一種能無限自我更新的神經(jīng)干細胞、其制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：一種能無限自我更新的神經(jīng)干細胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及細胞學、神經(jīng)生物學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)干細胞、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細胞(neural stem cell, NSC)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細胞。根據(jù)分化潛能的時序分為 主要存在胚胎時期的神經(jīng)管上皮細胞、放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細胞。放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元主要存在于幼年時期，可以分裂產(chǎn)生本身并同時產(chǎn)生神經(jīng)元前體細胞或是膠質(zhì)細胞；神經(jīng)母細胞主要存在于成年動物體中，可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細胞、神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 而根據(jù)部位分類可以主要分兩類可發(fā)育為外周神經(jīng)細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和Schwann氏細胞和平滑肌細胞等的神經(jīng)嵴干細胞(neural crest stemcell, NC-SC)；可發(fā)育成為神經(jīng)系統(tǒng)的大部分細胞，稱為中樞神經(jīng)干細胞(CNS-SC)，主要存在于腦部。目前將具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞都統(tǒng)稱為NSC。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)及康復治療外，近年來細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究得到了廣泛開展，主要包括骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞與NSC 移植等。2009年，Sharp等人成功的將人胚胎干細胞注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，從而使大鼠恢復了運動能力(Jason Sharp, Jennifer Frame, Monica Siegenthaler, et al. Human embryonic Stem Cell-Derived OligodendrocyteProgenitor Cell Transplants Improve Recovery after CervicalSpinal Cord Injury. Stem Cells，2009，1002 (10) ·)。但直接注射胚胎干細胞還存在形成腫瘤的風險。Brederlau等人將分化16天人胚胎干細胞移植入 Parkinson病大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示在22只大鼠中有16只生成畸胎瘤；而將分化23d的細胞進行移植實驗卻未發(fā)現(xiàn)生成畸胎瘤情況(Brederlaua.，Correia A. S.，Anisimovs S. V.， et al. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cells toa Rat Model of Parkinson's Disease :Effect of In VitroDifferentiation on Graft Survival and Teratoma Formation. StemCells, 2006, 24 1433 1440.)。這說明未完全分化的細胞容易生成畸胎瘤，直接應用到臨床還是存在風險的。而利用NSC進行細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有效且安全的選擇。NSC細胞不具有成瘤性，具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分化的潛能；是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識別，具有低免疫源性；其組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活，是最理想的細胞移植材料。NSC不僅可以存活和整合入宿主組織中，分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，填充因損傷造成的空洞，并且可以和宿主細胞之間形成突觸樣的結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)組織損傷區(qū)域的結(jié)構(gòu)得以重建，進而恢復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分功能(YW Z，et al. . Oligodendrocyteprogenitor cells derived from human embryonic stem cellsexpress neurotrophic factors. Stem
