專利名稱：一種制備粉擬青霉素的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備粉擬青霉素的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
細(xì)菌感染一直是人類面臨的重大挑戰(zhàn)，近年來(lái)，革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌的感染頻率 越來(lái)越高。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是目前非常重要的5個(gè)致命耐藥菌 之一，不僅造成醫(yī)院大部分的感染，而且還對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性[參見(jiàn)，TheJournal of Infectious Diseases (傳染病雜志)。2008，197，1079]。此外，隨著臨床上高效廣譜抗生 素、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及AIDS、器官組織移植和化療等免疫受損 病人的逐漸增多，使得條件致病真菌感染日益嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅人類的健康。資料顯示，上述 人群中深部真菌感染發(fā)生率為11-40%，病死率為40% [參見(jiàn)，Molecular Immunology (分 子免疫學(xué))。2001，38，947]，僅美國(guó)在1997-2000年間真菌性敗血癥就增加了 207% [參見(jiàn)， The New England Journal of Medicine (新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志)。2003，348，1546]。目前， 臨床上廣泛用于治療白色念珠菌感染的藥物主要是多烯類兩性霉素B、廣譜三唑類藥物以 及棘白菌素類卡泊芬凈。兩性霉素B副作用較強(qiáng)，能引起高熱和腎毒性，所以限制了它的臨 床應(yīng)用；唑類藥物和棘白菌素類藥物雖然有較好的安全性，但持續(xù)使用會(huì)誘發(fā)耐藥菌株的 出現(xiàn)。同時(shí)，大量使用氟康唑后會(huì)造成較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其不良反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)10-16%。雖然人類與致病菌的戰(zhàn)斗一直沒(méi)有停止，但致病菌還是占了上風(fēng)。新藥研發(fā)周期 一般為10-12年，而致病菌2-3年即可產(chǎn)生耐藥性。在大量抗生素應(yīng)用于臨床治療的同時(shí)， 病原菌產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象也日益嚴(yán)重，但新抗生素上市的數(shù)目卻逐年減少[參見(jiàn)，Clinical Infectious Diseases (臨床傳染病雜志)。2006，42，657]。因此，尋求新型、安全、高效的 抗菌藥物迫在眉睫。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株粉擬青霉。本發(fā)明所提供的粉擬青霉為粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)6. 48，其保藏編 號(hào)為 CGMCC No. 3627。該菌株已于2010年02月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所， 郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3627，分類命名為粉擬青霉(Paecilomyces farinosus), 菌株名稱為6. 48。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備粉擬青霉素的方法。本發(fā)明所提供的制備粉擬青霉素的方法，包括如下步驟發(fā)酵粉擬青霉 (Paecilomyces farinosus)6. 48CGMCC No. 3627，得到含有粉擬青霉素的發(fā)酵液，從含有粉 擬青霉素的發(fā)酵液中提取純化得到粉擬青霉素；所述粉擬青霉素的化學(xué)式如式I所示 上述過(guò)程中，所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基由葡萄糖、可溶性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵 母提取物、CaC03和水組成；葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，可溶性淀粉在發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為30g/L，大豆粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，玉米粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為5g/L，酵母提取物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，CaC03在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3g/ L0上述過(guò)程中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6. 5。