專利名稱：靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改性高分子聚合物構(gòu)建的藥物和基因載體、制備方法及應(yīng)用，進一步的說是一種靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體、制備方法及應(yīng)用，屬于功能化脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
基因治療主要是向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段以糾正或補償基因的缺陷或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的，而基因投遞系統(tǒng)則是指將目的基因、基因片斷或短鏈干擾RNA導(dǎo)入靶細(xì)胞以達到治療目的的方式?；蛲哆f系統(tǒng)是惡性腫瘤基因治療最為關(guān)鍵的瓶頸問題，也是制約惡性腫瘤基因治療從實驗研究到臨床應(yīng)用的核心技術(shù)問題?；蛲哆f系統(tǒng)主要依賴于載體系統(tǒng)，而理想的基因載體應(yīng)具備(1)靶向特異性，并且可被免疫系統(tǒng)識別；( 高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；C3)無毒性，對病人及環(huán)境安全無害；(4)有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長期表達。而本發(fā)明的主要目的是構(gòu)建一種制備簡單、成本低廉、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因載體系統(tǒng)。目前，在基因載體的設(shè)計上，大致可分為兩大類病毒類和非病毒類。病毒載體效率較高，但存在導(dǎo)向性差、攜帶能力低、免疫原性和潛在致瘤性等缺點。非病毒性載體主要是針對病毒載體的缺點而研制的，并具有低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制備等優(yōu)點，其主要包括真核細(xì)胞表達質(zhì)粒載體、陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體、聚合物嵌段共聚物和膠
>κ寸。常用的可用于基因轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物包括聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)、 多聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(polyehylenimine，PEI)、天然高分子生物材料殼聚糖、樹枝狀大分子、及由這些陽性聚合物載體所構(gòu)建的聚合物膠束系統(tǒng)和聚合物微球(聚乳酸類)；如聚乙二醇(PEG)修飾的PLL(PEG-PLL)、硬脂?；圪嚢彼?、轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的PLL、 PEG-PEI、PEG-殼聚糖、PEI-殼聚糖、殼聚糖季銨鹽等。這些材料作為轉(zhuǎn)基因的載體有其優(yōu)越性，然而也或多或少的存在轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性差、部分材料毒性大、制備工藝復(fù)雜等問題；再者微球材料工藝中使用的有機金屬催化劑、有機溶劑和穩(wěn)定劑的殘存都可能在轉(zhuǎn)染中引起不容忽視的副作用，微球包裹外源基因也可能在制備消毒過程中受損。陽離子脂質(zhì)體因具有優(yōu)良的特性(無免疫原性、制備簡單、使用方便、轉(zhuǎn)染效率高等)而在科研及臨床實驗中廣泛應(yīng)用，其通常由一個陽離子兩親化合物和一個中性脂質(zhì)組成。常用的陽離子脂質(zhì)材料有N-[l-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲銨(DOTMA)、 1，2-二油酰-3-三甲銨基丙烷(DOTAP)、3 β [Ν_(Ν，，N，- 二甲氨基乙基)氨甲?；?膽固醇(DC-Chol)等。但陽離子脂質(zhì)體也存在毒性大、成本高、針對性差(對特定腫瘤可能轉(zhuǎn)染效率低下)等缺點；而將陽離子脂質(zhì)體技術(shù)與陽離子聚合物技術(shù)相結(jié)合所開發(fā)的陽離子高分子脂質(zhì)體則可能具有更優(yōu)良的特性，其具有脂質(zhì)體和高分子膠束的優(yōu)點，可將二者的優(yōu)勢互補，并充分克服陽離子脂質(zhì)體所存在的缺點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體，是構(gòu)建一種制備簡單、成本低廉、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因載體系統(tǒng)。本發(fā)明的目的還是提供一種上述靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體制備方法。本發(fā)明另一目的是提供一種上述靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的應(yīng)用。本發(fā)明采用具有雙親性特性的高聚物物質(zhì)高分子季銨鹽來代替普通陽離子脂質(zhì)體中的陽性成分，再與普通陽離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分組合來制備陽離子高分子脂質(zhì)基因載體，該陽離子高分子脂質(zhì)基因載體具有與普通脂質(zhì)體相類似的雙層膜結(jié)構(gòu)，可包載藥物、結(jié)合基因，并介導(dǎo)DNA/siRNA的轉(zhuǎn)染，可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類多，轉(zhuǎn)染效率高，可在含血清的培養(yǎng)液中使用，制備和操作簡單。本發(fā)明所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體，其關(guān)鍵特征在于使用高分子季銨鹽來代替普通陽離子脂質(zhì)體中所含有的陽性成分，因此可以稱之為陽離子高分子脂質(zhì)體。