3Cells and Development. 2006，15 :943_952·)，因此業(yè)內(nèi)一直致力于NSC的臨床應用研究。NSC可以由胚胎干細胞、誘導多能干細胞和其它干細胞分化而來。胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)是從哺乳動物的囊胚內(nèi)細胞群(inner cell mass, I CM)和原始的生殖細胞(primordial germcells, PGC)著床前胚胎內(nèi)細胞團中分離出來的一種全能性的多功能干細胞，這種細胞可以在體外進行擴增培養(yǎng)(Reubinof B E, hsyksonP, Turetsky T, et al. Neural progenitors from human emb ryonicstem cells. Nat Biotehnol，2001，19 (12) :1134_1140.)。胚胎干細胞具有可以自我復制、自我更新并能發(fā)育為完整的生物個體并可以產(chǎn)生后代的能力，在一定的條件下，其可以分化為人體的200多種類型的細胞，并可以構(gòu)建成心、肺、肝、脾、腎等各種組織和器官，最終可以發(fā)育成一個完整的生物個體(Heins N, Englund MC, SjoblomC, et al. Derivation, characterization, and differentiation ofhuman embryonic stem cells. Stem Cells, 2004,22(3) :367-376. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, et al. Embryonic stem cell linesfrom human blastocysts:somatic differentiation in vitro. NatBiotechnol, 2000,18(4) :399-404.)。胚胎干細胞與成體組織中的干細胞不同，胚胎干細胞具有以下特點具有多向分化潛能和受精卵的某些特性，保持未分化狀態(tài)，具有自我復制的能力，可以分化為生物體內(nèi)各種類型的組織細胞；可以在體外培養(yǎng)的條件下通過單細胞克隆建立有相同遺傳特性的穩(wěn)定的細胞系，可長期增殖培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性；胚胎干細胞端粒酶活性呈陽性，具有維持端粒長度，保持干細胞增殖能力的重要作用；胚胎干細胞注射到裸鼠皮下，可形成畸胎瘤；胚胎干細胞也較易于形成嵌合體動物和進行基因改造， 從而成為細胞與個體之間的橋梁并成為臨床細胞移植治療新的細胞來源。日本京都大學的Yamanaka等研究發(fā)現(xiàn)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將c_Myc、Klf4、0ct4、 Sox2這4個轉(zhuǎn)錄因子基因整合入小鼠成纖維細胞可以獲得成體細胞誘導的多能干細胞 (induced pluripotent stem cell, iPS細胞)，即多能性干細胞。通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒向小鼠皮膚的成纖維細胞中導入4個不同作用的關(guān)鍵基因0ct3/4、Sox-2、Klf-4與C-myc， 使它們與原有基因發(fā)生重組，成功地對成纖維細胞實現(xiàn)了基因重新編排，產(chǎn)生的細胞最終具有胚胎干細胞的特性，具備變成機體任何細胞的潛能，它們能和真正的胚胎干細胞一樣發(fā)育，參與形成胎兒小鼠的身體各部分(Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generationof germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007 ；448 (7151) 313-7. Wernig Μ,Meissner A,Foreman R,et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state. Nature. 2007 ；448(7151) :318_24·)。2007 年 11月底，Yamanaka課題組及Thomson JA課題組同時從人的纖維細胞誘導成具有多分化潛能的 iPS 細胞(Takahashi K, Tanabe K, OhnukiM, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors. Cell. 2007 ；131 (5) 861-72. YuJ, Vodyanik MA,Smuga-Otto K,et al. Induced pluripotent stemcell lines derived from human somatic cells. Science. 2007 ；318 (5858) :1917_20)。2008 年 1 月哈佛大學 Daley GQ i果題組也證實了這一實驗(Park IH, Zhao R，West JA, et al. Reprogramming ofhuman somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature.2008 ； 451 (7175) 141-6) 國內(nèi)中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的裴端卿、秦大江課題組掌握并發(fā)展了干細胞研究新技術(shù)，利用未經(jīng)修飾并且不帶有選擇標記的小鼠成體細胞，探索
