專利名稱:包含酶的組合物及酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種組合物,該組合物包含至少一種生物活性蛋白酶,或者至少一種生物活性蛋白酶和至少一種生物活性糖苷酶,其中蛋白酶和糖苷酶以活性比為1000000U∶1U-1U∶1000000U存在。此外,本發(fā)明涉及生產(chǎn)這種包含組合物的酶的工藝和除齲齒的工藝。本發(fā)明還涉及使用包含組合物的酶生產(chǎn)除齲的處理劑。
背景技術(shù):
齲齒也稱牙齒腐爛,它是人類最常見的疾病之一。齲齒是牙齒受到細(xì)菌損害引起的,它甚至?xí)寡例X脫落。牙齒在外部受到包裹著柔軟牙質(zhì)的硬釉質(zhì)的覆蓋所保護(hù),柔軟牙質(zhì)又圍住所謂的牙髓。釉質(zhì)本身由約95%的無機(jī)化合物,特別是羥磷灰石和約5%的有機(jī)化合物和水組成。牙質(zhì)比釉質(zhì)軟,由約65%的無機(jī)化合物(主要是羥磷灰石)、約20%的有機(jī)化合物(主要是膠原和多糖)和約15%的水。
齲齒病通常起因于齒菌斑形成和由齒菌斑發(fā)展的牙垢。齒菌斑是牙齒上的淺白色膜,主要由細(xì)菌、蛋白質(zhì)和多糖組成,其含量使得它難以抹去。術(shù)語“齒菌斑”是指牙齒表面上存在的所有微生物及其有機(jī)基質(zhì)。齲齒和牙垢可由齒菌斑發(fā)展而來,后者對齒齦損害很大,由鈣化齒菌斑構(gòu)成。即使仔細(xì)刷牙,牙垢也不能從牙齒表面清除。
齲齒分幾步由碳水化合物,特別是糖經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵成酸而形成。由所述細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸首先溶解堅(jiān)硬的釉質(zhì),而細(xì)菌主要侵襲有機(jī)組分,如殘留在牙齒上的食物顆粒。
如果釉質(zhì)受細(xì)菌引起的酸的影響而穿孔、變軟,細(xì)菌可到達(dá)牙垢下面的牙質(zhì)層,使它受到感染變成齲齒。齲齒病常常使牙質(zhì)下面的牙髓發(fā)炎。牙髓發(fā)炎極其疼痛,如果不迅速治療,可對患者的健康造成嚴(yán)重威脅。
釉質(zhì)或釉質(zhì)和牙質(zhì)溶解最多的區(qū)域稱作齲損害區(qū)。齲損害區(qū)通常由多種不同的化合物構(gòu)成,部分為細(xì)菌源,部分來自唾液和食物顆粒。
與其他活體組織的損害相反,由齲齒引起的牙齒損害無法通過內(nèi)源途徑修復(fù)。只有在齲齒早期,才有可能通過使牙齒的堅(jiān)硬物質(zhì)的補(bǔ)充礦質(zhì)來治愈。在齲齒后期,則需要通過去除被齲損害的牙齒區(qū)域來進(jìn)行治療。由去除受齲齒影響的牙齒組織產(chǎn)生的空隙稱為齲洞。受齲齒影響的牙齒組織去除后,通??稍邶x洞內(nèi)一定尺寸范圍內(nèi)向上填充人造填料。
對受齲損害的牙齒一般用牙鉆鉆掉齲齒組織而除去。根據(jù)指征和技術(shù),鉆速可達(dá)40000rpm。所用齒鉆是硬金屬或金剛石儀器。由于鉆的過程會釋放大量的熱,且除去的牙齒物質(zhì)會污染治療的部位,通常需要水和空氣的混合物來冷卻和清潔齲洞。
但是,這種用牙鉆除齲齒的治療方法有若干弊端。
例如,一個嚴(yán)重的弊端是該處理方法通常會給患者帶來相當(dāng)大的痛苦。鉆牙之所以引起疼痛,是因?yàn)榛颊吒裢飧械叫D(zhuǎn)的鉆牙器具在牙齒區(qū)域常常使發(fā)炎部位受到細(xì)微振動。此外,患者聽到牙鉆的嘯聲也非常不舒服。因此,許多患者通常要等待很長時間才去治療受齲齒損壞的牙齒。
此治療方法的另一個弊端是鉆牙會損害或除去健康的牙齒物質(zhì)。但是,除去健康的牙齒物質(zhì)一般是不合乎需要的。
用鉆處理受齲齒影響的牙齒的另一個弊端是,盡管齲齒組織鉆掉了,細(xì)菌殘余常留在受損害的部位。這種細(xì)菌殘余會引起有害的副作用,如牙髓和牙根發(fā)炎,而對它們的治療往往比開始的預(yù)治療引起更大的痛苦。
除了上述經(jīng)典的鉆牙治療外,最近幾年有越來越多的對牙齒硬物質(zhì)的溫和治療方法。
例如,WO 98/20838描述了除齲齒的化學(xué)-機(jī)械方法,它基本上無痛,也不用牙鉆。為了溶解齲齒,強(qiáng)氧化劑次氯酸鈉和氨基酸聯(lián)用。這種方法的弊端是作為強(qiáng)氧化劑的次氯酸鈉與感染的齲齒組織和未感染的健康牙齒組織的組分非特別地反應(yīng)。
此外,該方法僅僅是軟化了表面上的齲部分,氧化效果一下降,必須再次施用次氯酸鈉溶液。因此,需要頻繁施用溶液。
臨床經(jīng)驗(yàn)表明,上述化學(xué)-機(jī)械方法非常耗時,并且不一定成功。因此,患者最后不得不又回到牙鉆。
WO 96/07329描述了治療和防止齲齒及牙周病的方法。該專利建議用酶與口腔中的病菌作斗爭,所述酶用基因工程方法獲得。該專利提到溶菌酶和葡聚糖酶是合適的酶。作為防治齲齒的起點(diǎn),用酶除掉齒菌斑。該文獻(xiàn)沒有提及對齲齒的治療。
類似地,EP 0 824 910A2描述了用某些酶治療齒菌斑的方法。該文獻(xiàn)也沒有提及對齲齒的治療。
WO 92/10165描述了含有一定量的蛋白酶和鈣的絡(luò)合劑及其他物質(zhì)的組合物,用于清除假體上的齒菌斑。在此情況下,較好采用在中性或堿性環(huán)境中工作的蛋白酶。該文獻(xiàn)也沒有提及對齲齒的治療。
WO 97/38669涉及分別避免形成齒菌斑和除去齒菌斑的組合物,所述組合物包含糖苷酶、葡聚糖酶和變位酶,以及任選其他酶,如蛋白酶。據(jù)描述,該文獻(xiàn)所用的所有酶都在6-8的pH范圍內(nèi)使用。該組合物可用于牙膏、牙粉,或沖洗。該文獻(xiàn)也沒有提及對齲齒的治療。
WO 98/26807介紹了對表面進(jìn)行清潔和消毒的方法,如用塑料或金屬制成的工作表面,該表面涂有生物膜,其中所用組合物包含酶。該文獻(xiàn)也沒有提及對齲齒的治療。
US 4355022描述了用溶菌酶和絡(luò)合劑EDTA(乙二胺四乙酸)聯(lián)用防治齲齒的方法。該文獻(xiàn)也沒有提及對齲齒的治療。
因此,需要一種組合物,用它可以在日常生活中以簡單、無痛方式除去受齲齒感染的牙齒組織。此外,需要一種組合物,用它除齲齒時不會或可以避免侵襲和損害值得保留的健康牙齒物質(zhì)。另外,需要一種除齲齒組合物,它能保證在治療齲齒后基本上不會保留細(xì)菌殘余。此外,需要一種簡單、無痛地治療齲齒的方法。
一般地,牙科醫(yī)生需要用多種方法才能判定齲洞是否“干凈”,即沒有齲殘余。但是,牙得醫(yī)生更經(jīng)常地靠獨(dú)特的聲信號來判斷,這種聲信號是用牙探針刮新形成的齲洞表面時產(chǎn)生的。無齲牙質(zhì)用這種牙探針刮時發(fā)出清脆的聲音,這是因?yàn)辇x洞壁中無機(jī)材料比例高。盡管此項(xiàng)測試通常是確定齲洞是否不含齲質(zhì)的最簡便的方法,而且其可靠性高,但它未必剛好探測到除去牙齒物質(zhì)的點(diǎn),因而不能準(zhǔn)確判定該齲洞是無齲的。通常,為了使牙探針法能獲得所需結(jié)果,從牙齒上除去的物質(zhì)的量高于必要的。以下事實(shí)可以解釋這一點(diǎn),即稍微脫礦化的牙齒物質(zhì)沒有齲齒細(xì)菌,但已部分脫礦化,因而可以當(dāng)作健康牙齒處理,但用牙探針刮時不會發(fā)出典型的刮擦聲。因此,長期以來,一直需要選擇一種從齲洞中除齲的材料,它不用牙鉆,既可除齲,又基本上不觸及較軟但健康的牙齒物質(zhì),或者除齲和軟化,部分脫礦化的牙齒材料,以便能夠依賴牙探針刮擦試驗(yàn)。
因此,本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供一種組合物,用它能滿足上述一種或多種需要。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供除齲的治療方法,用它可以滿足上述一種或多種需要。
發(fā)明內(nèi)容
因此,本發(fā)明的第一種實(shí)施方式涉及一種組合物,它包含至少一種生物活性蛋白酶和至少一種生物活性糖苷酶,其中蛋白酶與糖苷酶的酶活性比為1000000∶1-1∶1000000,其中總酶活性超過2U/ml。
一個酶單位(縮寫為U)是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘將1μmol相應(yīng)的酶底物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酶所需的酶量。對于蛋白酶K,U與單位mAnson有關(guān)。為簡便起見,本文所用縮寫字母U也用來描述蛋白酶K,其中縮寫字母U表示單位mAson。因此,對于蛋白酶K,用酶單位U表示的酶活性比也適用于蛋白酶K專用的酶單位mAnson。
在本發(fā)明中,總酶活性[U/ml]涉及液體、糊狀產(chǎn)品和干燥產(chǎn)品,例如完全由酶與任選的一種或多種干燥輔劑組成。
本發(fā)明所用酶一般可從植物、動物或真菌以及細(xì)菌或酵母中分離出來。它們也可以用生物工程技術(shù)生產(chǎn)。合適的酶有從動物、細(xì)菌或酵母中分離的酶,如從豬或雞得到的酶。此外,合適的酶還包括從鏈霉菌、青霉菌、梭菌、曲霉菌或麥軸霉中提取的酶。優(yōu)選從灰色鏈霉菌、溶組織梭菌、構(gòu)巢曲霉菌、青霉菌或麥軸霉中提取的酶。
在本發(fā)明中,術(shù)語“蛋白酶”是指所有能通過水解肽鍵用蛋白酶解方法轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的酶。
