專利名稱：哺乳動物肝細(xì)胞體外組織化培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用一種新型的特異性培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行肝細(xì)胞體外組織化培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
肝臟是人體的重要器官，肝臟的病變，如肝硬化、肝衰竭等會危及患者的生命。臨 床上對肝臟病變晚期的患者實施肝臟移植手術(shù)來延緩患者的生命。由于肝臟供體來源的問 題，很多肝病晚期患者因為等不到供體，而終止生命。即便得到供體，接受肝移植的患者，也 要在隨后的生活中承擔(dān)著終身藥物免疫抑制的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，新的治 療手段為患者提供了改善和復(fù)活肝功能的可行性。 組織工程學(xué)是融合了工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和基本 方法，在體外構(gòu)建一個有生物活性的種植體，植入體內(nèi)修復(fù)組織缺損，替代器官功能；或作 為一種體外裝置，暫時替代器官功能，達(dá)到提高生存質(zhì)量，延長生命活動的目的。組織工程 學(xué)是一個跨學(xué)科的領(lǐng)域，其將工程和材料科學(xué)與醫(yī)學(xué)結(jié)合在一起。目標(biāo)在于恢復(fù)受損組織 或改善其功能。其原理是從人或動物體中取出部分組織，體外提取細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng) 與增殖。然后將其再次移植到體內(nèi)。與傳統(tǒng)的供(受)體移植不同，傳統(tǒng)的移植需要供體， 而且移植后需要終身藥物免疫抑制。而本方法則提供了能夠使用內(nèi)源(自體)細(xì)胞的極其
重要ifc點。 組織工程學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，其關(guān)鍵就是細(xì)胞體外的培養(yǎng)與增殖，這對移植到體內(nèi)的
細(xì)胞是否發(fā)揮功能，是極其重要的。目前細(xì)胞體外培養(yǎng)方法越來越多，也越來越先進(jìn)，但存 在的問題是，原生肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中， 一定時間內(nèi)較難培養(yǎng)出相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，從而 移植回體內(nèi)達(dá)不到肝細(xì)胞的功能。 CN1587392A在聚砜中空纖維絲內(nèi)進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)，由于促進(jìn)肝細(xì)胞球狀體 的形成需較長時間，而球狀體形成的推遲會使肝細(xì)胞較快失去分化表型和發(fā)生死亡；而 CN101624473A在由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖制備得到的載體中進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)，此 方法如需進(jìn)行肝細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，還需優(yōu)化微載體制備反應(yīng)條件。并且上述方法獲得的 肝細(xì)胞可作用于體外生物反應(yīng)器，不便于移植到體內(nèi)形成組織化。為獲得一定數(shù)量的肝細(xì) 胞，使其移植回體達(dá)到肝細(xì)胞的功能并能組織化，原生肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法的條件控制 非常重要，尤其細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和形狀大小非常關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能使肝細(xì)胞在體外快速、高效的培養(yǎng)基質(zhì)，基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)具有 更大的體表面積比，有利于肝細(xì)胞在基質(zhì)上的粘附，利于肝細(xì)胞間的信息傳遞以及營養(yǎng)、氧 氣和代謝物之間的流通，從而提高體外肝細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量和數(shù)量，使移植回體內(nèi)的肝細(xì)胞達(dá) 到相應(yīng)的功能；并且培養(yǎng)基質(zhì)的形狀、大小有利于移植回體內(nèi)。 —種哺乳動物肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其關(guān)鍵是使用經(jīng)靜電紡織成的具有三維多 孔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基質(zhì)。
其中，培養(yǎng)基質(zhì)由膠原蛋白或絲素蛋白，與聚乳酸(PLA)按質(zhì)量百分比配置成混 合物，利用靜電紡織技術(shù)制備。 其中，聚乳酸的分子量為10000-150000道爾頓。 其中，膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%，聚乳酸為60-80%的混合物溶于二 氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6_8%的電紡液； 其中，將電紡液加入靜電紡織裝置中，靜電紡織制成直徑l-2cm，高度3-4mm的扁 圓柱形基質(zhì)； 其中，將靜電紡織獲得的基質(zhì)用真空干燥方法去除殘留的二氯甲烷； 其中，基質(zhì)體積93-96%為微孔，4-7%為基材； 其中，基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80iim-500iim之間； 其中，優(yōu)選基質(zhì)具有如下的孔徑分布，基質(zhì)上大約4%的孔平均直徑在
80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 ii m ;大約7%的孔平均直徑在121-130 y m ;
大約5%的孔平均直徑在131-260 iim ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ;大約15%
的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6 %的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10 %的孔平
均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5 %的孔平均直
徑在431-460 ii m ;大約15%的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10%的孔平均直徑在
481-500 ii m。合適的孔徑大小與分布能提高細(xì)胞的培養(yǎng)效率和質(zhì)量。 其中，基質(zhì)上孔間相互連通； 其中，基質(zhì)的消毒用Y射線照射； 其中，所述哺乳動物是人或大鼠。 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的方法中使用的微孔結(jié)構(gòu)的基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞吸附，有利于細(xì)胞間的 相互接觸以及氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，使肝細(xì)胞在體外高密度培養(yǎng)，并保持細(xì)胞生物學(xué)活性 及其功能，另外，基質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，植入體內(nèi)后，有利于血管的在基質(zhì)中攀爬生長、組織化。
具體實施例方式
