斷或治療的藥物靶向遞送。本發(fā)明中，含Lyp-I序列的多肽通過固相合成法合成，HPLC(高效液相色譜法)和 MS (質(zhì)譜法)表征其結(jié)構(gòu)。對其進(jìn)行熒光素FAM (羧基熒光素)標(biāo)記考查其體外腫瘤細(xì)胞攝取和體內(nèi)對原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的靶向性，結(jié)果證實(shí)LyP-I對體外腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤具有特異靶向性。本發(fā)明中，脂質(zhì)體載體系統(tǒng)的膜材料包括以下成分a:天然磷脂或合成磷脂， 和b 膽固醇，和C 甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物(甲氧基聚乙二醇的分子量為1000 5000)，和d 含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物(聚乙二醇的分子量為1000 8000)。各成分之間的摩爾比為a :b = 5:l l:2，a: c = 1000 1 1000 100， aid= 1000 1 1000 100。所述的天然磷脂或合成磷脂可以是蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、 二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂。所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物和含LyP-I序列多肽的多肽-聚乙二醇_磷脂復(fù)合物中的磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，通過以下兩種方式合成1、含LyP-I序列的多肽提供一個游離巰基，聚乙二醇-磷脂提供一個馬來酰亞胺
基，兩者發(fā)生特異性反應(yīng)而連接成共價(jià)復(fù)合物，其反應(yīng)式如下2、含LyP-I序列的多肽提供一個游離氨基，聚乙二醇-磷脂提供一個N-羥基琥珀酰亞胺基，兩者發(fā)生特異性反應(yīng)而連接成共價(jià)復(fù)合物，其反應(yīng)式如下
-(LyP-1 -contained Peptide)~NH——C—PEG—PE合成之后通過NMR表征其結(jié)構(gòu)。所述的脂質(zhì)體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化-擠壓法制備將一定比例的a、b、C、d 溶于氯仿，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化法制備LyP-I修飾的脂質(zhì)體(LyP-I-PEG-脂質(zhì)體)，用擠壓過膜的方法減小脂質(zhì)體粒徑，得到脂質(zhì)體。激光散射法測定粒徑分布。其平均粒徑為 20 500nm。本發(fā)明通過熒光示蹤脂質(zhì)體，考查腫瘤細(xì)胞分別對載FITC (異硫氰基熒光素)的 LyP-I-PEG-脂質(zhì)體和PEG-脂質(zhì)體的攝取，結(jié)果證實(shí)LyP-I在體外能介導(dǎo)脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明通過近紅外染料DiR標(biāo)記脂質(zhì)體，將包載DiR的LyP-I-PEG-脂質(zhì)體和 PEG-脂質(zhì)體經(jīng)足墊皮下注射或肌肉注射或靜脈注射于淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤動物模型體內(nèi)，在活體成像儀下觀測，證明LyP-I-PEG-脂質(zhì)體對淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤和原位腫瘤具有很好的靶向性。研究結(jié)果提示，本發(fā)明的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可用作原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤影像診斷的示蹤藥物的靶向遞送，也可用作原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤治療的抗腫瘤藥物靶向遞送?？赏ㄟ^靜脈注射、皮下注射或肌肉注射給藥。
圖 1、LyP-I-PEG-DSPE 的 1H-NMR 圖譜，圖中A為Mal-PEG-DSPE的核磁圖譜，B為LyP-l-PEG-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變，顯示 Mal-PEG-DSPE中的馬來酰亞胺基團(tuán)已與LyP-I反應(yīng)。圖2、淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠動物模型照片和病理切片，圖中A為足墊原位腫瘤，B為腹股溝淋巴結(jié)，C中左側(cè)為未接種腫瘤側(cè)的胭淋巴結(jié)， 右側(cè)為接種腫瘤側(cè)的胭淋巴結(jié)，D和E分別為3周和6周裸鼠淋巴結(jié)的病理切片，F(xiàn)-J分別為心、肝、脾、肺、腎的病理切片；由圖可以看出，裸鼠原位腫瘤明顯，腫瘤轉(zhuǎn)移后淋巴結(jié)體積變大，病理切片顯示，3周時淋巴結(jié)內(nèi)有少量轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，6周時淋巴結(jié)內(nèi)存在大量轉(zhuǎn)移灶，而其余臟器則無腫瘤轉(zhuǎn)移。圖3、LyP-I-FAM被MDA-MB_4;35腫瘤細(xì)胞攝取照片，LyP-I-FAM和FAM于37°C分別與MDA-MB-435細(xì)胞作用4小時后的熒光顯微照片， 其中A，B分別為LyP-I-FAM組的明場與暗場照片；C，D分別為FAM組的明場與暗場照片，由圖可知，MDA-MB-435細(xì)胞對FAM幾乎無攝取，而對LyP-I-FAM則幾乎所有細(xì)胞均有攝取。