4出了直接運用ip s技術(shù)的新途徑，并獲取了近千分之三左右的高成功率(Qi H, PeiD. The magic of four-induction of pluripotent stem cells fromsomatic cells by 0ct4, Sox2, Myc and Klf4. Cell Res. 2007 ； 17 (7) :578_80)。iPS細胞類似胚胎干細胞，具有胚胎干細胞的很多生理生化特性，例如，可以在體外快速增殖并穩(wěn)定傳代；并可持續(xù)表達胚胎干細胞的標志蛋白0ct4，Sox2, SSEA-I和 Nanog ；持續(xù)具有堿性磷酸酶活性；裸鼠皮下注射有成瘤性；體內(nèi)體外分化實驗證明可分化為三胚層；小鼠和大鼠的多能性干細胞還可獲得嵌合鼠等。繼小鼠之后，用逆轉(zhuǎn)錄病毒將 c-Myc.Klf4.0ct4.Sox2這4個轉(zhuǎn)錄因子基因整合入人成纖維細胞可以獲得人的iPS細胞。 與此同時，用慢病毒將0Ct4、SOX2、NanOg、Lin28基因整合入人成纖維細胞也獲得了多能性干細胞。從高度分化的體細胞誘導產(chǎn)生多能性干細胞，有廣泛的應用前景，例如，多能性干細胞可以用于建立體外疾病模型，進行藥物篩選和細胞替代療法等，而且，將體細胞轉(zhuǎn)化為有胚胎干細胞特性的細胞系后，那么一種高度分化的體細胞就可可能轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N高度分化的體細胞。因為多能性干細胞的研究有可能避免諸多的倫理問題，因此，全世界許多實驗室也投入了 iPS細胞的研究工作，并且成功將多種細胞誘導為多能性干細胞，如成纖維細胞、終末期分化的淋巴細胞、角質(zhì)細胞、肝細胞、胃上皮細胞和屬于成體干細胞的神經(jīng)干細胞。NSC在動物實驗和臨床前研究中已顯示出良好的應用前景。2009年1月22日， 美國著名的胚胎干細胞研發(fā)公司GERON公司獲FDA批準，將開展用ES分化而來的神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞GRN0PC1治療脊髓損傷的人體試驗。GERON公司前期的臨床前研究表明GRN0PC1 注射到脊髓損傷的部位，能夠遷移到受損部位并能夠成熟為有功能的少突膠質(zhì)細胞，這些細胞具有軸突再生和分泌因子的功能，注射GRN0PC1的實驗組動物較對照組運動功能得到顯著改善。將從人胚胎分離得到的NSC直接移植到大鼠帕金森疾病模型的大腦內(nèi)部后， NSC可以向表達酪氨酸羥化酶(TH)的多巴胺能神經(jīng)元分化，并明顯改善運動不平衡癥狀； 移植到亨廷頓舞蹈癥(Huntington’ s disease, HD)大鼠模型腦內(nèi)后，實驗中可以得到大量的由NSC分化來的神經(jīng)元細胞，這些細胞可以沿著宿主的白質(zhì)區(qū)纖維束包括正常的紋狀體傳出途徑投射，其中發(fā)現(xiàn)部分可以重建神經(jīng)通路。一些研究也證明將人胚胎干細胞分化來的少突狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞，移植到動物體內(nèi)可以明顯改善其運動功能和促進髓鞘損傷部位的再生(Keirstead HS, Nistor G，Bernal G，et al. Humanembryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor eel!transplants remyelinate and restore locomotion after spinalcord injury. J Neurosci.，2005，25(19) :4694_4705· Nistor GIiTotoiu M0, Haque N，et al. Human embryonic stem eellsdifferentiate into oligodendrocytes in high purity andmyelinate after spinal cord transplantation. Glia.，2005，49 (3) 385-396. Utzschneider DA, Archer DR, Kocsis JD, etal. Transplantation of glial cells enhances action potentialconduction of amyelinated spinal cord axons in themyelin-deficient rat. Proc Natl Acad Sci，1994，91 (1) :53_57. Warrington AE, Barbarese E，Pfeiffer SE. Differentialmyelinogenic capacity of specific developmental stages of theoligodendrocyte 1ineage upon transplantation intohypomyelinating hosts. J Neurosci Res. ,1993,34(1) :1_13.)0