本發(fā)明所用蛋白酶是用來催化可能存在于齲齒損害上的蛋白質(zhì)組分的分解的。為此,通常所有能催化蛋白質(zhì)和肽降解的蛋白酶都是合適的。但是在本發(fā)明中,那些能夠催化存在于牙齒材料上的膠原纖維的分解的蛋白酶,或者至少能催化膠原纖維結(jié)構(gòu)中的變化,使得膠原纖維在蛋白酶反應(yīng)后具有更好的溶解性的蛋白酶尤其合適。
本發(fā)明所用蛋白酶例如有肽酶、肽基肽酶、二肽酶、二肽基肽酶、寡肽酶、蛋白酶、內(nèi)肽酶、外肽酶。
適合本發(fā)明的蛋白酶也可以根據(jù)參與蛋白酶解催化的氨基酸或輔因子來進(jìn)行分類。因此,在本發(fā)明中,一般所有的蛋白酶類都可以使用,如絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。一般地,組合物中所含蛋白酶應(yīng)當(dāng)在一定條件下使用,該條件使得各蛋白酶催化齲齒損害中存在的蛋白質(zhì)組分的降解。
一方面,本發(fā)明提供了一種pH值為4.0或更低的組合物,它包含水、酸、胃蛋白酶和流變添加劑,其中胃蛋白酶的濃度為1-50000U/mg,組合物的粘度為10-1000mPas。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物還包含聚醚或兩性表面活性劑,或聚醚和兩性表面活性劑的混合物。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含抑制劑。
另一方面,本發(fā)明提供了一種包含組分A和B的組合物,其中 a)組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶最有活性時的pH值; b)組分B包含水、酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶最有活性時的pH值。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分A包含的胃蛋白酶的活性小于50000U/ml。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分A包含小于20mg胃蛋白酶/ml。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分A包含磷酸鹽緩沖液的pH值為5-6。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分B包含磷酸的pH值為1.5-4.0。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分A包含作為增稠劑的多糖。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分B包含聚乙二醇或甜菜堿,或二者。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,組分B包含流變添加劑。
再一方面,本發(fā)明提供了酶的用途,其特征在于所述酶在pH值低于7時具有蛋白酶解活性,由此可制備除齲的處理劑。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,酶在pH值最多為4時具有最佳催化作用。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述酶是胃蛋白酶。
又一方面,本發(fā)明涉及糖苷酶在制備除齲處理劑中的用途。
另一方面,本發(fā)明提供了一種儲存和分發(fā)液體的多室器具,其特征在于至少有一個室包含組分A,至少有一個室包含組分B,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶最有活性時的pH值;組分B包含水、酸、流變添加劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶最有活性時的pH值。
另一方面,本發(fā)明提供了一種組合物,它包含至少一種生物活性蛋白酶和至少一種生物活性糖苷酶以及至少一種緩沖液,其中蛋白酶與糖苷酶的酶活性比為1000000∶1-1∶1000000,其中總酶活性至少2U/ml。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含作為蛋白酶的至少一種蛋白酶K、膠原酶或鏈酶蛋白酶或以上兩種或多種酶的混合物。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含作為糖苷酶的至少一種溶菌酶型、α-淀粉酶型或葡聚糖酶型的糖苷酶,或以上兩種或多種酶的混合物。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少兩種類型的蛋白酶和至少一種類型的糖苷酶。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含蛋白酶K、膠原酶、溶菌酶和葡聚糖酶。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少一種溶劑。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少一種極性溶劑。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少一種濃度約為0.001-10mol/l的緩沖液。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少一種磷酸鹽緩沖液。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述組合物包含至少一種輔劑,它們選自以下輔劑中的一種或多種 i.絡(luò)合劑 ii.酶底物 ii i.酶效應(yīng)物 iv.增稠劑 v.防腐劑 vi.穩(wěn)定劑。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述至少一種酶在pH值范圍為1-10之間具有酶活性。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述至少一種酶在pH值范圍為5-8之間具有酶活性。
另一方面,本發(fā)明提供了一種制備上述組合物的方法,其特征在于混合至少一種生物活性蛋白酶和至少一種生物活性糖苷酶,所述組合物中蛋白酶與糖苷酶的酶活性比為1000000∶1-1∶1000000,總酶活性至少2U/ml。
另一方面,本發(fā)明提供了一種包含至少兩種酶的試劑盒,其特征在于所述酶可溶混,得到上述組合物。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述試劑盒包含獨(dú)立的溶劑。
另一方面,本發(fā)明提供了一種包含上述組合物和至少一種處理溶液的試劑盒,其特征在于,所述處理溶液包含至少一種蛋白酶,該蛋白酶在酸性pH值低于4時具有最佳蛋白酶解催化作用的蛋白酶。
另一方面,本發(fā)明涉及上述組合物的用途,用于制備除齲的治療試劑。
具體實(shí)施例方式 一般地,本發(fā)明的組合物可以只包含一種蛋白酶,但也可以包含兩種或多種不同的蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式,組合物可包含一種蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,組合物可包含約1-10種不同的蛋白酶,優(yōu)選包含1-6種,更優(yōu)選包含1-4種,更優(yōu)選包含2-3種,更優(yōu)選包含2種不同的蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,組合物包含至少兩種蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式,發(fā)明組合物包含例如膠原酶和鏈酶蛋白酶等;根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,發(fā)明組合物包含例如膠原酶和蛋白酶K。
根據(jù)另一種實(shí)施方式,發(fā)明組合物包含三種蛋白酶,即膠原酶、鏈酶蛋白酶和蛋白酶K。特別優(yōu)選使用來自溶組織梭菌的膠原酶和來自灰色鏈霉菌的鏈霉蛋白酶以及來自白麥軸霉的蛋白酶K。根據(jù)另一種實(shí)施方式,發(fā)明組合物只包含一種蛋白酶,優(yōu)選為天冬氨酸蛋白酶,優(yōu)選胃蛋白酶,特別是豬的胃蛋白酶。
至于可用于本發(fā)明的糖苷酶,所有能夠裂開并分解齲齒損害內(nèi)的多糖結(jié)構(gòu)的糖苷酶都可以使用。在這方面,糖苷酶催化齲齒損害中存在的多糖結(jié)構(gòu)的糖苷鍵的水解裂解。
糖苷酶的催化機(jī)制只有在各糖苷酶特別地連接到底物上時才能發(fā)揮作用。因此,例如溶菌酶可催化多糖結(jié)構(gòu)中N-乙?;谒崤cN-乙?;?D-葡糖胺之間的β-1,4鍵的水解。相反,α-淀粉酶催化多糖結(jié)構(gòu)中兩個d-葡萄糖單元之間的α-1,4鍵的水解,變位酶催化α-1,3鍵的水解。葡聚糖酶催化葡聚糖中α-1,6鍵的水解。
在本發(fā)明組合物中,通常所有類型的糖苷酶可以獨(dú)立地包含或與其它糖苷酶聯(lián)用,例如α-糖苷酶或、β-糖苷酶或保留糖苷酶或轉(zhuǎn)化糖苷酶。