陽離子高分子脂質(zhì)體是將陽離子脂質(zhì)體技術(shù)與陽離子聚合物技術(shù)相結(jié)合所開發(fā)的一種與陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)相同的納米基因載體系統(tǒng)，其具有更優(yōu)良的特性，并有脂質(zhì)體和高分子膠束的優(yōu)點，可將二者的優(yōu)勢互補。本發(fā)明的陽離子高分子脂質(zhì)體不僅具備小分子脂質(zhì)體的優(yōu)點，且制備方法簡單，穩(wěn)定性好，藥物滲漏少，同時含有氨基和羧基等官能團， 易進行多功能化組裝。本發(fā)明中的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體由高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分組成，其中，高分子季銨鹽與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為0.05 20 1，優(yōu)先選擇的高分子季銨鹽與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為1 8 1。高分子季銨鹽作為主膜材構(gòu)成高分子脂質(zhì)基因載體的主體，所述的基因載體為具有類似脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)的納米粒，粒徑在1 lOOOOOnm， 優(yōu)選10 500nm。本發(fā)明中所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體中，所述的高分子季銨鹽是可溶于極性有機溶劑(氯仿、二氯甲烷、乙醇等)和水，高分子季銨鹽在極性有機溶劑或水溶液中的溶解度均大于0. lmg/mL，高分子季銨鹽的重均分子量在1000 1000000 之間，優(yōu)選為2000 200000，高分子季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)中可以含有氨基、羧基、羥基等官能團，具體為殼聚糖基-季銨鹽、聚乙烯亞胺(PEI)基-季銨鹽、海藻酸鈉基-季銨鹽、多聚賴氨酸基-季銨鹽和聚酯胺(Poly EsterAmine, PEA)基-季銨鹽，其中優(yōu)選為聚乙烯亞胺基三(十二烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十六烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨、海藻酸鈉基三(十二烷基)氯化銨、多聚賴氨酸基三(十八烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十二烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十六烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十八烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基甲基二(十八烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十二烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十六烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十八烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基甲基二(十八烷基)氯化銨、殼聚糖基三甲基氯化銨、殼聚糖羥丙基三甲基氯化銨及其上述季銨鹽的相應(yīng)溴化物。本發(fā)明中所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體的制備方法為脂質(zhì)體的通用制備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、復(fù)乳法、離心法、PH梯度法、注入法和混溶法等，其中可優(yōu)選為薄膜分散法和逆向蒸發(fā)法；其中薄膜分散法的基本步驟為將殼聚糖長鏈烷基季銨鹽(質(zhì)量濃度 100% )和脂質(zhì)成分(質(zhì)量濃度0. 60% )共溶于有機溶劑氯仿中，混勻作為有機相； 除去有機溶劑使成薄膜，然后加入水相振蕩使脂質(zhì)膜水化，水相為水相為0. 9%的生理鹽水或pH = 6 9的緩沖溶液。其中逆向蒸發(fā)法的基本步驟為將殼聚糖長鏈烷基季銨鹽(質(zhì)量濃度 100% )和脂質(zhì)成分(質(zhì)量濃度0. 60% )共溶于有機溶劑氯仿中，混勻作為有機相； 將水相與有機相(水相和有機相的比例為1/6 6/1)混合，超聲乳化后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑。本發(fā)明中所述的脂質(zhì)成分為構(gòu)成普通脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)體的基本成分，具體為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺ΦθΡΕ)、3β-[Ν-(Ν’，Ν’ - 二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇 (DC-Chol)、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、 二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一種或多種，如2-3種的脂質(zhì)成分，優(yōu)選為膽固醇、DOPE和DC-Cho 1。本發(fā)明所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的可以用于制備基因藥物。所述的基因藥物可為有機藥物、水溶性藥物、水不溶性藥物、基因DNA/siRNA、探針和診斷試劑，如治療基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、 脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán)胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿)、抑制蛋白質(zhì)合成的藥(如阿霉素、柔紅霉素、光輝霉素)、影響微管蛋白質(zhì)組裝和紡錘絲形成的藥物(長春堿、依托泊苷)。