圖4、LyP-I-FAM被SPC-A-1腫瘤細(xì)胞攝取照片，LyP-I-FAM和FAM于37°C分別與SPC_A_1細(xì)胞作用4小時后的熒光顯微照片，其中A，B分別為LyP-I-FAM組的明場與暗場照片；C，D分別為FAM組的明場與暗場照片，由圖可知，SPC-A-I細(xì)胞對FAM幾乎無攝取，而對LyP-I-FAM則幾乎所有細(xì)胞均有攝取。圖5、LyP-I-FAM在淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型體內(nèi)和淋巴結(jié)內(nèi)的分布圖，淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型尾靜脈分別注射FAM和LyP-I-FAM Ih后FAM和LyP_l_FAM 在裸鼠體內(nèi)的活體分布圖(A和B)和在腹股溝、胭和髂淋巴結(jié)內(nèi)的離體分布圖(C)，本實(shí)驗(yàn)中裸鼠為雙后足墊接種腫瘤模型鼠。圖6、LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC和PEG-脂質(zhì)體/FITC粒徑分布圖，PEG-脂質(zhì)體/FITC (A)和LyP_l_PEG-脂質(zhì)體/FITC⑶粒徑分布圖，由圖可知，兩者粒徑大小及分布無顯著差異。圖7、LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR和PEG-脂質(zhì)體/DiR粒徑分布圖，PEG-脂質(zhì)體/DiR(A)和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR(B)粒徑分布圖，由圖可知，兩者
粒徑大小及分布無顯著差異。圖8、LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC和PEG-脂質(zhì)體/FITC被MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞攝取照片，PEG-脂質(zhì)體 /FITC 和 LyP-l-PEG-脂質(zhì)體 /FITC 于 37°C分別與 MDA-MB_4;35 細(xì)胞作用1小時后的熒光顯微照片，其中A，B分別為PEG-脂質(zhì)體/FITC組的明場與暗場照片； C，D分別為LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC組的明場與暗場照片，由圖可知，MDA-MB-435細(xì)胞對 LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC的攝取量遠(yuǎn)大于PEG-脂質(zhì)體/FITC。圖9、LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR和PEG-脂質(zhì)體/DiR足墊皮下注射后不同時間在淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型體內(nèi)分布圖，
各圖中左側(cè)為PEG-脂質(zhì)體/DiR組，右側(cè)為LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR組，由圖可知，從足墊皮下給藥后1小時起，LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠胭淋巴結(jié)的分布量開始大于PEG-脂質(zhì)體/DiR，一直到24小時檢測不到淋巴結(jié)的分布信號；由圖還可看出，PEG-脂質(zhì)體/DiR組在給藥后8小時開始在肝臟的分布遠(yuǎn)大于LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR組，這是因?yàn)?LyP-I的介導(dǎo)作用使LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR更多地蓄積于腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)處，而PEG-脂質(zhì)體/DiR則更多地經(jīng)淋巴回流入血，被肝臟攝??；圖中箭頭標(biāo)示為胭淋巴結(jié)；本實(shí)驗(yàn)中裸鼠為左后足墊接種腫瘤細(xì)胞的模型鼠。圖10、LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR和PEG-脂質(zhì)體/DiR經(jīng)靜脈注射后在淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型淋巴結(jié)內(nèi)的分布圖，左圖為LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR和PEG-脂質(zhì)體/DiR靜注4小時后在模型鼠各淋巴結(jié)中分布圖，其中上圖為白光圖，中圖為熒光圖，下圖為兩者疊加圖，各圖中上排為 PEG-脂質(zhì)體/DiR組，下排為LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR組，右圖為脂質(zhì)體在各腫瘤接種側(cè)淋巴結(jié)中分布的半定量數(shù)據(jù)；由圖可知，在各腫瘤接種側(cè)淋巴結(jié)中，LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR 的分布要明顯大于PEG-脂質(zhì)體/DiR ；本實(shí)驗(yàn)中裸鼠為左后足墊接種腫瘤細(xì)胞的模型鼠。