本發(fā)明組合物通常只包含一種糖苷酶,但也可包含兩種或多種不同糖苷酶。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式,組合物包含例如一種糖苷酶。根據(jù)另一種實(shí)施方式,本發(fā)明組合物包含1-約10種不同的糖苷酶,例如1-約6種或1-4種或2-3種糖苷酶,例如2種不同的糖苷酶。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,組合物中至少用2種不同的糖苷酶。優(yōu)選糖苷酶是溶菌酶、α-淀粉酶、變位酶或葡聚糖酶或它們中兩種或多種的混合物。聯(lián)合使用溶菌酶和葡聚糖酶也是合適的。根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選采用至少兩種不同的糖苷酶,特別是來自雞卵白蛋白的溶菌酶,來自構(gòu)巢曲霉菌的α-淀粉酶和來自青霉菌的葡聚糖酶。
本發(fā)明組合物的特征是蛋白酶的活性與糖苷酶的活性之間存在獨(dú)特的關(guān)系。一般地,本發(fā)明組合物中蛋白酶與糖苷酶的酶活性比為1000000∶1-1∶1000000。
上述活性比總是與有關(guān)酶的標(biāo)準(zhǔn)條件相關(guān)。在本發(fā)明中,以下是有效標(biāo)準(zhǔn)條件 鏈酶蛋白酶如果用酪蛋白作為底物,1單位對應(yīng)于40℃和pH7.5下,每分鐘轉(zhuǎn)化25μg酪氨酸。
膠原酶如果用膠原作為底物,1單位對應(yīng)于37℃和pH 7.5下,5小時轉(zhuǎn)化1mmol L-亮氨酸。
胃蛋白酶1單位對應(yīng)于A280nm和37℃下,用TCA轉(zhuǎn)化血紅蛋白的ΔE為0.01。
溶菌酶1單位對應(yīng)于在pH6.24和25℃下,每分鐘的活性為0.001。所用溶壁微球菌(M.lysodeikticus)細(xì)胞的傳感體積為2.6ml。
葡聚糖酶如果用葡聚糖作為底物,1單位對應(yīng)于37℃和pH6.0下,每分鐘轉(zhuǎn)化25μmol異麥芽糖。
α-淀粉酶如果用淀粉作為底物,1單位對應(yīng)于20℃和基pH6.9下,3分鐘轉(zhuǎn)化1mg麥芽糖。
蛋白酶K如果用血紅蛋白作為底物,1Anson單位對應(yīng)于pH 7.5和35℃下1μmol福林正氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明,蛋白酶活性與糖苷酶活性的合適比約為10000∶1-1∶1000000,或約100∶1-1∶1000000,或約1∶1-1∶1000000,或約1∶10-1∶100000,或1∶100-1∶100000。特別合適的比例是約1∶1000-1∶100000,更優(yōu)選的比例是約1∶3000-1∶30000。優(yōu)選比例是約1∶100-1∶500。
上述活性比例明顯與對有關(guān)酶有效的標(biāo)準(zhǔn)條件相關(guān)。
此外,本發(fā)明涉及一種組合物,它包含糖苷酶和蛋白酶,或者包含糖苷酶和至少兩種或多種蛋白酶,或者包含至少兩種或多種糖苷酶和蛋白酶,或者包含至少兩種或多種糖苷酶和兩種或多種蛋白酶。本發(fā)明組合物包含約1-10糖苷酶和約1-10蛋白酶,優(yōu)選包含約6糖苷酶和約1-10蛋白酶,更優(yōu)選包含約4糖苷酶和約1-10蛋白酶,更優(yōu)選包含約2糖苷酶和約1-10蛋白酶,或約6糖苷酶和約6蛋白酶,或約6糖苷酶和約4蛋白酶,或約6糖苷酶和約2蛋白酶,更優(yōu)選包含約4糖苷酶和約6蛋白酶,或約4糖苷酶和約4位蛋白酶,或約4糖苷酶和約2蛋白酶,更優(yōu)選包含約2糖苷酶和約2蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,本發(fā)明組合物包含蛋白酶K和膠原酶與糖苷酶、溶菌酶和葡聚糖酶聯(lián)合。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明組合物的溶液和至少一種溶劑。一般地,酶可在其中溶解但不會變性的每種溶劑可以是包含在本發(fā)明組合物中的組分。所有的水溶劑和有機(jī)溶劑都可采用,只要它們不對酶的活性損害到無法用于本發(fā)明的程度。
合適的溶劑包括水,具有2-約10個碳原子的直鏈醇、支鏈醇或環(huán)醇,飽和醇或不飽和醇;酮、酯、羧酸及上述類型溶劑中兩種或多種溶劑的混合物。
根據(jù)本發(fā)明,可以用作溶劑的有二烷基酮或醇或低粘度的可聚合物質(zhì),如聚乙二醇(PEG)、羥乙基甲基丙烯酸或(2,3-環(huán)氧丙基)甲基丙烯酸和它們的混合物。特別優(yōu)選的醇溶劑有甲醇、乙醇、異丙醇和丙醇。其他合適的有機(jī)溶劑是甘油、二甲基砜、四氫呋喃、丙酮、甲乙酮、環(huán)己醇、甲苯、二氯甲烷、氯仿、烷烴和乙酸烷基酯,特別是乙酸乙基酯。
一般地,可以單獨(dú)使用上述溶劑,也可以使用這些溶劑的兩種或多種溶劑的混合物,只要混合溶劑不會將酶活性損害到無法得到所需結(jié)果的程度。但是,根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式,所用混合溶劑含水,特別是水-醇混合溶劑。
如果本發(fā)明組合物包含溶劑,其粘度基本上可以在任何范圍之內(nèi),從高流體到糊狀。事實(shí)證明,如果組合物的粘度足夠低,可以流入要治療的齲齒損害中難以到達(dá)的部位,這樣的組合物是有用的。但是,如果包含本發(fā)明組合物的溶劑具有較高的粘度,即組合物是膠樣的,當(dāng)齲位于牙邊的部位時它不會太快流逝,則這種組合物也是有用的。
例如,本發(fā)明溶液在25℃下粘度范圍在約1.0mPa·s-1000mPa·s,例如在25℃下粘度范圍在約10mPa·s-約100mPa·s。
一般地,可用于本發(fā)明的所有增稠劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的物質(zhì),它們通??梢杂脕碚{(diào)節(jié)溶液的所需粘度,只要所述增稠劑不會或者至少基本上不會損害所需應(yīng)用目的。例如,合適的增稠劑是淀粉、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉,和無機(jī)增稠劑,如硅膠或葉硅酸鹽,以及所述增稠劑中兩種或多種的混合物。
例如,本發(fā)明酶溶液的總酶活性約為2U-1000000U/ml溶液。例如,下限約為3、5、7或10U/ml,其中總酶活性的下限約為20或25或30或40或45或50U/ml溶液時,一般認(rèn)為可以提高發(fā)明效果。
發(fā)明酶溶液優(yōu)選包含約60-600000U/ml溶解,例如約100-400000U/ml溶劑,或約300-300000U/ml溶劑或約500-200000U/ml溶劑,或約700-150000U/ml溶劑,或約1000-100000U/ml溶劑,或約5000-50000U/ml溶劑。此外,在本發(fā)明的描述中,所述各范圍的下限可以與上述每個范圍的限度結(jié)合,只要在此范圍內(nèi)發(fā)明酶溶液特別能顯示出有利的效果。
例如,有關(guān)酶的比例是1U蛋白酶∶1U糖苷酶-1U蛋白酶∶1000000U糖苷酶,或者約1U蛋白酶∶10U糖苷酶-1U蛋白酶∶100000U糖苷酶,或約1U蛋白酶∶100U糖苷酶-1U蛋白酶∶100000U糖苷酶,與有關(guān)酶的有效標(biāo)準(zhǔn)條件相關(guān)。例如,特別合適的比約為1U蛋白酶∶1000U糖苷酶-1U蛋白酶∶100000U糖苷酶,更優(yōu)選約為1U蛋白酶∶3000U糖苷酶-1U蛋白酶∶30000U糖苷酶。
例如,總酶活性約為1U/ml溶劑-1000000U/ml溶劑,優(yōu)選約為5-100000U/ml溶劑,或約為50-50000U/ml溶劑。
例如,本發(fā)明包含兩種組合蛋白酶的合適組合物具有如下酶活性膠原酶約為1-5000U/ml溶劑,例如約1-1000U/ml溶劑,或例如約1-5U/ml溶劑;蛋白酶K約為10-300mAnson/ml溶劑,優(yōu)選約為20-100mAnson/ml溶劑,特別優(yōu)選約為20-50mAnson/ml溶劑。當(dāng)膠原酶與不同于蛋白酶K的蛋白酶聯(lián)合使用時,可以采用類似的濃度和比例。
一般地,本發(fā)明組合物的總糖苷酶活性大于1U/ml。根據(jù)本發(fā)明,總糖苷酶活性可以約為1-1000000U/ml溶劑,優(yōu)選約為10-500000U/ml溶劑,例如濃度約為50-300000U/ml溶劑,或濃度約為1000-200000U/ml溶劑,或濃度約為10000-100000U/ml溶劑。
例如,根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,包含兩種組合糖苷酶的組合物具有以下濃度 -溶菌酶在5000-200000U/ml溶劑范圍內(nèi),優(yōu)選在10000-150000U/ml溶劑范圍內(nèi),更優(yōu)選在70000-100000U/ml溶劑范圍內(nèi); -葡聚糖酶在10-1000U/ml溶劑范圍內(nèi),優(yōu)選在50-500U/ml溶劑范圍內(nèi),更優(yōu)選在90-250U/ml溶劑范圍內(nèi)。
由于齲損害的主蛋白組分是蛋白膠原,本發(fā)明優(yōu)選采用這些溶液,它們單獨(dú)使用或與一種或多種其他蛋白酶聯(lián)合使用能夠降解膠原。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,用來降解結(jié)構(gòu)上完整的膠原的發(fā)明溶液包含至少兩種蛋白酶。