本發(fā)明所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體可通過對高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體進行修飾或組裝而增加納米粒的使用功能，所用的修飾制劑包括抗體配體(腫瘤相關(guān)抗原標(biāo)志物)、蛋白和酶(酶類標(biāo)志物)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、激素、肽類、聚乙二醇 (PEG)、基因和小分子制劑等；優(yōu)選為甲胎蛋白、癌胚抗原、組織多肽抗原、淀粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、生長激素、轉(zhuǎn)化生長因子、雌激素、孕激素、兒茶酚胺類及其衍生物、ras基因家族及其表達產(chǎn)物、myc基因家族及其表達產(chǎn)物、表皮生長因子受體、葉酸、三苯氧胺、磁性顆粒。使用以上物質(zhì)對基因載體進行改性時所使用的方法包括直接對基因載體納米粒的表面修飾或先制備含活性成分的前體物質(zhì)再進行組裝等方法。其中葉酸修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒對葉酸受體高表達的腫瘤細(xì)胞具有靶向性，如腫瘤細(xì)胞IGR0V1、KB3-1、Ishikawa和MCF-7等；葉酸修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒的制備方法優(yōu)選為a 制備前體物質(zhì)葉酸修飾的高分子季銨鹽；b 將高分子季銨鹽(質(zhì)量濃度 100% )和脂質(zhì)成分(質(zhì)量濃度0. 60% )溶于氯仿中，將葉酸修飾的高分子季銨鹽(質(zhì)量濃度0. 39% )溶于水相，然后使用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備葉酸修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒。
其中PEG修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒具有體內(nèi)長循環(huán)功能和被動靶向功能，其制備方法優(yōu)選為a 制備前體物質(zhì)PEG修飾的高分子季銨鹽；b 將高分子季銨鹽(質(zhì)量濃度 100% )和脂質(zhì)成分(質(zhì)量濃度0. 60% )溶于氯仿中，將PEG修飾的高分子季銨鹽(質(zhì)量濃度0. 39% )溶于水相，然后使用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備PEG修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒。其中EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒對EGFR受體高表達的腫瘤細(xì)胞具有靶向性，如腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和MCF-7等；EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)納米粒的制備方法優(yōu)選為可先制備在水相當(dāng)中濃度為0. 1 5mg/mL的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體納米粒，然后使用偶聯(lián)劑將EGFR抗體偶聯(lián)到高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體的表面既得EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體，其中高分子季銨鹽、脂質(zhì)成分和 EGFR抗體的質(zhì)量組成依次為1% 100%，0.1% 60%，0.1% 39%。本發(fā)明所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體的用途，包括對藥物和基因的遞送、緩控釋、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥特性及對疾病的診斷和治療；高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體作為基因轉(zhuǎn)染的非病毒載體時，與商用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 相比，具有更低的細(xì)胞毒性和更高的基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體納米粒，采用與陽離子脂質(zhì)體具有更大相似性的陽離子高分子脂質(zhì)基因載體來構(gòu)建功能化的、安全性好、效率高的納米基因載體系統(tǒng)，并充分利用陽離子高分子脂質(zhì)體所具有的優(yōu)點以克服陽離子脂質(zhì)體的缺點。陽離子脂質(zhì)體與陽離子高分子脂質(zhì)體的組成及性質(zhì)，N-[l-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲銨(DOTMA)、1，2-二油酰-3-三甲銨基丙烷(DOTAP)等對照如下表 1。表 1
陽離子脂質(zhì)體陽離子髙分子脂質(zhì)體DDAB . DTAB、TTAB , CTAB, DC-ChoUDDAB-CMC、DTAB-CMC , TTAB-CMC ,ChoK DOPE等的不同組合CTAB-CMC. DC-Choi, ChoK DOPE等的組不同組合成注二甲基雙十八燒基漠化銨(DDAB)；注O·羧甲基殼聚糖(CMC);膽固醇(Choi);十二燒基三甲基溴化按(DTAB):3β - [Ν-(Ν', N·-二甲基胺乙基>胺基甲故基]十四燒基三甲基溴化錢(ΤΓΑΒ):-￡固醉(DC-Choi)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；二袖乙醇胺(DOPE) 物理化學(xué)穩(wěn)定性較差 物理化學(xué)穩(wěn)定性較好性 不易進行表面修飾，功能單一 表面含官能團，易進行修飾；質(zhì) 針對性差 可裉據(jù)需要進行耙向性設(shè)計，提高基因轉(zhuǎn)染 成本較商效率和針對性 成本較低 本發(fā)明所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)納米基因載體系統(tǒng)具有以下特占.