具體實(shí)施例方式通過下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1LyP-I-FAM 和 LyP-l-PEG-DSPE 的合成、純化和表征1. LyP-I-FAM的合成、純化和表征稱取Boc-Cys (Mbzl)-PAM樹脂0. 4167g(取代度0. 6mmol/g)于接肽瓶中，樹脂用 DMF(N, N-二甲基甲酰胺)溶脹，二十分鐘后，抽干。加入約兩倍樹脂體積的TFA(三氟乙酸)攪拌反應(yīng)，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脫去Boc保護(hù)基。用HBTU (苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)的DMF溶液和DIEA (N, N- 二異丙基乙胺)活化 Boc-Gly,樹脂用DMF洗滌后加入Boc-Gly活化液，振搖反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后抽去反應(yīng)液，并用 DMF洗滌樹脂。隨后以上述方法按LyP-I序列順次連接其余氨基酸，最后連接FAM。反應(yīng)結(jié)束后按前述方法洗滌樹脂、TFA脫保護(hù)基。依次用DMF、DCM/MeOH( 二氯甲烷/甲醇，1/1, ν/ ν)洗滌樹脂，真空干燥。將樹脂放入多肽切割管中，加入適量P-cresol (對甲苯酚)，然后通入HF(氟化氫)，冰浴攪拌反應(yīng)Ihr。反應(yīng)結(jié)束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液。濾液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗過濾，棄濾液，以水復(fù)溶沉淀，凍干得LyP-I-FAM純品，以HPLC及MS對其進(jìn)行表征。2. LyP-I-PEG-DSPE的合成、純化和表征2. ILyP-I (2Acm) -Cys 的合成、純化和表征稱取MBHA樹脂甲苯氫胺樹脂)0. 3125g(取代度0. 8mmol/g)于接肽瓶中，樹脂用DMF溶脹，二十分鐘后加入Boc-Cys (Acm)活化液(用HBTU的DMF溶液和DIEA活化)， 振搖反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后抽去反應(yīng)液，并用DMF洗滌樹脂。加入約兩倍樹脂體積的TFA攪拌反應(yīng)，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脫去Boc保護(hù)基。隨后以上述方法按LyP-I序列順次連接其余氨基酸，最后連接Boc-Cys (Mbzl)。反應(yīng)結(jié)束后按前述方法洗滌樹脂、TFA脫保護(hù)基。依次用DMF、DCM/MeOH(l/l)洗滌樹脂，真空干燥。將樹脂放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀 3次。沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液。濾液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗過濾，棄濾液， 以水復(fù)溶沉淀，凍干得LyP-I (2Acm) -Cys純品，以HPLC及MS對其進(jìn)行表征。2. 2LyP-I-PEG-DSPE的合成、純化和表征將上述步驟得到的LyP-I QAcm)-Cys溶于PBS溶液中(pH7. 0)，取 Mal-PEG-DSPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應(yīng)，TLC(薄層層析法)監(jiān)測反應(yīng)，待Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，過量的 LyP-I (2Acm) -Cys和DMF通過透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷凍干燥，得到直鏈的LyP-I (2Acm)-PEG-DSPE0最后，取直鏈LyP-I (2Acm)-PEG-DSPE溶于甲醇中，加入適量檸檬酸溶液和IM的鹽酸溶液。逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應(yīng)， 反應(yīng)結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應(yīng)液透析除去鹽類，冷凍干燥得到 LyP-I-PEG-DSPE，匪R表征其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤動物模型的構(gòu)建裸鼠雙后足墊或單后足墊皮下接種MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞，接種濃度1 X IO6細(xì)胞/ 足墊。SPF級別飼養(yǎng)，接種3周和6周后取各級淋巴結(jié)和主要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，確定腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移時間，為腫瘤分期提供參考。實(shí)施例3LyP-I的體內(nèi)外靶向性驗(yàn)證1. LyP-I體外腫瘤細(xì)胞靶向性驗(yàn)證取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)MDA-MB-435細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶和0. 025%乙二胺四乙酸二鈉消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔IX IO5個細(xì)胞接種于M孔培養(yǎng)板中，每孔體積1ml，將培養(yǎng)板移入二氧化碳培養(yǎng)箱中， 37°C，5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。次日，用含胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的FAM和LyP-I-FAM溶液。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，加入FAM和LyP-I-FAM的系列溶液，37°C孵育4h，吸棄上清液。