但是目前從ES定向分化獲得的NSC或者直接從動物體內(nèi)分離培養(yǎng)的NSC在體外培養(yǎng)時通常只能傳幾代，不能無限自我更新，難以為臨床應用提供更多的細胞。目前多使用轉(zhuǎn)基因的方法，建立NSC永生化細胞系。這類NSC能自我復制并在體外大量增殖，在移植入人體內(nèi)后仍具有多向分化潛能，但轉(zhuǎn)基因操作對這類細胞的臨床應用存在威脅，而且這類細胞還往往具有高致瘤性。以往認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。因此，提供無致瘤性、且能夠在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代的NSC，成為目前的當務

發(fā)明內(nèi)容
為此，申請人經(jīng)過深入研究，終于通過將ES細胞和誘導多能干細胞進行定向分化后，或者直接從動物腦組織中分離后進行體外培養(yǎng)，獲得了一類可以在體外長期傳代培養(yǎng)且的細胞，該細胞同時表達0ct4和Soxl。已知0ct4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，是植入前胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，是哺乳動物多能性細胞維持多能狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，是細胞多能性的標志。Sox家族的HMG-box轉(zhuǎn)錄因子在維持神經(jīng)干細胞多潛能能力方面扮演著重要的角色，Soxl是胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化過程中表達最早的神經(jīng)標志物，它只在神經(jīng)系統(tǒng)中表達，并且可以標識在神經(jīng)管內(nèi)增殖的神經(jīng)干細胞池。因此，Soxl較巢蛋白在鑒定神經(jīng)干細胞方面更具有特異性。Sox 家族的其他成員如Sox2和Sox3等在神經(jīng)前體細胞中也有表達。Soxl是神經(jīng)細胞最為早期的信號標記蛋白。該類細胞在僅為N2B27的基礎培養(yǎng)液內(nèi)不能長期維持生存。添加GSK/3 信號通路抑制劑CHIR99021可以維持0ct4的表達，CHIR99021的添加劑量在一定范圍內(nèi)與 0ct4的表達量正相關(guān)。CHIR99021還可以維持多種非神經(jīng)細胞的增殖和自我更新。本發(fā)明還添加一種ROCK信號通路抑制劑Y27632，主要維持細胞Soxl的表達，在一定范圍內(nèi)，Soxl 的表達量與Y27632的添加劑量正相關(guān)。由此確定所獲得的細胞是NSC (神經(jīng)干細胞)。通過經(jīng)實驗驗證本發(fā)明的這類NSC細胞可以在無血清無飼養(yǎng)層的化學培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，裸鼠體內(nèi)注射不存在致瘤性，臨床應用安全性好。而且該類NSC細胞可以在有血清的條件下只分化為各種神經(jīng)細胞。由此使為臨床應用提供大量的NSC成為可能，進而完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供了以下多個方面的內(nèi)容。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細胞，其特征在于同時表達標志蛋白0ct4和Soxl，并可在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代。另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細胞(neural stemcelLNSC)株，這類細胞主要的特征是1)同時表達特征蛋白0ct4和Soxl，其中0ct4是維持該類NSC在體外長期傳代和自我更新的關(guān)鍵基因，而Soxl的表達證明該類NSC仍是神經(jīng)干細胞；2)可以在無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)；3)可在體外長期傳代和擴增，細胞核型正常；4)能繼續(xù)分化為多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。本發(fā)明所述的神經(jīng)干細胞，還同時表達Sox2、Nestin和Pax6。
本發(fā)明所述神經(jīng)干細胞，其分離自哺乳動物的腦組織。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了獲得本發(fā)明的NSC細胞的方法，具體包括無菌條件下獲得從動物的胎兒腦組織(例如小鼠胎兒腦組織)，用胰酶消化分散后，用含添加 ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至有神經(jīng)球樣細胞懸浮，將懸浮細胞繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)，收集繼續(xù)存活的少數(shù)表達0ct4和Soxl的細胞，由此獲得本發(fā)明的NSC細胞。其中所述的動物的胎兒腦組織可以來自人、大鼠、小鼠、狗、兔、猴子等。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的神經(jīng)干細胞是通過定向分化哺乳動物胚胎干細胞或誘導多能干細胞獲得的。