^ \\\ ·(1)將功能強大的陽離子高分子脂質(zhì)體用做基因載體。(2)陽離子高分子脂質(zhì)體具有靈活多樣、基因轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、制備方法簡便等優(yōu)點。(3)將陽離子高分子脂質(zhì)體進行靶向性設(shè)計可得到專一性好的基因載體系統(tǒng)。為提高載體系統(tǒng)針對特定腫瘤的基因遞送效率，即專一性，則可充分利用陽離子高分子脂質(zhì)體相對陽離子脂質(zhì)體所具有的功能化修飾容易的優(yōu)點。利用腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體配體結(jié)合原理，可選擇對乳腺癌具有較好靶向功能的葉酸或EGFR抗體對陽離子高分子脂質(zhì)體進行修飾來增強其針對乳腺癌的基因轉(zhuǎn)染效果，同時也采用多靶點聯(lián)用的方法來提高載體的專一性。
圖1為陽離子高分子脂質(zhì)體的微觀結(jié)構(gòu)圖(透射電子顯微鏡照片)及功能化組裝示意圖；a.單層陽離子高分子脂質(zhì)體(聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨/膽固醇)；b.大單層陽離子高分子脂質(zhì)體(聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨/膽固醇)。圖2為使用逆向蒸發(fā)法所制備的PEG修飾的陽離子高分子脂質(zhì)體多聚賴氨酸基三 (十八烷基)氯化銨/膽固醇(a)和葉酸修飾的陽離子高分子脂質(zhì)體多聚賴氨酸基三(十八烷基)氯化銨/膽固醇(b)的透射電子顯微鏡照片；由圖可見陽離子高分子脂質(zhì)體的粒徑較小，且分布均勻。圖3是用流式細(xì)胞儀測定的陽離子高分子脂質(zhì)體羧甲基殼聚糖基三(十八烷基) 氯化銨/DOPE (0QC/D0PE)和陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率圖。其中Lipofectamine^OOO為陽離子脂質(zhì)體陽性對照，陽離子高分子脂質(zhì)體中羧甲基殼聚糖基三(十八烷基)氯化銨和DOPE的質(zhì)量比為2 1，其中A Lipofectamine 2000 組；B =OQC 膠束組；C :0QC/D0PE 組，逆向蒸發(fā)法制備；D :0QC/D0PE組，薄膜法制備。圖4是用熒光顯微鏡觀察陽離子高分子脂質(zhì)體賴氨酸殼聚糖基甲基二(十八烷基)氯化銨(LDQA)/DOPE的基因轉(zhuǎn)染照片。LDQA/D0PE包載綠色熒光蛋白質(zhì)粒后對細(xì)胞進行基因?qū)?左暗場；右 明場)，A =Lipofectamine 2000 組；B =LDQA 膠束組；C :LDQA/D0PE 組，逆向蒸發(fā)法制備；D LDQA/D0PE組，薄膜法制備。
具體實施例方式下面的實施例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實施例1 本實施例探討采用逆向蒸發(fā)法時聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨(PQA)和膽固醇的不同配比對陽離子高分子脂質(zhì)體粒徑產(chǎn)生的影響。將不同配比的PQA(重均分子量為2萬)和膽固醇共溶于二氯甲烷中，混勻得溶液I ；準(zhǔn)備去離子水溶液II，其中溶液I和溶液II的比例為1 2;將兩種溶液混合后，充分超聲乳化，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除盡二氯甲烷得高分子脂質(zhì)體溶液。由表2可見，調(diào)整 PQA和膽固醇的質(zhì)量配比可以得到不同粒徑大小的高分子脂質(zhì)體，所得的陽離子高分子脂質(zhì)體在水溶液中的粒徑大小分布也都比較均勻。其中圖1為PQA/膽固醇陽離子高分子脂質(zhì)體的TEM照片。表權(quán)利要求
1.一種靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體，其特征在于所述的高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體由高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分組成，其中，高分子季銨鹽與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為0. 05 20 1 ；粒徑在1 IOOOOOnm ；所述的高分子季銨鹽是在極性有機溶劑或水中的溶解度大于0. lmg/mL，重均分子量在 1000 1000000之間，分子結(jié)構(gòu)中含有季銨鹽基團的高分子物質(zhì)，其中的季銨鹽優(yōu)選為氯化物和溴化物；所述的脂質(zhì)成分為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3 β _[N-(N’，N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一種或2-3種，優(yōu)選為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺或3 β-[N-(N’，N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體，其特征在于所述的高分子季銨鹽為聚乙烯亞胺基-季銨鹽、海藻酸鈉基-季銨鹽、殼聚糖基-季銨鹽、多聚賴氨酸基-季銨鹽和聚酯胺基-季銨鹽。
3.如權(quán)利要求2所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體，其特征在于所述的高分子季銨鹽為聚乙烯亞胺基三(十二烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十六烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨、海藻酸鈉基三(十二烷基)氯化銨、多聚賴氨酸基三(十八烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十二烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十六烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基三(十八烷基)氯化銨、羧甲基殼聚糖基甲基二(十八烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十二烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十六烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基三(十八烷基)氯化銨、賴氨酸殼聚糖基甲基二(十八烷基)氯化銨、 殼聚糖基三甲基氯化銨、殼聚糖羥丙基三甲基氯化銨及其上述季銨鹽相應(yīng)的溴化物。