例如,聯(lián)合使用膠原酶和另一種蛋白酶如蛋白酶K對結(jié)構(gòu)上天然的膠原降解有利效果。天然膠原的降解受膠原酶誘導(dǎo)。這意味著,膠原酶以這樣方式轉(zhuǎn)化膠原的三級結(jié)構(gòu),即轉(zhuǎn)化后,二級結(jié)構(gòu)也可受其他蛋白酶的攻擊。但是,膠原酶單獨(dú)不能完全降解膠原。然而,像蛋白酶K或鏈酶蛋白酶這樣的蛋白酶不能降解結(jié)構(gòu)完整的膠原。這種蛋白酶只有在膠原事先與膠原酶反應(yīng)后才能降解膠原。因此,為了有效降解膠原,聯(lián)合膠原酶和其他蛋白酶是有利的。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,以這樣方式選擇蛋白酶和糖苷酶及其濃度,使得蛋白酶在使用期間不會蛋白酶解地滅活糖苷酶。
底物的礦化程度越高,發(fā)明組合物越難接觸牙質(zhì)-膠原。其結(jié)果是,發(fā)明組合物具有活性,但只對受損害的牙齒物質(zhì)有降解作用。包含酶的組合物不會侵襲牙齒的固體物質(zhì)區(qū)域。包含上述蛋白酶和糖苷酶組合,用于治療齲齒或用于制備治療齲齒的藥劑的發(fā)明組合物的效果受牙齒中礦物質(zhì)的比例控制。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,蛋白酶和糖苷酶可以用來降解細(xì)菌胞壁組分,從而具有殺菌效果。
此外,發(fā)明組合物包含至少一種緩沖液或第一化合物,所述第一化合物與第二化合物混合作為緩沖液。發(fā)明組合物中的緩沖液可用來調(diào)節(jié)包含發(fā)明酶混合物的發(fā)明溶液中的pH值至所需值,分別用于本發(fā)明各實(shí)施方式,防止pH值在指定時間內(nèi)發(fā)生變化,并用于穩(wěn)定各溶液。
在本發(fā)明中,所有通常的緩沖液都是合適,如磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris buffer)、雙甘氨肽緩沖液或甘氨酸緩沖液。優(yōu)選磷酸鈉緩沖液、磷酸氫鈉緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、磷酸氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀緩沖液或焦磷酸鹽緩沖液。碳酸鈉緩沖液、碳酸鉀緩沖液、碳酸氫鈉緩沖液或碳酸氫鉀緩沖液也是合適的。發(fā)明組合物特別優(yōu)選包含磷酸鹽緩沖液和它們的組分。特別優(yōu)選的磷酸鹽緩沖液是磷酸二氫鈉緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明,也可以使用緩沖體系,它不僅能在所需pH值下穩(wěn)定系統(tǒng),而且能在組合物內(nèi)完成第二項(xiàng)任務(wù),例如激活或滅活酶活性。因此,下文所述具有激活或滅活酶性質(zhì)的酸及其鹽也可以用作緩沖體系,以穩(wěn)定發(fā)明組合物的pH值。其中,二乙基巴比妥酸、三羥甲基氨酸(Tricine)、甘氨酸-甘氨酸和磷酸鹽緩沖液優(yōu)選作為緩沖化合物。
含溶劑的本發(fā)明溶液的緩沖液濃度可達(dá)100mol/l。濃度(mol/l)與溶液中酸性部分有關(guān)。優(yōu)選范圍約在0.001-10mol/l。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,含有酶的溶液包含約0.001mol/l-5mol/l的緩沖液。濃度范圍優(yōu)選為約0.01-3mol/l,更優(yōu)選約為0.02-2.0mol/l。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,含有酶的溶液所包含的緩沖液濃度范圍約為0.03-10mol/l,更優(yōu)選約為0.05-5mol/l,甚至更優(yōu)選約為0.08-2mol/l。
包含發(fā)明酶混合物的溶液的pH值約為1-10。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,含有發(fā)明酶的溶液的pH值約為5-10,特別是約6-9,特別是約7或約1-4。
如果齲齒損害中的蛋白質(zhì)容易到達(dá),例如由于齲齒損害中去礦化能力強(qiáng),則使用已調(diào)節(jié)到上述值的蛋白酶混合物是有利的。但是,如果這種溶液與礦物質(zhì)接觸,則不會發(fā)生蛋白酶解降解。這樣,通過限制底物的有效性,獲得效果的限制。有利的是,基本上只有受感染的牙質(zhì)和在更大程度上去除去礦化的牙質(zhì),而健康的礦化牙質(zhì)不受或僅受到輕微侵襲。因此,所述溶液在約5-10的pH范圍內(nèi),對牙齒上的健康物質(zhì)沒有太大的影響。
發(fā)明組合物還可包含輔劑,如絡(luò)合劑、酶底物或酶效應(yīng)物。根據(jù)本發(fā)明,酶效應(yīng)物包含酶活化劑以及酶抑制劑。
在本發(fā)明中,絡(luò)合劑用于促進(jìn)酶接近齲齒損害,通過支持羥磷灰石的降解。
本發(fā)明的優(yōu)選絡(luò)合劑是能與具有二價的金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物的絡(luò)合劑。例如,EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇二氨基乙基四乙酸)、檸檬酸或水楊酸是合適的絡(luò)合劑。EDTA(乙二胺四乙酸)是最優(yōu)選的絡(luò)合劑。
在本發(fā)明中,可以在發(fā)明組合物中加入其他能夠優(yōu)化酶功能的能力的化合物。這種激活或抑制酶的化合物包含二乙基巴比妥酸、三(羥甲基)氨基酸甲烷(TRIS)、甘氨酸、雙甘氨肽、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸酯(ADA)、N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、2,2-二(羥乙基)-亞氨基三(羥乙基)甲烷(BIS-TRIS)、2-(環(huán)己氨基)乙烷磺酸(CHES)、2-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪)]乙烷磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪基)]丙烷磺酸(HEPPS)、2-嗎啉乙烷磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-1,4-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-[三(羥甲基)-甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、N-[三(羥甲基)-甲基]-甘氨酸(TRICINE),酸如硫酸、磺酸、磷酸、鹽酸、乙酸、硝酸,堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氨、氫氧化鈣、氧化鎂,鹽如氯化鎂、硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、硝酸鈣、氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸銨、氯化銨、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、錳鹽、鈷鹽、鋅鹽、輔酶、氨基酸、甜菜堿、牛黃酸、山梨糖醇、木糖醇、聚乙二醇、甲基纖維素、甘露糖醇、甘油和維生素,以及技術(shù)人員熟知的其他許多添加劑。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)包含本發(fā)明所述組合物的酶的方法,其中合適選擇的酶與合適比例的各酶活性混合。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)包含本發(fā)明所述組合物的酶的方法,其中在合適的酶混合物中任選加入合適的輔劑和一種或多種合適的溶劑。
有關(guān)發(fā)明過程中的生產(chǎn)和儲存,本領(lǐng)域技術(shù)人員一般可采用所有已知如何處理酶的技術(shù)。例如,本發(fā)明組合物可用色譜技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、造粒技術(shù)、離心技術(shù)、沉淀技術(shù)、結(jié)晶技術(shù)或超濾或納濾技術(shù)處理。
此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有生產(chǎn)輔劑都可用來提高儲存穩(wěn)定性。
本發(fā)明還涉及除齲方法,其中含有本發(fā)明上文所述組合物的酶可涂布在齲齒的部位上。
在選擇合適的處理溶液時,特別是在選擇合適的酶來制備治療和除去齲的溶液時,必須考慮具體情況下存在的齲類型。
不同類型的齲之間通常存在差異。因此,例如,齲損害中有無阻礙接近牙質(zhì)的衰敗性齲、齲牙質(zhì)仍為釉質(zhì)、釉質(zhì)齲、根齲和根營齲所覆蓋。
如果受齲影響的點(diǎn)為一厚層釉質(zhì)或老的補(bǔ)牙劑所包裹,因而無法接觸治療溶液,則可以用快速旋轉(zhuǎn)鉆清除釉質(zhì)蓋層或老的補(bǔ)牙劑。但是,如果釉質(zhì)蓋層例如被晚期的齲齒病穿孔,則可以不用牙鉆,而是結(jié)合機(jī)械載體滲入本發(fā)明組合物。用于支撐穿孔釉質(zhì)蓋層的滲透的機(jī)械工具包括微型刷(由塑料或金屬制成的小刷子)、樣品匙、樣品球和其他牙外科常用工具。這些工具用來將發(fā)明溶液鋪展在待治療的部位上,將所述溶液抹進(jìn)去,除去軟化的齲牙質(zhì),通過觸摸有觸覺地分出牙質(zhì)和釉質(zhì)的硬表面。