上述過(guò)程中，所述發(fā)酵的條件為溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，時(shí)間為30天，旋轉(zhuǎn) 半徑為12mm。上述過(guò)程中，在所述發(fā)酵后，包括如下提取步驟用不溶于水的且在25°C是液態(tài) 的有機(jī)溶劑對(duì)所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，取有機(jī)相；所述不溶于水的且在 25°C是液態(tài)的有機(jī)溶劑為氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯或乙酸乙酯。上述過(guò)程中，在所述提取后，包括用硅膠柱分離純化的步驟；所述用硅膠柱分離純 化包括如下洗脫步驟先用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比 為25 1)，再用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為20 1)， 再用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為15 1)，再用300ml 混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為10 1)，再用360ml混合溶液作 為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為5 1)，再用400ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn) 行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為3 1)，再用400ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石 油醚和丙酮的體積比為1 1)，收集用400ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙 酮的體積比為1 1)洗脫下來(lái)的溶液；和/或，所述用硅膠柱分離純化中，所用的填料為200-300目的硅膠；和/或，所述硅膠柱的大小為高30cm和直徑3cm ；和/或，每個(gè)所述硅膠柱中裝40g硅膠。上述過(guò)程中，在所述用硅膠柱分離純化后，包括用凝膠色譜柱分離純化的步驟；所 述用凝膠色譜柱分離純化包括如下洗脫步驟用50ml甲醇進(jìn)行第1次洗脫，用50ml甲醇進(jìn) 行第2次洗脫，收集第2次洗脫下來(lái)的溶液；和/或，所述用凝膠色譜柱分離純化中，所用的填料為葡聚糖凝膠S印hadex LH-20 ；和/或，所述凝膠色譜柱的大小為高50cm和直徑1. 5cm ；和/或，每個(gè)所述凝膠色譜柱中裝20g所述葡聚糖凝膠S印hadex LH-20。上述過(guò)程中，在所述用凝膠色譜柱分離純化后，包括高效液相色譜分離的步驟；所 述高效液相色譜分離中，填充介質(zhì)為C18鍵合硅膠，流動(dòng)相為甲醇和水的混合溶液，以甲醇 與水的體積比為85 15的混合溶液為起始液，以甲醇為終止液，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫 時(shí)間為25min，收集保留時(shí)間為14. 8min的洗脫峰。
上述過(guò)程中，所述用硅膠柱分離純化中，是將所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液或所 述有機(jī)相進(jìn)行分離純化；所述用凝膠色譜柱分離純化中，是將所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液、所述有機(jī)相 或所述用石油醚和丙酮的體積比為11的石油醚和丙酮混合溶液洗脫下來(lái)的溶液進(jìn)行分 離純化；所述高效液相色譜分離中，是將所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液、所述有機(jī)相、所述 用石油醚和丙酮的體積比為11的石油醚和丙酮混合溶液洗脫下來(lái)的溶液或所述第2次 洗脫下來(lái)的溶液進(jìn)行分離。式I所示化合物在制備具有抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)功能的產(chǎn) 品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在制備具有抑制大腸桿菌(Escherichia coli)功能的產(chǎn)品中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在制備具有抑制肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)功能 的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在制備具有抑制釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)功能的 產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在制備具有抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)功能 的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中，所述金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)；所述肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)為月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692)；所述大腸桿 菌(Escherichia coli)為大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)；所述白色念 珠球菌(Candida sporogenes)為白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)；所 述酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)。