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的NSC可以通過對動物(例如小鼠和大鼠)的神經(jīng)細胞ES的定向分化獲得，所述的方法的特征是分化液為添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，將ES細胞先貼壁分化至表達Soxl 的細胞開始聚集懸浮成神經(jīng)球時，收集懸浮的神經(jīng)球，再Laminin上繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，通過貼壁-懸浮-再貼壁的方法完成NSC細胞富集。由于添加了 GSK/3信號通路抑制劑，這類細胞還低表達0ct4，可以在無血清無飼養(yǎng)層的化學限定性培養(yǎng)基內(nèi)長期培養(yǎng)。本發(fā)明所述的神經(jīng)干細胞，其在體內(nèi)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在本發(fā)明的又一個實施方案中，該類細胞在含血清的基礎培養(yǎng)液內(nèi)只分化為神經(jīng)細胞。添加不同的誘導分化因子，該類細胞也可分化為表達HB9的運動神經(jīng)元，表達TUJl、 TH的多巴胺神經(jīng)元和表達等標記物的膠質(zhì)細胞。在本發(fā)明的又一個實施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一類慢性、進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要包括帕金森氏癥、老年癡呆癥、腦中風、退行性心臟病等老年性疾病，且多發(fā)于高齡的人群，近些年來，隨著社會的老齡化程度加劇，神經(jīng)退行性疾病在所有疾病中占有越來越重要的地位。隨著神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率的逐年上升，此類疾病也受到了世界的許多專家和學者的關(guān)注，并成為醫(yī)學上的一大難題。在本發(fā)明的又一個實施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細胞在治療脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)中的用途，SCI是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的嚴重創(chuàng)傷，因其高致殘率和高病死率，SCI —直是世界性的醫(yī)學難題。傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)減壓、藥物與高壓氧等雖然可以有效減輕其繼發(fā)損害，但是無力解決SC I治療的核心問題——重建神經(jīng)元、軸突與突觸后聯(lián)系，恢復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。在SCI病人中，大多數(shù)為青壯年，此類損傷導致的勞動力喪失對病人、家庭和社會帶來了極大的痛苦和負擔。因此，對SC I病人進行積極救治，挽救肢體功能，盡可能恢復傷者的生活能力，甚至勞動能力，具有極其重要的經(jīng)濟價值和社會效益。目前SCI的綜合治療手段主要包括外科治療、藥物治療、物理治療、組織與細胞移植及功能重建五大方面。這些手段可以有效減輕SCI的繼發(fā)性損害，但難以恢復SCI的原發(fā)性損害所導致的中樞神經(jīng)傳導結(jié)構(gòu)與功能的缺失。NSC是治療SCI最理想的細胞移植材料，NSC 不僅可以存活和整合入宿主組織中，分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，填充因損傷造成的空洞，并且可以和宿主細胞之間形成突觸樣的結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)組織損傷區(qū)域的結(jié)構(gòu)得以重建，進而恢復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分功能。在本發(fā)明的又一個實施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細胞在發(fā)育生物學等基礎研究領域的用途。本發(fā)明通過添加ROCK信號通路抑制劑，使多能干細胞全部定向為NSC，該類 NSC不僅可在體外分化為多種神經(jīng)細胞，而且這類NSC細胞表達多能干細胞標記物0ct4，而且具有長期自我更新的潛能。本發(fā)明證明了該類細胞的存在。


圖1顯示為倒置顯微鏡下(10X5倍)神經(jīng)球干細胞照片。圖2顯示為激光共聚焦顯微鏡下熒光照片，其中紅色標記為Nestin表達一抗為鼠抗Soxl單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗(1 100)；綠色標記為0ct4 表達一抗為鼠抗0ct4單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗(1 100)；藍色為DAPI標記細胞核。圖3顯示為倒置顯微鏡下46c小鼠ES細胞經(jīng)6-8d分化形成懸浮的神經(jīng)球干細胞。圖4顯示為圖3的神經(jīng)球干細胞在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，因46c為Soxl-EGFP， 表明形成的神經(jīng)球干細胞表達Soxl基因。圖5顯示為分化得到的神經(jīng)元細胞免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 A標記為Tujl，其中一抗為鼠抗Tujl單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗 (1 100) ；B標記為DAPI ;C顯示為Merge圖。