如果可能接近牙齒上受齲影響的區(qū)域,治療通常從鑒別患者口中牙齒的齲區(qū)域開始。這種鑒別可用牙科醫(yī)生已知的方法進(jìn)行,例如檢查、探測、X-射線,但也可以用診斷印模材料??扇芜x對鑒定為牙齒的齲感染的區(qū)域進(jìn)行簡單清潔,例如用探針或挖治器,也可任選加入研磨劑。隨后,沖洗待治療的牙齒區(qū)域,并吹氣。
這些準(zhǔn)備工作后,可在牙齒的預(yù)處理區(qū)域施涂含發(fā)明酶的組合物,以此除齲。
待治療的部位和任選存在的齲洞應(yīng)當(dāng)分別始終覆蓋和完全填滿發(fā)明溶液。例如,治療受齲影響的牙齒區(qū)域的合適施涂量約為100μl。但是,合適的施涂量應(yīng)當(dāng)根據(jù)具體情況調(diào)整,即齲洞的大小和受齲影響的牙齒區(qū)域的大小。因此,合適的施涂量約為0.001-0.5ml,優(yōu)選約為0.01-0.3ml,更優(yōu)選約為0.02-0.2ml。
含發(fā)明酶的組合物的優(yōu)選暴露時間約為5s-5min,此暴露時間可視齲損害的大小增減。暴露時間優(yōu)選在約10s-3min之間,例如在約15s-2min之間,或在約20s-1min之間。
在暴露時間內(nèi),齲損害的齲部位得到降解,形成較大的齲洞。一旦暴露時間結(jié)束,沖洗牙齒的處理的區(qū)域,任選吹氣。
例如,齲齒降解處理步驟可根據(jù)如下步驟進(jìn)行。在待治療的牙齒區(qū)域施涂適量的含酶溶液,用所述溶液暴露約5s-5min,然后用水沖洗牙齒的區(qū)域。以下將此處理過程稱作培養(yǎng)步驟。
一般地,培養(yǎng)步驟可根據(jù)需要多次進(jìn)行,這樣在牙齒的處理的區(qū)域不會殘留齲或細(xì)菌殘余。培養(yǎng)步驟可進(jìn)行一次或多次,例如兩三次或更多次。但是,多數(shù)情況下,重復(fù)培養(yǎng)步驟無需超過2次或3次。
本發(fā)明表明,培養(yǎng)步驟連續(xù)進(jìn)行2次尤其有利。發(fā)明酶溶液與牙齒上受齲影響的區(qū)域接觸持續(xù)時間應(yīng)當(dāng)約為10-30s,例如約為20s。
因此,本發(fā)明還涉及除齲的過程,其中發(fā)明組合物,特別是包含至少一種溶劑的發(fā)明組合物要施涂在牙齒的受齲影響的區(qū)域。
此外,本發(fā)明涉及除齲過程,其中所述過程分兩個或多個培養(yǎng)步驟進(jìn)行。
此外,本發(fā)明涉及除齲過程,其中在第一個步驟及另一個或另幾個步驟中,將發(fā)明組合物施涂在牙齒的受齲影響的區(qū)域。
本發(fā)明表明,在某些情況下,有利采用含有酶的處理溶液,其pH值可調(diào)節(jié)到它能夠侵襲并降解釉質(zhì)和牙質(zhì)。例如,當(dāng)齲損害位于穿孔但未完全損壞的釉質(zhì)蓋層下面時,就可以如此。在此情況下,可以用調(diào)整了酸度的含酶處理溶液除去釉質(zhì)蓋層,而不用牙鉆,其中包含這種溶液的酶誘導(dǎo)或進(jìn)行位于釉質(zhì)蓋層下齲區(qū)域的降解。
此外,齲損害已經(jīng)用pH值為5或更高的含酶組合物處理之后,在中間步驟或最終步驟,可進(jìn)一步用含酶處理溶液處理,其中溶液的pH值調(diào)節(jié)到使釉質(zhì)或牙質(zhì)受到侵襲并降解。由于這種酸性溶液對牙質(zhì)和釉質(zhì)有降解作用,齲洞內(nèi)部變得粗糙,因而為隨后的補(bǔ)牙治療作好準(zhǔn)備并提供便利。
合適的處理溶液的pH值約小于4,特別是約小于3。例如,合適的pH值約為1-4,特別是約為1.2-3,或約為1.5-2.5,例如約為2。
這種處理溶液應(yīng)當(dāng)包含至少一種酶,其pH在上述范圍之內(nèi)。在此情況下,胃蛋白酶特別合適。
根據(jù)本發(fā)明,所描述的胃蛋白酶溶液在預(yù)處理齲洞時具有這樣的優(yōu)點(diǎn),即牙科醫(yī)生可用牙探針檢查齲洞壁的表面,以便完全除齲。用本發(fā)明的胃蛋白酶溶液處理齲洞的結(jié)果是齲洞壁礦化,因而用探針檢測時能產(chǎn)生牙醫(yī)熟悉的聲音。胃蛋白酶的蛋白酶解作用與本發(fā)明溶液的酸性環(huán)境結(jié)合,可促進(jìn)齲洞中類膠原殘留物的清除。胃蛋白酶的蛋白酶解性質(zhì)和本發(fā)明組合物酸性礦物溶解環(huán)境的相互作用是為此目的特制的。在侵襲牙質(zhì)的礦物結(jié)構(gòu)的過程中,發(fā)明組合物的酸性部分也使類膠原結(jié)構(gòu)變性,使它們受胃蛋白酶侵襲。由于牙質(zhì)中礦物組分的溶解,齲洞中組合物的pH值在處理過程中增加,直到pH值太高以致環(huán)能損害礦物組分。但是,酶仍然具有活性,且消化齲洞中的剩余變性蛋白質(zhì)。這樣得到的齲洞壁,其組分類似于健康的牙質(zhì)。但是,牙醫(yī)為確定是否完全除去了齲質(zhì)而用牙探針探測齲洞時,這種齲洞壁發(fā)出牙醫(yī)熟悉的聲音。
因此,本發(fā)明還涉及pH值約為2或更小的組合物,它包含水、酸、胃蛋白酶和流變添加劑,其中胃蛋白酶的濃度為1-45000U/ml,組合物的粘度約為1-1000mPas。
一般地,上述組合物可包含任何類型的酸,包括有機(jī)酸或無機(jī)酸,或這兩類酸的混合物,以便提供所需pH值。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),可以采用的有機(jī)酸如二乙基巴比妥酸、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、甘氨酸、雙甘氨肽、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸酯(ADA)、N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、2,2-二(羥乙基)-亞氨基三(羥乙基)甲烷(BIS-TRIS)、2-(環(huán)己氨基)乙烷磺酸(CHES)、2-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪)]乙烷磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪基)]丙烷磺酸(HEPPS)、2-嗎啉乙烷磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-1,4-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-[三(羥甲基)-甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、N-[三(羥甲基)-甲基]-甘氨酸(TRICINE),使本發(fā)明組合物的pH值變化到所需pH值范圍。但應(yīng)當(dāng)指出,上述一些或所有的酸除了降低pH值外,對組合物還有其他效應(yīng),特別是加速或抑制效應(yīng)。組合使用上述酸也在本發(fā)明范圍之內(nèi),其中,加入一種或多種酸的目的是獲得或調(diào)節(jié)所需pH值,而加入一種或多種酸的其它目的與它們對pH值的影響無關(guān)。
但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn),諸如硫酸、磺酸、磷酸、鹽酸、甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、草酸或硝酸等無機(jī)酸有利于提供所需pH值,提高本發(fā)明組合物的變性和礦物溶解的性質(zhì)。已經(jīng)指出,在本發(fā)明中,像甲酸和乙酸這樣的酸可以看作無機(jī)酸的一部分。
也可以組合使用上述有機(jī)酸和無機(jī)酸,以降低pH值。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn),如用無機(jī)酸調(diào)節(jié)所需pH值就足夠甚至有利。
在本發(fā)明的多數(shù)優(yōu)選實(shí)施方式中,無機(jī)酸用于獲得所需pH范圍,特別是磷酸。
為穩(wěn)定包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶的pH值,這種組合物可包括緩沖體系。一般地,緩沖體系是技術(shù)人員已知的,但必須選擇用來降低pH值的酸。合適的緩沖體系是H2PO4/H3PO4、甲酸/甲酸鹽、乙酸/乙酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鈉、甘氨酸/HCl。
緩沖液濃度優(yōu)選在約0.01-2.0M范圍內(nèi)。
包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶包含至少一種流變添加劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn),溶解的胃蛋白酶由于在等電點(diǎn)周圍存在構(gòu)型效應(yīng)和相互作用效應(yīng),它在pH值約為3.5的環(huán)境下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。由于這些結(jié)構(gòu)變化和相互作用的變化,胃蛋白酶接近等電點(diǎn)時從溶液中析出。但是,這使胃蛋白酶的活性隨著pH值的增加而逐漸下降。此性質(zhì)又與本發(fā)明的目標(biāo)證實(shí)得其反,即清除齲洞中的膠原殘留物,而齲洞壁的礦物組分基本上未受操作。因此,理想的結(jié)果是既能盡可能長地保持胃蛋白酶的活性,又能避免胃蛋白酶分子接近等電點(diǎn)時析出。