上述任一所述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物或者抑制劑。式I所示化合物在抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)中的應(yīng)用也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在抑制大腸桿菌(Escherichia coli)中的應(yīng)用；式I所示化合物 在抑制肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。式I所示化合物在抑制釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。和/或式I所示化合物在抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中不包括疾病的診斷和治療方法。上述任一所述應(yīng)用中，所述金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)；所述肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)為月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692)；所述大腸桿 菌(Escherichia coli)為大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)；所述白色念 珠球菌(Candida sporogenes)為白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)；所述酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)。 上述任一所述應(yīng)用中，所述式I所示化合物如下 本發(fā)明的菌株粉擬青霉(Paecilomyces farinosus) CGMCC No. 3627具有產(chǎn)生粉擬 青霉素的功能。本發(fā)明制備粉擬青霉素的方法，產(chǎn)率高，產(chǎn)率可達(dá)10mg/g菌體，其中純化方 法的提取率高，提取率可達(dá)1%，由本發(fā)明方法制備得到的粉擬青霉素的純度可達(dá)99%，而 且本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、省時(shí)省力。本發(fā)明中，粉擬青霉素具有廣譜抗細(xì)菌和抗真菌活性，具體的說(shuō)具有抑制金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、 大腸桿菌(Escherichia coli)、白色念珠球菌(Candida sporogenes)及釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的功能，這在現(xiàn)有技術(shù)中是未曾發(fā)現(xiàn)的，并且粉擬青霉素對(duì)白 色念珠球菌(C. sporogenes CMCC 98001)的抑制活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照兩性霉素B，對(duì)大腸桿 菌(E.coliCGMCC 1.2340)的抑制作用與慶大霉素相當(dāng)。由此可知，可將粉擬青霉素進(jìn)一 步用于治療上述菌引起的一系列疾病，也可將粉擬青霉素用于制備具有廣譜抗菌活性的藥 物。綜上所述，本發(fā)明菌株、粉擬青霉素的制備方法及粉擬青霉素的新用途在粉擬青 霉素的制備與應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
圖1為粉擬青霉素的制備高效液相圖。圖2為純化后的粉擬青霉素的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、菌株的分離及鑒定一、菌株的分離分離方法取北京東靈山的土壤樣品，土壤樣品過(guò)2mm篩，去除石塊及植物組織， 混合均勻后裝入事先滅菌的50ml離心管(如必要，先用無(wú)菌水濕潤(rùn))，高度距頂部約1cm。 每土樣裝3支離心管。誘集使用3-4齡大蠟螟幼蟲(28°C條件下，孵化后培養(yǎng)約30d)。每離心管中放入 5頭幼蟲，蓋上離心管蓋，室溫下黑暗培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)的前4d，每天顛倒并搖動(dòng)離心管，以促使大 蠟螟幼蟲在土壤中充分活動(dòng)。處理9 14d后檢查大蠟螟被侵染情況。僵死的大蠟螟幼蟲用3%次氯酸鈉溶液(有效氯)表面消毒3min，然后用無(wú)菌水沖洗2次后，置于加有抗生素 (鏈霉素，0. lg/L;四環(huán)素，0.05g/L)的PDA平板上，置室溫下黑暗培養(yǎng)。形成菌落后進(jìn)行分 離純化，相同離心管中分離得到的同種昆蟲相關(guān)菌物認(rèn)為是同一菌株。最后分離得到一株侵染大蠟螟幼蟲效果好的菌株，將該菌株命名為6. 48。二、菌株的鑒定(一 )形態(tài)方法將菌株接種到PDA平板上，25°C條件下黑暗培養(yǎng)7d,測(cè)量菌落直徑并記錄菌 落顏色。