專利名稱：免疫殺手細胞及其制造方法,包含其的醫(yī)藥組成物及套組的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫殺手細胞(immune killer)的制造方法，尤其涉及一種將免疫殺手細胞應用于抑制腫瘤的醫(yī)藥組成物。
背景技術：
目前有關以免疫療法治療癌癥的研究，包括注射細胞因子(cytokine)，例如干擾素(interferon)或白介素(interleukin)，以直接刺激免疫力、提升抗癌效果。但由于這些細胞因子本身的副作用過大，例如，包括干擾素和白介素在內的一些常用細胞因子，都會引發(fā)類似感冒的癥狀，包括發(fā)燒、發(fā)冷、疲倦和消化道問題，血壓亦會受其影響。其中白介素-2(interleUkin-2，簡稱IL-2)所引發(fā)的副作用通常較嚴重，在治療過程中，醫(yī)師需格外仔細觀察患者。因此注射細胞因子雖曾為癌癥治療帶來了一線曙光，但已逐漸被認為不完全可行。除此之外，目前仍在試驗當中的免疫療法包括癌癥疫苗療法，此法也有可能改善免疫力，但由于癌癥病人的免疫系統(tǒng)多已受到抑制，效果仍然有待討論。目前免疫療法中較快速、較有效的，應屬免疫細胞(immune cell)醫(yī)療技術。所謂免疫細胞醫(yī)療技術，就是抽取病人的白血球進行培養(yǎng)，大量增殖淋巴激素活化殺手細胞(lymphokine activate killer cell，簡稱LAK細胞)、殺傷性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，簡稱CTL細胞)或自然殺手細胞(natural killer cell，簡稱NK細胞)后，再將其輸注回患者體內以產(chǎn)生抗癌功效。由于體內具有毒殺癌細胞能力的細胞，例如NK細胞及CTL細胞(LAK細胞則非體內正常的族群，它是將CTL細胞在體外利用高濃度的細胞因子培養(yǎng)后大量繁殖的細胞)， 在一般人體內的CTL細胞及NK細胞數(shù)量有限或活性受抑制，因此長期以來即有免疫學家試著在體外以細胞因子大量培養(yǎng)這些細胞后，再打入病人體內，直接提高病人的抗癌活性。這方法的優(yōu)點是效果迅速、不會有排斥現(xiàn)象(因細胞取自于病人本身)，且由于注射前須先去除細胞因子，因此，也不致產(chǎn)生細胞因子的副作用。此法最重要的關鍵是要能夠增殖足夠的細胞并給予適當?shù)幕罨?，如此才能發(fā)揮充分的抗癌效果。此方法過去較無大量的臨床應用， 主要就是一直無法突破大量增殖的瓶頸，或所增殖的細胞活性不夠高之故。目前對于免疫細胞的體外培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，往往因為必須使用動物來源的抗體蛋白作為刺激物，容易造成人畜共通疾病的傳染等副作用，危及病患的生命健康。例如，中國發(fā)明專利ZL 20031019565. 5號，使用植物血球凝集素(phytohemagglutinin，簡稱 PHA)及抗CD3單株抗體(anti-CD3monoclonal antibody，簡稱抗CD3mAb) 二種有絲分裂原聯(lián)合活化細胞，增強對細胞的刺激強度，進而提高細胞的體外增殖能力。然而，其使用的抗 CD3mAb，來源大多來自實驗老鼠，且老鼠與人類的基因非常接近，難保無人畜(鼠)共通疾病的病源菌污染的可能，而容易造成危害人體生命的不良后果。
發(fā)明內容
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本發(fā)明的主要目的是提供一種免疫殺手細胞的制造方法，其特征為于包含刀豆球蛋白(concanavalin Α)的培養(yǎng)基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養(yǎng)的步驟， 而不需使用任何抗體蛋白。上述的方法，其中該培養(yǎng)基中進一步包含白介素、干擾素或植物血球凝集素 (phytohemagglutinin)。上述的方法，其中該培養(yǎng)基中不包含任何抗體蛋白作為刺激物。上述的方法，其中該刀豆球蛋白于培養(yǎng)基中的濃度為0. 1 100yg/mL，較佳為 0. 1 30μ g/mL。上述的方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)的步驟。上述的方法，其中該周邊血液單核細胞于培養(yǎng)基中的濃度為0. IXlO6 IOXlO6 個/mL。本發(fā)明的另一目的是提供一種免疫殺手細胞，其由上述的方法所制造。上述的免疫殺手細胞，其包含自然殺手細胞、自然殺手T細胞(natural killer T cell，簡稱NKT細胞)、gamma/delta T細胞(γ δΤ cell，簡稱γ δ T細胞)及殺傷性T 細胞(cytotoxic T cell，簡稱 Tc 細胞或 CTL)。