令人意外的發(fā)現(xiàn)是,加入流變添加劑可抑制胃蛋白酶過早析出,有利于延長胃蛋白酶的作用,甚至在較高pH值。
作為流變添加劑,成功地使用有機(jī)增稠劑。合適的流變添加劑是多糖。因此,包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶包含多糖作為流變添加劑。例如,合適的多糖是淀粉、甘露聚糖、呫噸酮、藻酸鹽、角叉萊、果膠、聚乙烯基吡咯烷酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、氫丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素或羧甲基纖維素鈉和其兩種或多種物質(zhì)的混合物。應(yīng)當(dāng)指出,術(shù)語“流變添加劑”和術(shù)語“增稠劑”在本發(fā)明中可互換使用,除非另有說明。
除上述必須遵循的組分水、酸、胃蛋白酶和流變添加劑外,包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶中可存在聚醚或兩性表面活性劑,或兩種或多種聚醚和兩性表面活性劑的混合物。
加入這兩種類型的組分可進(jìn)一步抑制胃蛋白酶的析出。一般說來,所有類型的聚醚都適合用來抑制胃蛋白酶的析出,但前提是本發(fā)明所用聚醚至少具有一定的水溶性。
一般地,合適的聚醚在20℃水中的溶解度應(yīng)當(dāng)至少約為1g/l,更優(yōu)選至少約為5g/l,或至少約為200g/l。如果聚醚用作本發(fā)明組合物的一個組分,它在20℃水中的溶解度優(yōu)選至少約為0.1wt%,更優(yōu)選至少約為1wt%或至少約為2wt%。
合適的聚醚的制備方法一般是使原料,通常為水、醇或胺與一種或多種環(huán)氧化物在堿催化下發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。也可以通過環(huán)醚,如四氫呋喃(THF)的開環(huán)聚合反應(yīng)來得到合適的聚醚。優(yōu)選原料是水或單功能醇或多功能醇。合適的單功能醇是具有1-約22個碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和脂肪醇,環(huán)脂肪醇或芳香醇,例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、同分異構(gòu)的戊醇、同分異構(gòu)的己醇、同分異構(gòu)的庚醇及其較高級的同系物、環(huán)己醇、苯酚、萘酚等。其中優(yōu)選的多功能醇是具有2、3或4個羥基的醇,例如乙二醇、丙二醇、丁二醇、三羥甲基丙烷、三羥乙基丙烷、戊赤蘚糖醇、山梨糖醇等。
合適的環(huán)氧化物或環(huán)醚通常是環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧丁烷或THF。
對本發(fā)明胃蛋白酶的析出具有抑制效果的聚醚可僅包含一類單體。但是,采用包含一類以上的單體的聚醚也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種共聚物可隨機(jī)組織或成塊。
采用主要或完全由環(huán)氧乙烷重復(fù)單元(-CH2-CH2-O)組成的聚醚也優(yōu)選包含在本發(fā)明范圍之內(nèi),具有兩個或三個羥基。
這些聚醚的重均分子量(Mw)用常規(guī)的方法,如GPC測定,它不應(yīng)超過約10000原子單位,優(yōu)選應(yīng)小于約1000原子單位。這種聚酯的最小重均分子量(Mw)應(yīng)當(dāng)約為100原子單位,優(yōu)選為150原子單位或更大,例如約200原子單位。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,含有組合物的胃蛋白酶包含分子量約為100-500原子單位,優(yōu)選為200原子單位的聚乙二醇。
代替或除了一種或多種上述聚醚外,包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶可包含一種或多種兩性離子化合物。一般而言,所有類型的含有至少一個正電荷離子和一個負(fù)電荷離子的低分子量組分都適合于本發(fā)明。術(shù)語“低分子量”是指分子量約小于1000,優(yōu)選小于約500的兩性離子組分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,包含本發(fā)明組合物的胃蛋白酶包含下述組分中的一種或多種作為兩性離子化合物甘氨酸甜菜堿、甜菜堿、牛黃、外生物堿類(ectoines)或二甲基锍丙酸。
此外,含有本發(fā)明組合物的胃蛋白酶可包含一種或多種hw有四個或多個羥基的非聚醚多元醇。合適的多元醇或糖醇是戊赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖醇或甘油。
因?yàn)榈鞍酌副旧硎堑鞍踪|(zhì),所以含胃蛋白酶的溶液總是處于在因自身消化溶液中的酶而失去其反應(yīng)性的危險(xiǎn)。尤其是包含溶液在pH值小于4的條件下存儲的胃蛋白酶,其活性會迅速下降。為延遲活性的降低,可在這種溶液中加入抑制劑。雖然這種抑制劑能延遲溶液中胃蛋白酶的自身消化,但它也緩慢降低胃蛋白酶對齲洞中蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。然而,以犧牲胃蛋白酶對齲的反應(yīng)性來換取具有儲存穩(wěn)定性提高的溶液也是需要的。因此,包含本發(fā)明胃蛋白酶的組合物還可包含抑制劑。
合適的抑制劑可以是前面已經(jīng)提到的抑制劑。優(yōu)選的抑制劑是聚賴氨酸、胃酶抑素或取代哌啶。
含有本發(fā)明胃蛋白酶的組合物通常包含約1-100000U/ml組合物的胃蛋白酶。但是,胃蛋白酶的活性優(yōu)選約為500-50000U/ml組合物,或約1000-8000U/ml組合物。每毫升組合物中加入約0.5-15mg普通市售質(zhì)量的胃蛋白酶可獲得所需活性。
流變添加劑的加入量要足夠,以提供約1-1000mPas的粘度。本發(fā)明組合物的粘度優(yōu)選約為5-500mPas或約10-100mPas。
粘度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序,用Haake流變儀(Rotor-Visco(RV1),傳感器(60/1°Ti))在25℃測定。
含有本發(fā)明胃蛋白酶的組合物包含約0.1-2wt%(基于組合物重量)的流變添加劑。流變添加劑的量優(yōu)選約為0.2-1wt%,只要組合物的粘度在上述范圍之內(nèi)。
含胃蛋白酶的本發(fā)明組合物可包含一種聚醚,或兩種或多種聚醚的混合物,量約為0.1-20wt%(基于組合物重量)。然而,已發(fā)現(xiàn)聚醚以約為0.5-8wt%,尤其以約為0.8-5wt%的量存在時是有利的。
含胃蛋白酶的本發(fā)明組合物包含兩性離子化合物或兩種或多種兩性離子化合物的混合物,這種組分以雞0.1-20wt%(基于組合物重量)的量存在。通常,已發(fā)現(xiàn)兩性離子組分以約1-15wt%或約7-12wt%的量存在時是有利的。
含胃蛋白酶的本發(fā)明組合物可另外包含防腐劑。一般地,所有類型的防腐劑均可用作本發(fā)明組合物的一部分,它能抑制本發(fā)明溶液中微生物的生長,且人體能忍受。但是已發(fā)現(xiàn),最優(yōu)選使用常規(guī)的對羥基苯甲酸酯類防腐劑。特別優(yōu)選的防腐劑是甲基對羥基苯甲酸酯(羥苯甲酸甲酯)和丙基對羥基苯甲酸酯(羥苯甲酸丙酯)。上述每種防腐劑可用作本發(fā)明組合物中唯一的防腐劑,但也可以聯(lián)合使用這些防腐劑。防腐劑的用量一般約為0.001-1wt%(基于組合物重量)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,防腐劑的用量約為0.01-0.25wt%(基于組合物重量)。
此外,含胃蛋白酶的本發(fā)明組合物可包含其他添加劑,如絡(luò)合劑、酶底物或酶效應(yīng)物,如上文所述。
為了克服含胃蛋白酶的本發(fā)明組合物的儲存穩(wěn)定性和失去活性的問題,已發(fā)現(xiàn)這種含胃蛋白酶的溶液可有利地以雙組分體系的形式提供。
因此,本發(fā)明還涉及包含雙組分A和B的組合物,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶活性最佳時的pH值;組分B包含水、酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于或等于胃蛋白酶活性最佳時的pH值。
因此,含有胃蛋白酶的本發(fā)明組合物也由雙組分A和B組成。組分A包含水和緩沖體系,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶活性最佳時的pH值。一般地,合適的緩沖體系所提供的pH值約為3、5或更高,尤其約為4或更高,或者約為4、5或更高。已發(fā)現(xiàn),如果組分A的pH值超過的5.2,特別是超過約5.3,或超過約5.4,則尤其有利。約為5.5的pH值能得到非常好的結(jié)果。