從平板上切下5mm的方形帶菌培養(yǎng)基塊，置于滅菌載玻片上，加蓋玻片，在50ml離 心管或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周，取下蓋玻片制普通玻片進(jìn)行觀察。結(jié)果PDA培養(yǎng)基上菌落白色，25°C黑暗條件下14d菌落直徑40_45mm，質(zhì)地絮狀， 隆起，稀疏；背面黃色。未見(jiàn)分生孢子梗束。菌絲多分隔，1. 5-2. 0 ii m寬；分生孢子梗產(chǎn)生于氣生菌絲上，短，11. 0-57. 7 u m， 寬1. 7-2. 5 u m ；瓶梗披針形或細(xì)燒瓶狀，多數(shù)2-5個(gè)簇生于分生孢子梗其分枝上，也可單生 于菌絲上，長(zhǎng)6-10 ii m，寬1. 5-2. 3um ；分生孢子橢圓形，無(wú)色，2. 0-3. 4X1. 4-1. 9 y m。(二)rDNA-ITS 序列方法真菌總DNA提取步驟平板培養(yǎng)5d菌落用解剖刀刮取菌絲，置1. 5ml離心管 中，加200iil CTAB提取緩沖液、少量石英砂，用玻棒研磨，然后再加入400 ill CTAB，65°C水 浴lh，12000rpm離心lOmin，取上清，飽和酚和氯仿異戊醇分別抽提，最后用無(wú)水乙醇沉淀， 12000rpm離心，倒出乙醇溶液，晾干。最后，復(fù)溶于50 yl純水備用。PCR 擴(kuò)增通用引物ITS5 :5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，ITS4 :5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’擴(kuò)增體系(25ill 體系)純水15 ill ；Buffer 2. 5u 1 ；Mg 2+ 1. 5u 1 ； dNTP 1 P 1 ；引物各 1 P 1 ；DNA 聚合酶2 u 1 (2U)；模板1擴(kuò)增程序3minat 95°C, lmin at 94°C，40s at 54°C, lmin at 72°C, after 30cycles,then hold at 72°C for lOmin。儀器050-801TGradient96 型 PCR 儀擴(kuò)增產(chǎn)物的純化申能博彩生物科技有限公司3S PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒。測(cè)序北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序儀ABI 3730x1型測(cè)序儀。測(cè)序引物ITS4。結(jié)果得到的序列如序列表中序列1所示，包括18S rRNA片段，ITS1、5. 8S rRNA、 ITS2的全序列及28S區(qū)序列片斷。證明本發(fā)明菌株屬于擬青霉屬粉擬青霉(Paecilomyces farinosus (Holmsk.) A. H. S. Br. &G. Sm.)。該菌株6. 48已于2010年02月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3627，分類命名為粉擬青霉 (Paecilomycesfarinosus)0實(shí)施例2 化合物粉擬青霉素的制備一、菌發(fā)酵
1、菌活化挑取粉擬青霉Paecilomyces farinosus CGMCC No. 3627菌絲體接種于PDA平板 上，25°C培養(yǎng)5d ；PDA培養(yǎng)基的組成由馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g和蒸餾水1L組成，121°C 高壓蒸汽滅菌30min，制成PDA平板。2、種子培養(yǎng)方法待菌長(zhǎng)滿平板后，將5個(gè)1cm2大小的菌塊連同培養(yǎng)基接種到含有50mL種子 培養(yǎng)基的250mL三角瓶中并在搖床上培養(yǎng)5d(培養(yǎng)溫度25°C ；轉(zhuǎn)速200rpm)后作為種子 培養(yǎng)液。得到的種子培養(yǎng)液中孢子的濃度為106個(gè)/mL。種子培養(yǎng)基的配方葡萄糖4g、麥芽提取物10g、酵母提取物4g、蒸餾水1L，滅菌前 將pH調(diào)節(jié)到6. 5。每個(gè)250mL三角瓶中加入50mL培養(yǎng)基并在121°C滅菌30min。麥芽提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。3、發(fā)酵將5mL種子培養(yǎng)液接種于1. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn) 速為150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑為12mm)，得到發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成由葡萄糖、可溶性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵母提取物、&0)3和 水組成，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，可溶性淀粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30g/ L，大豆粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，玉米粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，酵母提 取物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，CaC03在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3g/L。