用PBS溶液洗板兩次，在熒光顯微境下觀察細(xì)胞攝取情況。SPC-A-I細(xì)胞對LyP-I的攝取實(shí)驗(yàn)基本同MDA_MB_435細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，但SPC_A_1 細(xì)胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)液。2. LyP-I體內(nèi)對原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤靶向性的驗(yàn)證MDA-MB-435足墊接種建立淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型。取模型裸鼠2只，尾靜脈注射等摩爾量的FAM和LyP-l-FAM，l小時后用10%水合氯醛溶液麻醉裸鼠，在活體動物成像系統(tǒng)(FX Pro, Kodak, USA)內(nèi)掃描FAM和LyP-I-FAM在裸鼠的體內(nèi)分布，并取其腹股溝、胭和髂淋巴結(jié)置活體動物成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察期離體分布。實(shí)施例4LyP-I-PEG-脂質(zhì)體的制備和表征1. LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC的制備和表征
PEG-脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC(氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/ mPEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55 45 2，mol/mol)，LyP-I修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為HSPC/Chol/mPEG-DSPE/LyP-l-PEG-DSPE(55 45 2 0. 5， mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶媒，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥對小時。加入FITC水溶液水化，60°C水浴震蕩2小時，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(jī)(若脂質(zhì)體體積少于IOmL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過 400,200,100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50 層析柱分離除去未包封的FITC，得脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法測定粒徑。2. LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR的制備和表征制備空白脂質(zhì)體工藝基本同上，但DiR應(yīng)同磷脂一同溶于氯仿成膜，且水化介質(zhì)改為生理鹽水。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法測定粒徑。實(shí)施例5LyP-I-PEG-脂質(zhì)體的體內(nèi)外靶向性驗(yàn)證1. LyP-I-PEG-脂質(zhì)體體外腫瘤細(xì)胞靶向性驗(yàn)證取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)MDA-MB-435細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶和0. 025%乙二胺四乙酸二鈉消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔IX IO5個細(xì)胞接種于M孔培養(yǎng)板中，每孔體積1ml，將培養(yǎng)板移入二氧化碳培養(yǎng)箱中， 37°C，5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。次日，用含胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的PEG-脂質(zhì)體/FITC和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC溶液。 將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，加入PEG-脂質(zhì)體/FITC和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/FITC的系列溶液，37°C孵育lh，吸棄上清液。用PBS溶液洗板兩次，在熒光顯微境下觀察細(xì)胞內(nèi)化情況。2. LyP-I-PEG-脂質(zhì)體體內(nèi)對淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤靶向性的驗(yàn)證2. 1皮下注射取淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型2只，左后足墊組織間隙注射PEG-脂質(zhì)體/DiR和 LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR，4小時后用10%水合氯醛溶液麻醉裸鼠，在活體動物成像系統(tǒng)內(nèi)掃描PEG-脂質(zhì)體/DiR和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠的體內(nèi)分布。2. 2靜脈注射取淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤裸鼠模型2只，尾靜脈注射PEG-脂質(zhì)體/DiR和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR，l小時后將裸鼠處死，取出胭、腹股溝和髂淋巴結(jié)，在活體動物成像系統(tǒng)內(nèi)掃描 PEG-脂質(zhì)體/DiR和LyP-I-PEG-脂質(zhì)體/DiR在各級淋巴結(jié)內(nèi)的分布。