4.一種如權(quán)利要求書1所述的靶向性高分子季銨鹽類陽離子脂質(zhì)基因載體的制備方法，其特征在于所提供下述的薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法獲得薄膜分散法的基本步驟為將質(zhì)量濃度 100%的高分子季銨鹽和質(zhì)量濃度0. 60%的脂質(zhì)成分共溶于極性有機溶劑中，混勻作為有機相，除去有機溶劑使成薄膜，然后加入水相使脂質(zhì)膜水化， 水相為0. 9%的生理鹽水或pH = 5 9的緩沖溶液；逆向蒸發(fā)法的基本步驟為將質(zhì)量濃度 100%的高分子季銨鹽和質(zhì)量濃度0. 60%脂質(zhì)成分共溶于極性有機溶劑中，混勻作為有機相；水相為0. 9%的生理鹽水或pH = 6 9的緩沖溶液；將水相與有機相混合，水相和有機相的體積比為1 6 6 1，超聲乳化后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑；所述的高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分同權(quán)利要求1 3所述。
5.一種如權(quán)利要求4所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是用于制備基因藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是所述的基因藥物為治療基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、巰嘌呤、氟尿嘧啶、羥基脲、環(huán)胞苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿、阿霉素、柔紅霉素、光輝霉素、長春堿、依托泊苷中的一種或幾種。
7.如權(quán)利要求6所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是所述的制備是對靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體進行表面修飾或先制備含活性成分的前體物質(zhì)再進行組裝；所用的修飾劑為聚乙二醇、EGFR抗體、葉酸、三苯氧胺、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、組織多肽抗原、淀粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、生長激素、轉(zhuǎn)化生長因子、雌激素、孕激素、兒茶酚胺類及其衍生物、ras基因家族及其表達產(chǎn)物、myc基因家族及其表達產(chǎn)物、表皮生長因子受體、 磁性顆粒。
8.如權(quán)利要求6所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是所述的修飾劑為葉酸時，需要先制備前體物質(zhì)葉酸修飾的高分子季銨鹽；然后，將質(zhì)量濃度為0. 39%的葉酸修飾的高分子季銨鹽、質(zhì)量濃度為 100%的高分子季銨鹽和質(zhì)量濃度為0. 60%的脂質(zhì)成分使用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備葉酸修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體；所述的高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分如權(quán)利要求1所述。
9.如權(quán)利要求6所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是所述的修飾劑為聚乙二醇時，需要先制備前體物質(zhì)聚乙二醇修飾的高分子季銨鹽；然后，將質(zhì)量濃度為0. 39%的聚乙二醇修飾的高分子季銨鹽、質(zhì)量濃度 100%的高分子季銨鹽和質(zhì)量濃度為0. 60%脂質(zhì)成分使用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備聚乙二醇修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體；所述的高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分如權(quán)利要求1所述。
10.如權(quán)利要求6所述的靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體的用途，其特征是所述的修飾劑為EGFR抗體時，可先制備在水相當(dāng)中濃度為0. 1 5mg/mL的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體，然后使用偶聯(lián)劑將EGFR抗體偶聯(lián)到高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體的表面既得EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質(zhì)基因載體，其中高分子季銨鹽、脂質(zhì)成分和EGFR抗體的質(zhì)量組成依次為1% 100%，0.1% 60%，0.1% 39%;所述的高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分如權(quán)利要求1所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向性季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體、制備方法及應(yīng)用。由高分子季銨鹽和脂質(zhì)成分按質(zhì)量比為0.05～20∶1制成季銨鹽類陽離子高分子脂質(zhì)基因載體；可通過組裝或修飾的方法進行改性，制備葉酸或EGFR抗體修飾的陽離子高分子脂質(zhì)基因載體。基因轉(zhuǎn)染實驗的結(jié)果表明在293T和NIH-3T3細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染效率與陽性對照陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000相當(dāng)；EGFR抗體修飾的陽離子高分子脂質(zhì)體在肝癌Huh-7和乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率高于LipofectamineTM2000。所述的陽離子高分子脂質(zhì)基因載體系統(tǒng)具有較好的生物相容性，細(xì)胞毒性低，可作為優(yōu)良的非病毒基因給藥載體。
文檔編號A61K9/127GK102234658SQ20101015381
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者孫彥明, 李曉昱, 梁曉飛, 段友容, 王琪 申請人:上海市腫瘤研究所