圖6顯示為分化得到的多巴胺神經(jīng)元TH染色熒光顯微鏡下結(jié)果。A標記為TH，其中一抗為兔抗TH單克隆抗體(1 100)，二抗為鼠抗兔熒光二抗(1 100) ；B標記為DAPI 染核；C顯示為Merge圖。圖7顯示為分化得到的運動神經(jīng)元HB9染色熒光顯微鏡下結(jié)果。A標記為HB9，其中一抗為山羊抗HB9單克隆抗體(1 100)，二抗為兔抗山羊熒光二抗(1 100) ；BDAPI染核；C顯示為Merge圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 原代小鼠神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)1)小鼠胎兒的獲取和腦組織的原代培養(yǎng)斷頸法處死懷孕5d以上的小鼠，在無菌條件下打開腹腔，取出子宮，并用含抗生素的PBS洗3次。將胎兒從子宮中取出，去除軀干，在顯微鏡下將腦組織小心剝離。將剝離的腦組織用0. 25%胰酶消化2min，用血清終止后，吹打數(shù)次，1000轉(zhuǎn)離心5min，倒掉上清， 用N2B27+CHIR99021(3mM)+Y27632(10nmol/L)培養(yǎng)液洗兩次后，再加入預熱的該培養(yǎng)液在 5% CO2、37°C的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2)小鼠神經(jīng)干細胞的傳代和純化上述原代細胞培養(yǎng)3天后可消化傳代，吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰酶消化液，控時消化2min，加入血清終止消化，1000轉(zhuǎn)離心5min。棄去上清液，加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液是條件性的選擇培養(yǎng)液(與原代培養(yǎng)液成分相同)，在多次傳代后，大部分細胞死亡，NSC以懸浮的形式存在并可長期傳代培養(yǎng)。3)細胞冷凍保存用0. 25%胰蛋白酶消化細胞大約2分鐘，用吸管將細胞懸液吸到15ml離心管內(nèi)， 再輕輕的吹打細胞，使其分散成小的細胞團塊，對干細胞而言，小的細胞團塊比單個的細胞較易冷凍存活，冷凍保存的細胞團塊應比消化傳代時的細胞團塊稍大一點點。1000轉(zhuǎn)離心 2分鐘。用凍存液重懸細胞，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的細胞可加入30%的血清替代物，DMSO的濃度仍為10%。DMSO在室溫時對細胞毒性較大，凍存液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配置凍存液時，培養(yǎng)液和血清都不需要預熱，按比例配好凍存液后，直接懸浮細胞，每凍存管加入Iml細胞懸液，可先放入4°C冰箱30min，然后放在凍存用泡沫盒內(nèi)，-70°C過夜。再放入液氮灌內(nèi)永久保存。實施例2 從胚胎干細胞定向神經(jīng)干細胞分化1)小鼠胚胎干細胞向NSC定向步驟將mES細胞(小鼠46C胚胎干細胞，由美國加州大學應其龍教授惠贈)用0. 25% 胰蛋白酶消化為單細胞懸液，加入血清終止離心后，用定向神經(jīng)分化培養(yǎng)液(與原代培養(yǎng)液成分相同)重懸。重懸的細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板前，應用50 μ g/ml濃度的Laminin包被培養(yǎng)板2個小時以上，以輔助細胞貼壁。細胞接種密度在每毫升1. OX IO4與1. OX IO5個細胞之間，細胞貼壁后呈單層貼壁生長，細胞之間有明顯界限，細胞太密，細胞增殖過快，會很快長滿培養(yǎng)皿，細胞密度過低，不利于細胞增殖。細胞培養(yǎng)3天后傳代，需傳至不鋪任何基質(zhì)膠的新培養(yǎng)板，以保證細胞可以同時聚集形成漂浮的神經(jīng)球。2)小鼠NSC的富集和鑒定ES細胞在神經(jīng)分化培養(yǎng)液內(nèi)貼壁分化5d后開始聚集懸浮，聚成圓形的神經(jīng)球(圖 1)，這類神經(jīng)球免疫熒光染色后表達Soxl和0ct4(圖2)，部分分化的雜細胞不能形成這種漂浮的神經(jīng)球。漂浮的神經(jīng)球繼續(xù)懸浮培養(yǎng)2d。2d后所有懸浮的神經(jīng)球都開始表達神經(jīng)干細胞標記物Soxl (圖3，圖4)積聚的神經(jīng)球轉(zhuǎn)入新鋪有Laminin的培養(yǎng)板中，漂浮的神經(jīng)球可以迅速貼壁，聚團的神經(jīng)細胞開始鋪展，通過先貼壁分化_懸浮培養(yǎng)_再貼壁分化完成對NSC的富集過程。通用熒光染色步驟待染色細胞先用PBS洗一遍，再用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌三次，每次lOmin。加入含0. 3% Triton和1 % BSA的PBS室溫孵育 40min, PBS洗三次，每次lOmin。加入一抗室溫60min，PBS洗三次，每次lOmin。加入二抗室溫避光45min，PBS洗三次，每次lOmin。加入DAPI，染核lOmin，PBS洗三次，每次lOmin。 以PBS 甘油(2 1)封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。實施例3 =NSC細胞裸鼠皮下注射成瘤實驗NSC細胞用胰酶消化，分散成單個細胞后重懸于0. 