本發(fā)明所用術(shù)語“緩沖體系”是指能夠利用組分A及組分A和B的混合物提供緩沖效果的體系。因此,組分A不必包含完整的緩沖體系,只要在這種緩沖體系中形成組分A和B的混合物就足夠了。
一般地,所有類型的緩沖體系均可使用,如上文所述。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,采用的是磷酸鹽緩沖液。組分a優(yōu)選包含pH值約為4、5-6的磷酸鹽緩沖液。已發(fā)現(xiàn),當(dāng)組分A所含磷酸鹽緩沖液的濃度約為10-500mmol/l,特別是約50-150mmol/l時,可得到非常好的結(jié)果。
在本發(fā)明組合物中,組分a優(yōu)選包含活性小于約60000U/ml,特別是約500-50000或約5000-45000U/ml組合物的胃蛋白酶。一般地,上文對胃蛋白酶濃度和活性的描述同樣適用于現(xiàn)在所述的組合物。
組分A所含胃蛋白酶通常約小于約20mg/ml組分A,優(yōu)選約小于15或小于10mg/ml組分A。
組分A還包含流變添加劑。合適的流變添加劑如前面所述。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,組分A包含多糖作為流變添加劑,例如羥乙基纖維素。組分A中流變添加劑的量約為0.05-1.5wt%,優(yōu)選約為0.1-1wt%,或約為0.3-0.7wt%。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,組分A可包含如下組分,其量如下 胃蛋白酶約0.1-1.0wt% 磷酸二氫鈉 約0.6-2.4wt% 氫氧化鈉約0.001-0.5wt% 羥乙基纖維素約0.2-1.0wt% 羥苯甲酸甲酯約0.005-0.05wt% 羥苯甲酸丙酯約0.005-1.0wt% 水 加至100wt% 本發(fā)明的組分B包含水、使pH值小于4.0的酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物。
一般地,組分B包含上面提到的所有類型的酸,用來達(dá)到所需pH值。由于組分A和B混合后可形成緩沖體系,如果組分B中的至少一種酸與組分A中的一種鹽匹配,則是有利的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,組分B包含磷酸。已發(fā)現(xiàn),如果組分B包含的酸使pH值達(dá)到1-約2.8,特別是約1.5-2.5,則是有利的。
組分B還包含聚乙二醇或兩性化合物或同時包含二者。作為聚乙二醇,上面提到的各種聚乙二醇都是合適的。所用聚乙二醇的分子量優(yōu)選在上面指定范圍內(nèi)。如果組分B包含聚乙二醇,其量在約0.1-10.0wt%范圍內(nèi),優(yōu)選約在0.5-5.0wt%范圍內(nèi)(基于組分B的重量)。
如果組分B包含兩性化合物,上述兩性化合物是優(yōu)選的。組分B中兩性化合物的量在約0.1-20wt%范圍內(nèi),尤其約1-15或約12wt%。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,組分B可包含如下組分,其量如下 磷酸二氫鈉 約10-20wt% 磷酸約5-10wt% 聚乙二醇約2-5wt% 羥乙基纖維素約0.2-1.0wt% 水 加至10wt% 組分A和組分B可包含一種或多種上述添加劑。組分A和B之一優(yōu)選包含至少一種著色劑,以便能夠區(qū)分兩種組分,并且能夠確定應(yīng)用前兩種組分是否完全混合。
組分A和B的混合比例很大程度上取決于所需混合物的性質(zhì)。兩種組分通常必須這樣混合,使得混合物的pH值低于組分A的pH值。優(yōu)選這樣選擇比例,使得混合物的性質(zhì)符合上述的含胃蛋白酶的組合物性質(zhì)。因此,組分A和B混合的比例優(yōu)選使得混合物的pH值小于約4,優(yōu)選小于約3.8或小于約3.5,特別優(yōu)選小于約3.3,或小于約3.2。
組分A和B的混合物還優(yōu)選具有如下性質(zhì) pH值約1.5-3.5 粘度約10-50mPas 胃蛋白酶活性約1000-10000 緩沖容量約0.5-2.0 有利地制備組分A和B宜,以得到具有上述性質(zhì)的混合物以便于應(yīng)用,組分A和B之比約為5∶1-1∶5,特別是約2∶1-1∶4,或約1∶1-1∶3.5,優(yōu)選約1∶2-1∶3。
本發(fā)明還涉及除齲方法,它采用的處理溶液包含至少一種胃蛋白酶,其中胃蛋白酶在pH值約為5或以下,或者pH值約為4或以下時,其蛋白酶解的催化活性最佳。
此外,本發(fā)明涉及除齲方法,其中齲損害與至少一種本發(fā)明組合物和至少一種含胃蛋白酶的處理溶液接觸,其中胃蛋白酶在pH值低于7時蛋白酶解的催化活性最佳。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,例如,這種處理溶液包含天冬氨酸蛋白酶,優(yōu)選胃蛋白酶。該方法所用處理溶液的初始pH值優(yōu)選約為1.0-2.5。本發(fā)明所用處理溶液優(yōu)選包含緩沖液。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及治療齲齒的方法,其中混合上述兩個組分A和B,然后使齲損害與此混合物接觸。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及使用含組分A和B的混合物,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶活性最佳時的pH值;組分B包含水、酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶活性最佳時的pH值,用于治療齲齒。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及使用含組分A和B的混合物,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶活性最佳時的pH值;組分B包含水、酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶活性最佳時的pH值,用于制備治療齲齒用的醫(yī)藥產(chǎn)品。
優(yōu)選用這種包含胃蛋白酶的處理溶液治療齲齒的方法基本上按照已經(jīng)描述的方法、其中采用了本發(fā)明組合物。
酸性處理溶液可通過已經(jīng)多孔的釉質(zhì)蓋層接近齲損害齒中包被礦物質(zhì)的蛋白質(zhì)部分。同時,酸使齲損害中的蛋白質(zhì)變性。這樣就支持了蛋白酶解降解。這對于高膠原比例是特別有利的,因?yàn)樘烊缓徒Y(jié)構(gòu)完整的膠原只受到胃蛋白酶的緩慢侵襲。酸和胃蛋白酶在此情況下具有協(xié)同效應(yīng)。
為防止這里所述組合物穿進(jìn)牙齒太深,從而損害健康的牙齒,需要使用羥磷灰石的堿性性質(zhì)。羥磷灰石溶解越多,溶液的pH值就越偏向5.5,這限制了酸性胃蛋白酶溶液對羥磷灰石的溶解能力。因此,含酸性胃蛋白酶的溶液不會對牙齒健康區(qū)域構(gòu)成威脅。此外,有利的是酸性胃蛋白酶溶液具有殺菌效果。
在本發(fā)明中,所述處理溶液在治療齲損害的過程中可單獨(dú)用于一個步驟或多個連續(xù)步驟。但根據(jù)本發(fā)明,處理溶液也可以與本發(fā)明組合物聯(lián)合使用,特別是與本發(fā)明包含溶劑的組合物聯(lián)合使用。
一般地,用本發(fā)明組合物和酸性處理溶液進(jìn)行治療步驟的順序基本上是任意的。因此,本發(fā)明組合物和酸性處理溶液可在兩個或多個步驟中交替使用,或者一個接著一個,每個連續(xù)應(yīng)用數(shù)次。因此,第一個處理步驟可用本發(fā)明組合物進(jìn)行,也可以用酸性處理溶液進(jìn)行。
清洗步驟優(yōu)選在獨(dú)立的處理步驟之間進(jìn)行,其中齲損害的溶解部分的殘留物與治療用組合物或處理溶液一起除去。
本發(fā)明還涉及除齲的方法,其中齲損害與至少一種本發(fā)明組合物和至少一種處理溶液接觸,所述處理溶液包含至少一種胃蛋白酶,胃蛋白酶在pH值小于7時蛋白酶解的催化作用最佳。治療過程優(yōu)選分兩步或多步進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式,例如,當(dāng)先用本發(fā)明的溶液進(jìn)行兩步培養(yǎng),最后的培養(yǎng)步驟用酸性處理溶液進(jìn)行時,則是有利的。酸性處理溶液對牙齒表面稍有蝕刻,因此在除齲后很適合為補(bǔ)牙治療作準(zhǔn)備。由于酸性處理溶液的蝕刻效果,使表面堅(jiān)硬和有些粗糙,因而補(bǔ)牙材料在牙齒上粘著很好。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式,當(dāng)?shù)谝粋€培養(yǎng)步驟用含酸性胃蛋白酶的溶液進(jìn)行是有利的。如果在牙齒損害情況下,釉質(zhì)層覆蓋著受感染的牙質(zhì),但由于齲的存在,所述釉質(zhì)已經(jīng)多孔并軟性,以至于酸可足以通過多孔釉質(zhì)層接近牙質(zhì),從而使膠原變性,使變性的膠原降解,則此方法是最佳的。
因此,例如,用本發(fā)明溶液進(jìn)行培養(yǎng)的步驟以便降解變性的膠原。
用本發(fā)明方法治療齲齒的效果是,以前受齲影響的牙齒區(qū)域基本上沒有留下可檢測齲活性細(xì)菌。例如,這可由顯微鏡分析證明。
本發(fā)明提出的治療齲齒的溶液通??梢匀魏慰蛇x擇的形式提供給使用者。在基本形式中,可為使用者提供一個試劑盒,它包括上述兩種或多種酶,它們由使用者以需要的量進(jìn)行混合。