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權(quán)利要求
1.一種用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征在于，由含LyP-I序列的多肽與脂質(zhì)體組成，其中LyP-I序列多肽由兩個半胱氨酸通過二硫鍵連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；所述的 LyP-I氨基酸序列為CGNKRTRGC。
2.按權(quán)利要求1所述的用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的脂質(zhì)體其膜材料選自下述成分a 天然磷脂或合成磷脂，和b 膽固醇，和c 甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，和d 含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物；所述的脂質(zhì)體膜材料成分的摩爾比為a b = 5 1 1 2，a c = 1000 1 1000 100，a d = 1000 1 1000 100。
3.按權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的天然磷脂或合成磷脂選自蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、I"棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
4.按權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征是，所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中甲氧基聚乙二醇分子量為1000 5000，所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中聚乙二醇分子量為1000 8000。
5.按權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物或含LyP-I序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的磷脂選自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
6.按權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征是所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中，LyP-I序列多肽通過共價(jià)鍵形式與聚乙二醇-磷脂連接而成復(fù)合物。
7.按權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征是所述的含LyP-I序列的多肽提供一個游離巰基，聚乙二醇-磷脂提供一個馬來酰亞胺基，兩者發(fā)生特異性反應(yīng)而連接成共價(jià)復(fù)合物；或者含LyP-I序列的多肽提供一個游離氨基，聚乙二醇-磷脂提供一個N-羥基琥珀酰亞胺基，兩者發(fā)生特異性反應(yīng)而連接成共價(jià)復(fù)合物。
8.按權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，其特征是所述的脂質(zhì)體粒徑范圍為20 500nmo
9.權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)在制備用于原位腫瘤或淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤靶向診斷或治療藥物中的用途。
10.按權(quán)利要求9所述的用途，所述的藥物通過靜脈注射、皮下注射或肌肉注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種用于腫瘤的靶向遞藥的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)由含LyP-1氨基酸序列為CGNKRTRGC序列的多肽與脂質(zhì)體組成，其中LyP-1序列多肽由兩個半胱氨酸通過二硫鍵連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可通過皮下組織間隙注射或肌肉注射將脂質(zhì)體被動引流至淋巴系統(tǒng)內(nèi)，通過LyP-1的介導(dǎo)作用靶向至腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。該系統(tǒng)也可直接通過靜脈注射給藥，通過腫瘤EPR效應(yīng)和LyP-1介導(dǎo)作用將其靶向至原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤。本發(fā)明脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可用作原位腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤診斷或治療的藥物靶向遞送。
文檔編號A61K47/42GK102240265SQ20101017434
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者占昌友, 孟慶剛, 謝操, 閆志強(qiáng), 陸偉躍, 顧炳 申請人:復(fù)旦大學(xué)