上述的免疫殺手細胞，其組成比例為5 20%的自然殺手細胞、15 50%的自然殺手T細胞、10 30%的gamma/delta T細胞及40 70%的殺傷性T細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制腫瘤的醫(yī)藥組成物，其包含有效量的上述的免疫殺手細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種套組，其包含上述的醫(yī)藥組成物。更明確地，本發(fā)明涉及一種自體免疫殺手細胞的制備方法及其應用，其是從取得的病患血液中，于無菌狀態(tài)下將周邊血液單核細胞(簡稱PBMC)分離出，用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中包含刀豆球蛋白(簡稱ConA)、白介素-2(簡稱IL-2)、干擾素-Y (interferon-γ)或植物血球凝集素(簡稱PHA)。其中并沒有使用來自老鼠或其他動物的抗體蛋白作為刺激物，可避免人畜共通疾病感染風險，并且有效增加免疫殺手細胞的數(shù)量及活性。本發(fā)明若在培養(yǎng)基中添加適量的ConA及IL-2等細胞因子作為刺激物，可以有效促成NK細胞、NKT細胞、Tc細胞及γ δ T細胞等免疫殺手細胞的增殖及活化，且各細胞間的組成比例具有一定的百分比分布時，可達到最好的活性效果。另外，當改變上述刺激物的濃度及比例時，可以調整上述各細胞間的組成比例百分比及增殖數(shù)量，以配合不同的應用。
圖1為本發(fā)明的免疫殺手細胞的培養(yǎng)生長曲線。
具體實施例方式為充分了解本發(fā)明的目的、特征及功效，現(xiàn)利用下述具體的實施例，并配合所附的圖式，對本發(fā)明做詳細說明。以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明的技術內容，并不用以限制本發(fā)明的申請專利范圍。
1.免疫殺手細胞的細胞培養(yǎng)實驗以下為免疫殺手細胞的細胞培養(yǎng)步驟(1)將從周邊靜脈血中分離抽出的PBMC移入細胞培養(yǎng)瓶中，并以培養(yǎng)基將細胞的濃度調整為0. 5X IO6 2X IO6個/mL，并放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述的培養(yǎng)基可為RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、ALys培養(yǎng)基或AIM-V培養(yǎng)基中的任何一種，而且培養(yǎng)基中應含有以下成份刀豆球蛋白0. 1 30 μ g/mL白介素-2 (Proleukin)200 1000IU/mL干擾素-γ600 1500單位人自體血清(Human Auto Serum)5 12%(2)細胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)2至6天之后，以培養(yǎng)基或生理食鹽水洗滌1 2 次，再以新鮮的培養(yǎng)基將細胞打散并將細胞濃度調整為0. 3 X IO6 2 X IO6個/mL，并放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述的培養(yǎng)基可為RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、ALys培養(yǎng)基或AIM-V培養(yǎng)基中的任何一種，而且培養(yǎng)基中應含有以下成份白介素-2(Interleukin_2) 200 600IU/mL干擾素-γ100 300U/mL白介素-1510 50ng/mL(3)以后視細胞生長密度而定，大約每隔2至3天加入新鮮的培養(yǎng)基，并調整細胞的濃度使其介于0. 3X IO6 2X IO6個/mL，最后放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述的培養(yǎng)基可為RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、ALys培養(yǎng)基或AIM-V培養(yǎng)基中的任何一種，而且培養(yǎng)基中應含有以下成份白介素-2 (Interleu kin-2) 100 500IU/mL干擾素-γ80 150U/mL白介素-1510 30ng/mL(4)以后每隔2至3天重復上述步驟(3)的操作，直至總共培養(yǎng)14天為止。