因此,本發(fā)明還涉及一個試劑盒,它包含至少兩種酶,這兩種酶能混合以得到本發(fā)明的組合物。
為便于使用者混合,宜在試劑盒中增加合適的溶劑。此外,如果試劑盒中包含的酶已經(jīng)以合適的混合比例混合,使其活性在上述范圍內(nèi),則完全有可能有利于應(yīng)用。
將用本發(fā)明組合物和用酸性處理溶液聯(lián)合處理通常有意義。在這種情況下,為便于使用者的使用,宜將本發(fā)明組合物和酸性處理溶液也作為試劑盒提供。
因此,本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明組合物或至少一種酸性處理溶液的試劑盒,其中酸性處理溶液包含至少一種胃蛋白酶,其蛋白酶解催化活性在pH值低于7時達(dá)到最佳;或者包含至少一種本發(fā)明組合物和至少一種酸性處理溶液,其中酸性處理溶液包含至少一種胃蛋白酶,其蛋白酶解催化活性在pH值最多為4時達(dá)到最佳。
當(dāng)本發(fā)明組合物包含雙組分時,這些組分通??梢匀魏晤愋偷陌b形式提供,例如管、燒瓶等。但是,對于少量液體的使用,先有技術(shù)揭示了許多方法,它們方便使用這種少量液體,尤其是在牙科領(lǐng)域,該領(lǐng)域?qū)Σ僮骺臻g的限制常使得簡單施藥器的操作困難。
從技術(shù)角度講,本發(fā)明優(yōu)選采用包裝更先進(jìn)的上述具有雙組分A和B的組合物,這種包裝有利于雙組分的混合和施用。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式,雙組分A和B可用多室施藥器提供,如WO 02/06820第3-4頁、第13-17頁以及
圖1-4,DE 10056212A1第2-10欄和圖1-5,以及美國專利6105761第2-5欄和圖1-6所示。上述文獻(xiàn)在此明確引用,其內(nèi)容,尤其是涉及以上提及的多組分組合物的給藥器具的內(nèi)容,均視作本發(fā)明內(nèi)容的一部分。
因此,本發(fā)明涉及用于儲存和分發(fā)液體的多室器具,其特征在于至少有一個室包含組分A,至少有一個室包含組分B,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶最有活性時的pH值;組分B包含水、酸、流變添加劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶最有活性時的pH值。
本發(fā)明還涉及至少一種胃蛋白酶的使用,其蛋白酶解催化活性在酸性pH范圍低于7,尤其在pH值最多為4時最佳,可用于制備除齲的處理劑。
本發(fā)明將在以下實(shí)施例中更詳細(xì)描述。
實(shí)施例 所用的酶 胃蛋白酶、膠原酶、溶菌酶素、鏈酶蛋白酶、葡聚糖酶和α-淀粉酶購自SIGMA公司。蛋白酶K購自ICN公司。
實(shí)施例1配方 溶液1 溶液2 實(shí)施例2治療方法 為確定本發(fā)明溶液的效果而進(jìn)行的檢測用拔出的齲齒在體外進(jìn)行。
1.途徑 如有必要,可用快旋轉(zhuǎn)鉆清除覆蓋齲區(qū)域的部分釉質(zhì)層。
2.任選粗清潔 沒有必要進(jìn)行粗清潔,但粗清潔可方便牙醫(yī)檢查治療效果。齲損害的粗清潔用挖治器或齲匙進(jìn)行。
3.用酶溶液處理 1)20s100l溶液1 2)清洗 3)20s100l溶液1 4)清洗 5)20s100l溶液2 6)清洗 7)此后任選進(jìn)行補(bǔ)牙治療 由于兩種溶液均可殺滅齲齒上的細(xì)菌,治療過程可僅用溶液1或溶液2進(jìn)行,或者用不同的順序進(jìn)行。優(yōu)選聯(lián)合使用。如果接著補(bǔ)牙治療,則最后使用酸性溶液2(pH值為2.0)尤其有利。
實(shí)施例3無細(xì)菌的證據(jù) 根據(jù)要求施用酶溶液,清除了齲齒上受感染的硬物質(zhì)后,將拔出并處理過的牙齒氣吹,固定在包埋質(zhì)(Cytofix,Struers公司)中。用內(nèi)孔鋸分步將貫穿齲損害的牙齒分成幾段,除去牙齒段上覆蓋的包埋材料,每段牙齒在1ml活/死染料溶液中培養(yǎng)細(xì)菌(Live/Dead BacLight,Molecular Probes公司)。在培養(yǎng)過程中,要貯存的牙齒段避光。用熒光顯微鏡(Zeiss公司,Axioplan 2)在反射光下觀察標(biāo)記細(xì)菌,采用24FITC濾鏡,放大倍數(shù)為630和1000。在相同條件下,未處理樣品中觀察到了細(xì)菌床,而根據(jù)本發(fā)明方法處理的樣品完全沒有細(xì)菌。在較小程度上受齲破壞的牙齒材料的情況下,只用本發(fā)明的一種溶液或一種含胃蛋白酶的溶液處理一次,即可除去以前受齲影響的牙齒區(qū)域中的細(xì)菌。
雙組分溶液 本發(fā)明的雙組分體系制備如下 處理溶液通過混合1∶3的組分A和B(組分A∶組分B)來制備,例如以合適的比例在塑料容器中依次加入兩種溶液,然后充分混合兩種組分。
混合后,處理溶液的組成如下 處理過程 1)20s100μl處理溶液 2)清洗 3)20s100μl處理溶液 4)清洗 5)20s100μl處理溶液 6)清洗 7)此后任選進(jìn)行補(bǔ)牙治療 無齲的證據(jù) 根據(jù)要求施用酶溶液,清除了齲齒上受感染的硬物質(zhì)后,將拔出并處理過的牙齒氣吹,固定在包埋質(zhì)(Cytofix,Struers公司)中。用內(nèi)孔鋸分步將貫穿齲損害的牙齒分成幾段,除去牙齒段上覆蓋的包埋材料,每段牙齒在1ml活/死染料溶液中培養(yǎng)細(xì)菌(Live/Dead BacLight,Molecular Probes公司)。在培養(yǎng)過程中,貯存的牙齒段避光。用熒光顯微鏡(Zeiss公司,Axioplan 2)在反射光下觀察標(biāo)記細(xì)菌,采用24FITC濾鏡,放大倍數(shù)為630和1000。在相同條件下,未處理樣品中觀察到了細(xì)菌床,而根據(jù)本發(fā)明方法處理的樣品完全沒有細(xì)菌。在較小程度上受齲破壞的牙齒材料的情況下,只用本發(fā)明溶液處理一次,即可完全除去以前受齲影響的牙齒區(qū)域中的細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.pH值為4.0或更低的組合物,它包含水、酸、胃蛋白酶和流變添加劑,其中胃蛋白酶的濃度為1-50000U/mg,組合物的粘度為10-1000mPas。
2.權(quán)利要求1所述組合物,其特征在于它還包含聚醚或兩性表面活性劑,或聚醚和兩性表面活性劑的混合物。
3.權(quán)利要求1或2所述組合物,其特征在于所述組合物包含抑制劑。
4.包含組分A和B的組合物,其中
a)組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶最有活性時的pH值;
b)組分B包含水、酸、增稠劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶最有活性時的pH值。
5.權(quán)利要求4所述組合物,其特征在于組分A包含的胃蛋白酶的活性小于50000U/ml。
6.權(quán)利要求4或5所述組合物,其特征在于組分A包含小于20mg胃蛋白酶/ml。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述組合物,其特征在于組分A包含磷酸鹽緩沖液的pH值為5-6。
8.權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述組合物,其特征在于組分B包含磷酸的pH值為1.5-4.0。
9.權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述組合物,其特征在于組分A包含作為增稠劑的多糖。
10.權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述組合物,其特征在于組分B包含聚乙二醇或甜菜堿,或二者。
11.權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述組合物,其特征在于組分B包含流變添加劑。
12.酶的用途,其特征在于所述酶在pH值低于7時具有蛋白酶解活性,由此可制備除齲的處理劑。
13.權(quán)利要求12所述用途,其特征在于酶在pH值最多為4時具有最佳催化作用。
14.權(quán)利要求12或13所述用途,其特征在于所述酶是胃蛋白酶。
15.糖苷酶在制備除齲處理劑中的用途。
16.儲存和分發(fā)液體的多室器具,其特征在于至少有一個室包含組分A,至少有一個室包含組分B,其中組分A包含水、緩沖體系和流變添加劑,所述緩沖體系用來提供合適的pH值,使之高于胃蛋白酶最有活性時的pH值;組分B包含水、酸、流變添加劑和聚醚或兩性表面活性劑或聚醚和兩性表面活性劑的混合物,所述酸用來提供合適的pH值,使之小于胃蛋白酶最有活性時的pH值。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含酶的組合物及酶的用途,提供了一種pH值為4.0或更低的組合物,它包含水、酸、胃蛋白酶和流變添加劑,其中胃蛋白酶的濃度為1-50000U/mg,組合物的粘度為10-1000mPas。本發(fā)明還提供了酶的用途。
文檔編號A61K38/48GK101810856SQ20101014737
公開日2010年8月25日 申請日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月15日
發(fā)明者I·哈伯萊恩, R·古根伯格, W·維恩曼, O·卡普勒 申請人:3M埃斯佩股份公司