調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng) 基的pH值至6. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻待用。可溶性淀粉購(gòu)自北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司；大豆粉購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 院；玉米粉購(gòu)自超市；酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；二、從發(fā)酵液中提取粉擬青霉素1、粗提將乙酸乙酯加入步驟一得到的發(fā)酵液中，乙酸乙酯和發(fā)酵液的體積比為1 1;混 勻，靜置，分別取有機(jī)相和殘?jiān)瑢⒂袡C(jī)相記作粗提液I，將殘?jiān)涀鳉堅(jiān)麵 ；將乙酸乙酯加入到殘?jiān)麵中，乙酸乙酯和殘?jiān)麵的體積比為1 1 ；混勻，靜置，分 別取有機(jī)相和殘?jiān)瑢⒂袡C(jī)相記作粗提液II，將殘?jiān)涀鳉堅(jiān)麵I ；將乙酸乙酯加入到殘?jiān)麵I中，乙酸乙酯和殘?jiān)麵I的體積比為1 1 ；混勻，靜置， 分別取有機(jī)相和殘?jiān)?，將有機(jī)相記作粗提液III，將殘?jiān)涀鳉堅(jiān)麵II ；合并粗提液I、粗提液II和粗提液III，記作粉擬青霉素粗提液。將粉擬青霉素粗提液減壓蒸餾至干燥，得到0. 6g粉擬青霉素粗提物；2、用硅膠柱進(jìn)行分離純化硅膠柱(30cmX直徑3cm)購(gòu)自北京玻璃集團(tuán)公司；所用的硅膠為200-300目柱層 析硅膠，購(gòu)自青島海洋化工有限公司。每個(gè)柱子中裝40g硅膠。將粉擬青霉素粗提物用石油醚和丙酮的混合溶液依次進(jìn)行如下硅膠柱層析裝 柱、壓實(shí)、上樣后進(jìn)行如下洗脫步驟先用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚 和丙酮的體積比為25 1)，再用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的
10體積比為20 1)，再用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為 15 1)，再用300ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為10 1)，再 用360ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為5 1)，再用400ml混 合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為3 1)，再用400ml混合溶液作為 流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為1 1)，收集用400ml混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn) 行洗脫(石油醚和丙酮的體積比為1 1)洗脫下來(lái)的溶液，記作活性洗脫液，將活性洗脫 液減壓蒸餾至干燥，共得到170mg固形物。3、用凝膠色譜柱S印hadex LH-20進(jìn)行分離純化凝膠色譜柱(50cmX直徑1. 5cm)購(gòu)自北京玻璃集團(tuán)公司；凝膠填料為葡聚糖凝膠 S印hadex LH-20。每個(gè)凝膠色譜柱中裝20g葡聚糖凝膠S印hadex LH-20。將活性洗脫液通過(guò)凝膠色譜S印hadex LH-20分離，裝柱、上樣后進(jìn)行如下洗脫步 驟流動(dòng)相是甲醇，用50ml甲醇進(jìn)行第1次洗脫，用50ml甲醇進(jìn)行第2次洗脫，收集第2次 洗脫下來(lái)的溶液，減壓蒸餾至干燥，共得到lOOmg固形物。4、HPLC 檢測(cè)Agilent 1100型半制備高壓液相色譜儀，色譜柱為Agilent C18反相半制備色譜柱(10 y m ;10X250mm)，填充介質(zhì)為C18鍵 合硅膠，粒徑5um;柱溫25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量20ul ；流動(dòng)相的組成為流動(dòng)相為甲醇和水的混合溶液；流速為2. Oml/min ；以甲醇與水 的體積比為85 15的混合溶液為起始液，以甲醇為終止液，進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫 時(shí)間為25min ；檢測(cè)器為多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；收集保留時(shí)間為14. 8min的洗脫峰，得到粉擬青霉素，并記錄峰面積值。結(jié)果如圖1所示，得到6. Omg化合物粉擬青霉素。5、將步驟4得到的6. Omg化合物粉擬青霉素進(jìn)行HPLC檢測(cè)方法Agilent 1100型半制備高壓液相色譜儀；色譜柱為Kromasil C18反相分析色譜柱(5 y m ； 150X4. 6mm)，填充介質(zhì)為C18鍵 合硅膠，粒徑5um;柱溫25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量5ul ；流動(dòng)相的組成為流動(dòng)相為甲醇和水的混合溶液；流速為1. Oml/min ；梯度洗脫步驟如下時(shí)間(min)甲醇(％ )水(％ )0208022080181000251000結(jié)論結(jié)果如圖2所示。表明本發(fā)明中的活性化合物粉擬青霉素純度高，可達(dá) 99%。三、粉擬青霉素的確認(rèn)