經(jīng)過上述方法培養(yǎng)出來的免疫殺手細胞為混合細胞，其中包括NK細胞(具⑶3 陰性、⑶56陽性表型)、NKT細胞(具⑶3陽性及⑶56陽性表型)、Y δ T細胞(具有γ δ 型T細胞受體的T細胞)及Tc細胞(具α β型T細胞受體的典型殺傷性T細胞)，其為免疫系統(tǒng)中活性最強的殺手細胞。利用上述方法培養(yǎng)出來的免疫殺手細胞，由于個體間的差異，各細胞間的組成比例分布會因人而異，但總體而言，絕大多數(shù)人的組成百分比如下ΝΚ細胞約占5 20%、 NKT細胞約占15 50%、γ δ T細胞約占10 30%、iTc細胞約占40 70%。圖1為本發(fā)明的免疫殺手細胞的培養(yǎng)生長曲線，其是從6名自愿者(以圖中的6 種顏色表示)的上臂靜脈各抽出30c. c.的血液，依上述方法進行處理、培養(yǎng)。培養(yǎng)后每隔1 到3天則從細胞培養(yǎng)液中取樣并計算細胞總數(shù)，對照培養(yǎng)天數(shù)繪制成圖。圖中縱軸為免疫殺手細胞的數(shù)量，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)，由圖中數(shù)據(jù)可知，免疫殺手細胞經(jīng)培養(yǎng)后其總數(shù)明顯增加，至第14天時總數(shù)已經(jīng)超過IO9個。2.免疫殺手細胞毒殺癌細胞的實驗PBMC經(jīng)過培養(yǎng)后變成免疫殺手細胞(簡稱IKC)，其抗肺癌及肝癌的活性大幅增加，如表1所示。其中六個志愿者的免疫殺手細胞及PBMC在E/T = 50時，其毒殺肺癌細胞 (NCI-H23)及肝癌細胞(Hep3B)的活性(Specific release)有顯著差異。表1結果為利用 1 4h 51 Cr-release assay表 權利要求
1.一種免疫殺手細胞的制造方法，其特征為于包含刀豆球蛋白的培養(yǎng)基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養(yǎng)的步驟。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該培養(yǎng)基中進一步包含白介素、干擾素或植物血球凝集素。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中該培養(yǎng)基中不包含抗體蛋白作為刺激物。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該刀豆球蛋白于培養(yǎng)基中的濃度為0.1 100μ g/mL0
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中該刀豆球蛋白于培養(yǎng)基中的濃度為0.1 30yg/mLo
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞的步驟。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中該周邊血液單核細胞于培養(yǎng)基中的濃度為 0. IX IO6 10 X IO6 個/mL。
8.一種免疫殺手細胞，其由根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的方法所制造。
9.根據(jù)權利要求8所述的免疫殺手細胞，其包含自然殺手細胞、自然殺手T細胞、 gamma/delta T細胞及殺傷性T細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的免疫殺手細胞，其組成比例為5 20%的自然殺手細胞、 15 50%的自然殺手T細胞、10 30%的gamma/delta T細胞及40 70%的殺傷性T細胞。
11.一種抑制腫瘤的醫(yī)藥組成物，其包含有效量的根據(jù)權利要求8至10中任一項所述的免疫殺手細胞。
12.—種套組，其包含根據(jù)權利要求11所述的醫(yī)藥組成物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫殺手細胞及其制造方法，包含其的醫(yī)藥組成物及套組，其特征為利用包含刀豆球蛋白的培養(yǎng)基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養(yǎng)的步驟。由于其培養(yǎng)過程當中不使用抗體蛋白作為刺激物，可避免人畜共通疾病的感染風險，且可有效增加免疫殺手細胞的數(shù)量及活性。
文檔編號A61P35/00GK102212505SQ201010145549
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權日2010年4月8日
發(fā)明者張順浪 申請人:長春藤生命科學股份有限公司