3ml的PBS中。細胞懸液注射于雄性Balb/c裸鼠腋下部皮下。2周后可以看到注射ES細胞對照組裸鼠腋下出現(xiàn)畸胎瘤。 瘤體30-50天后成熟。成熟畸胎瘤分離后固定于10%中性福爾馬林中，石蠟包埋進行常規(guī)組織學切片，HE染色，并進行顯微照相。而注射NSC細胞組未見成瘤。實施例4 =NSC向多種神經(jīng)細胞分化對NSC細胞繼續(xù)誘導為運動神經(jīng)元的方法為N2B27+RA (IuM)分化4d， N2B27+RA (IuM) +SHH (100ng/ml)分化 7d，N2B27+SHH (50ng/ml) + ⑶NF (10ng/ml) +BDNF (lOng/ ml)+IGF(10ng/ml)分化IOd左右誘導為成熟的表達HB9的運動神經(jīng)元細胞；誘導NSC繼續(xù)分化為多巴胺神經(jīng)元的方法為N2B27+SHH(100ng/ml) +FGF8 (lOOng/
9ml)分化 5d, SHH(100ng/ml)+FGF8 (100ng/ml)+bFGF (10ng/ml)分化 8-10d, N2B27+⑶NF(10ng/ml)+BDNF(10ng/ml)+IGF(10ng/ml)分化 IOd 左右。對分化得到的神經(jīng)元細胞進行免疫熒光染色后，熒光染色方法同上，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。多巴胺運動神經(jīng)元標記物Tujl和TH表達見圖5和圖6所示。運動神經(jīng)元標記物HB9表達見圖7。經(jīng)過上述各個實驗試驗，證明本發(fā)明成功地獲取了 NSC細胞，而且所提供的NSC細胞的免疫原性低，不存在動物源性血清和飼養(yǎng)層污染，而且可以在體外長期傳代，因此能為臨床細胞治療等應用提供大量安全有效的NSC，意義重大。而且該類細胞同時表達0ct4和 Soxl蛋白，具有長期的自我更新能力和穩(wěn)定的神經(jīng)干細胞特性，有利于研究干細胞的自我更新與分化機理。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細胞，其特征在于同時表達標志蛋白0ct4和Soxl，并可在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細胞，還同時表達S0X2、NeStin和Pax6。
3.一種分離、體外培養(yǎng)權(quán)利要求1的神經(jīng)干細胞的方法，其包括如下步驟無菌條件下獲得從動物的胎兒腦組織，用胰酶消化分散后，用含添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至有神經(jīng)球樣細胞懸浮，將懸浮細胞繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)，收集繼續(xù)存活的少數(shù)表達0ct4和Soxl的細胞，收獲所述細胞，即得到神經(jīng)干細胞。
4.一種分離、體外培養(yǎng)權(quán)利要求1的神經(jīng)干細胞的方法，其特征在于使用分化液為添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液對動物的神經(jīng)細胞ES 進行定向分化，包括步驟在所述分化液環(huán)境中將ES細胞貼壁分化，至表達Soxl的細胞開始聚集懸浮成神經(jīng)球時收集懸浮的神經(jīng)球，使之在Laminin上繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，通過貼壁、懸浮、再貼壁的方式進行細胞富集，收集富集得到的細胞，即得到神經(jīng)干細胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的神經(jīng)干細胞，其來自人、大鼠、小鼠、狗、兔或猴子。
6.權(quán)利要求3或4的方法，其中使用N2B27基礎培養(yǎng)液作為基礎細胞培養(yǎng)液，ROCK信號通路抑制劑是Y27632，GSK/3信號通路抑制劑是CHIR99021。
7.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病選自下述疾病中的一種帕金森氏癥、 老年癡呆癥、腦中風和退行性心臟病。
9.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細胞在制備治療脊髓損傷的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細胞在制備神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種神經(jīng)干細胞株(NSC)，該類NSC細胞株可以分離自不同種屬的動物腦組織，也可以由胚胎干細胞、誘導多能干細胞和其它干細胞分化而來。其特征在于這類NSC可在體外快速增殖并穩(wěn)定傳代；可持續(xù)表達標記蛋白Oct4和Sox1；可以高效分化為多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。本發(fā)明還提供有關(guān)NSC細胞的建系方法和用途。
文檔編號A61P9/00GK102191221SQ20101012610
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉韜, 吳孟超, 彭欣榮, 李琳芳, 錢其軍, 高海霞 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院