將上述方法制備的粉擬青霉素進(jìn)行紅外光譜和核磁共振譜分析。紅外光譜實(shí)驗(yàn)中測(cè)試儀器型號(hào)為Nicolet Magna-IR 750 ；核磁共振譜實(shí)驗(yàn)方法中測(cè)試儀器型號(hào)為Varian Mercury-500。本發(fā)明制備的粉擬青霉素的物化常數(shù)、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)分別見(jiàn)表1和2。表1.化合物粉擬青霉素的物化常數(shù) 制備得到的粉擬青霉素的化學(xué)式如式I所示。 與文獻(xiàn)“Journalof Natural Products (天然產(chǎn)物雜志).2005，68，810-811 ” 中 所報(bào)道的數(shù)據(jù)相比，證實(shí)得到的產(chǎn)物是粉擬青霉素。綜上，0.6g粗提物經(jīng)過(guò)分離純化而得到6. Omg純化合物粉擬青霉素，其純度為 99%，收率為1%，產(chǎn)率為10mg/g菌體。實(shí)施例3、粉擬青霉素的抑菌活性檢測(cè)采用Alamar Blue熒光檢測(cè)法檢測(cè)粉擬青霉素對(duì)于金黃色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、大腸 桿菌(Escherichia coli)、白色念珠球菌(Candida sporogenes)和釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的抑制活性。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具體為金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus CMCC 26003)購(gòu)自 CMCC 或 CGMCC ；肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)具體為肺炎鏈球菌 (Streptococcuspneumoniae CGMCC No. 1. 1692)購(gòu)自 CGMCC ；大腸桿菌(Escherichiacoli)具體為大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)購(gòu)自 CGMCC ；白色念珠球菌(Candida sporogenes)具體為白色念珠球菌(Candida sporogenesCMCC 98001)購(gòu)自 CMCC 或 CGMCC ；
II M # # (Saccharomyces cerevisiae) ^ # ^J II M # # (Saccharomyces cerevisiaeATCC 18824)購(gòu)自 ATCC 或 CGMCC。1.試驗(yàn)用試劑將本發(fā)明制備的粉擬青霉素用二甲亞砜(DMS0)作為溶劑分別配制成濃度為4、2、 1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005及0. 002mg/mL的待測(cè)溶液；將陽(yáng)性對(duì)照物氨芐青 霉素、慶大霉素和兩性霉素B(購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)用DMS0分別配制成濃 度為4mg/mL的溶液；2.金黃色葡萄球菌(S. aureus)、肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、大腸桿菌 (E. coli)、白色念珠球菌(C. sporogenes)和釀酒酵母(S. cerevisiae)的培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus CMCC 26003)、肺炎鏈球 菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692) > 大腸桿菌(Escherichia coli CGMCCNo. 1. 2340)分別接種在PDB培養(yǎng)基(淀粉40g/L，葡萄糖20g/L)上，在37°C搖床培養(yǎng) Id后并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)液中菌濃度為105個(gè)/mL。將白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)禾P釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae ATCC 18824)分別接種在 PDB 培養(yǎng)基(淀粉 40g/L，葡萄糖 20g/L)上，在28°C搖床培養(yǎng)2d后并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)液中菌濃度為105個(gè)/mL。3.試驗(yàn)方法試驗(yàn)條件如表3，表4和表5所示。表3.活性測(cè)試所需體積 按表3所示方法，取190 iiL PDB培養(yǎng)基和10 iiL Alamar Blue染液加到96孔板中 配成陰性對(duì)照組；取190 P L金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌培養(yǎng)液和10 y L Alamar Blue染 液加到96孔板中配成空白對(duì)照組；取190 y L金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌培養(yǎng)液、10 y L Alamar Blue染液和1 y L 4mg/mL的氨芐青霉素加到96孔板中配成陽(yáng)性對(duì)照組；取1 P L 本發(fā)明制備的粉擬青霉素溶液(濃度分別為4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005 及0.002mg/mL)分別加到96孔板中，再分別加入190 y L金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌培 養(yǎng)液，10iiL Alamar Blue染液，使粉擬青霉素在孔中的最終濃度分別為20、10、5、2. 5、1. 0、 0. 5,0. 25,0. 1,0. 05,0. 025和0. 01 u g/mL。待藥液和菌懸液混和均勻，在37°C及黑暗條件