l，細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)制備 膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%與60_80%的聚乳酸(分子量10000-150000 道爾頓)混合物溶于二氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6-8 %的電紡液，經(jīng)靜電紡織技術(shù)織成直 徑為l-2cm，高度為3-4mm的扁圓柱形。真空干燥去除殘留二氯甲烷?；|(zhì)體積93-96% 為微孔，4-7%為基材?？字睆綖?0um-500um之間，微孔間相互連通。其中，大約4%的孔 平均直徑在80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 y m ;大約7%的孔平均直徑在 121-130 ii m ;大約5%的孔平均直徑在131-260 ii m ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ; 大約15%的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6%的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10% 的孔平均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5%的孔平均 直徑在431-460 ii m ;大約15 %的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10 %的孔平均直徑在 481-500 iim。 2，肝細(xì)胞的體外培養(yǎng) 1)取受體(人或大鼠)小部分肝組織，同時抽取50ml血清；
2)肝組織用針頭針剌若干小孔，(TC保存在EGTA溶液最多80分鐘，直到肝組織由 暗紅變成灰白色； 3)用10,1/L HEPE緩沖液(2. 38克HEPES，用蒸餾水溶解并定容至lOOOml， pH7. 2) ， 37"灌注肝組織5-8分鐘； 4)用膠原酶/胰蛋白酶溶液(8. 3gNaCl ;0. 5g KC1 ;2. 38克HEPES ;0. 7g CaCl2 2H20 ;500mg膠原酶；7. 5mg胰蛋白酶抑制劑；蒸餾水補(bǔ)至lOOOml， Ph7. 2)37。C灌注 肝組織5-8分鐘； 5)剪刀剪切肝組織，用常規(guī)方法提取肝細(xì)胞； 6)提取的肝細(xì)胞懸浮于20ml Williams E和步驟1)獲得的血清混合溶液中(體 積百分比為95 : 5)，成為A溶液； 7)取1ml上述含有肝細(xì)胞的A溶液，加入經(jīng)靜電紡織制成的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的 培養(yǎng)基質(zhì)中； 8)步驟7)的基質(zhì)在溫度37t:，濕度90-96%，5-8%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時， 以便細(xì)胞充分附著在基質(zhì)上；再加入3ml含有肝細(xì)胞的A溶液，同樣條件下培養(yǎng)至少48小 時； 9)電子顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，鏡下可見80%以上為成活的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞 數(shù)量大約為2X1()5個； 10)另用錐蟲藍(lán)(Trylan Bule)溶液測定細(xì)胞活性，活性大于95% ; 11)將培養(yǎng)后的含有肝細(xì)胞的基質(zhì)存放于20ml Williams E和血清混合溶液(體
積百分比為95 : 5)中，37t:保存?zhèn)溆谩?3，動物實驗 利用上述方法對Lewis鼠進(jìn)行肝細(xì)胞腹腔內(nèi)移植。移植1和4個月后取出移植物 進(jìn)行檢測移植基質(zhì)中肝細(xì)胞數(shù)量，平均每立方毫米體積內(nèi)，移植后1和4個月分別為3 X 103 和5X103個肝細(xì)胞，表現(xiàn)出正常的白蛋白表達(dá)，并且形成血管，血管延伸到基質(zhì)當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種哺乳動物肝細(xì)胞的體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用經(jīng)靜電紡織技術(shù)制成的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基質(zhì)由膠原蛋白或絲素蛋白，與聚乳酸(PLA)按質(zhì)量百分比配置成混合物，利用靜電紡織技術(shù)制備。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%，聚乳酸為60-80%的混合物溶于二氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6-8%的電紡液。
4. 如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于靜電紡織制成直徑l-2cm，高度3-4mm的扁圓柱形基質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求l-4之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80踐-500iim之間。
6. 如權(quán)利要求1_5之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上大約4%的孔平均直徑在80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 ii m ;大約7%的孔平均直徑在121-130 y m ;大約5%的孔平均直徑在131-260 iim ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ;大約15%的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6 %的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10 %的孔平均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5 %的孔平均直徑在431-460 ii m ;大約15%的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10%的孔平均直徑在481-500 iim。
7. 如權(quán)利要求l-6之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)體積93-96%為微孔，4-7%為基材。
8. 如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上孔間相互連通。
9. 如權(quán)利要求1-8之一所述的方法，其特征在于將靜電紡織獲得的基質(zhì)用真空干燥去除殘留的二氯甲烷。
10. 如權(quán)利要求1-9之一所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人或大鼠。
全文摘要
一種哺乳動物肝細(xì)胞的體外組織化培養(yǎng)方法，使用靜電紡織的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。基質(zhì)直徑為1-2mm，厚度3-4mm，基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80μm-500μm之間，孔孔間相互連通。本發(fā)明的方法使人或動物肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)迅速增殖，保持肝細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)活性及其功能。
文檔編號A61L27/26GK101775365SQ201010134109
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者苑國忠 申請人:苑國忠