16下培養(yǎng)24h。表4.活性測(cè)試所需體積 按表4所示方法，取190 u L PDB培養(yǎng)基和10 u L Alamar Blue染液加到96孔板 中配成陰性對(duì)照組；取190 u L大腸桿菌培養(yǎng)液和10 ii L Alamar Blue染液加到96孔板中 配成空白對(duì)照組；取190 u L大腸桿菌培養(yǎng)液、10 u L Alamar Blue染液和1 y L 4mg/mL的 慶大霉素加到96孔板中配成陽(yáng)性對(duì)照組；取1 P L本發(fā)明制備的粉擬青霉素溶液(濃度分 別為 4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005 及 0. 002mg/mL)分別加到 96 孔板中，再 分別加入190 u L大腸桿菌培養(yǎng)液，10 uL Alamar Blue染液，使粉擬青霉素在孔中的最終濃 度分別為 20、10、5、2. 5、1. 0、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05、0. 025 和 0. 01 ii g/mL。待藥液和菌懸液混 和均勻，在37°C及黑暗條件下培養(yǎng)24h。表5.活性測(cè)試所需體積 按表5所示方法，取190 ii L PDB培養(yǎng)基和10 u LAlamar Blue染液加到96孔板中 配成陰性對(duì)照組；取190 u L白色念珠球菌或釀酒酵母培養(yǎng)液和10 ii L Alamar Blue染液 加到96孔板中配成空白對(duì)照組；取190 u L白色念珠球菌或釀酒酵母培養(yǎng)液，10 u LAlamar Blue染液和liiL 4mg/mL的兩性霉素B加到96孔板中配成陽(yáng)性對(duì)照組；取liiL本發(fā) 明制備的粉擬青霉素溶液(濃度分別為4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005及0. 002mg/mL)分別加到96孔板中，再分別加入190 u L白色念珠球菌或釀酒酵母培養(yǎng)液， 10 uL Alamar Blue染液，使粉擬青霉素在孔中的最終濃度分別為20、10、5、2. 5,1. 0,0. 5、 0. 25,0. 1,0. 05,0. 025和0. 01 u g/mL。待藥液和菌懸液混和均勻，在28°C及黑暗條件下培 養(yǎng) 48h。用酶標(biāo)儀(Tecan公司的GENios Plus)在590nm下測(cè)試96孔板中每個(gè)測(cè)試孔的 熒光吸收值(0D值)。計(jì)算抑制率1%= [1_(0D測(cè)試賺-0D空白對(duì)照)/(0D陰性對(duì)照-0D空白對(duì)照)]X100%計(jì)算IC50 值IC50 = [CL (Ih-50) +Ch (50-Il) ] / (IH_IL)CL 最低濃度值；CH 最高濃度值；IH 最高濃度下的最低濃度下的1%。4.試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明制備的粉擬青霉素具有顯著的廣譜抗細(xì)菌和抗真菌活性(如表6所示)，其 中粉擬青霉素對(duì)白色念珠球菌(C. sporogenes CMCC 98001)的抑制活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照兩性 霉素B的抑制活性，對(duì)大腸桿菌(E.coli CGMCC 1.2340)的抑制作用與慶大霉素的抑制活 性相當(dāng)。表6.粉擬青霉素的抗菌活性
權(quán)利要求
粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)6.48，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3627。
2.一種制備粉擬青霉素的方法，包括如下步驟發(fā)酵粉擬青霉(Paecilomycesfarino sus)6. 48CGMCC No. 3627，得到含有粉擬青霉素的發(fā)酵液，從所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液 中提取純化得到粉擬青霉素；所述粉擬青霉素的化學(xué)式如式I所示
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基由葡萄糖、可溶 性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵母提取物、CaCOjP水組成；葡萄糖在培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，可 溶性淀粉在培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，大豆粉在培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，玉米粉在培養(yǎng)基 中的濃度為5g/L，酵母提取物在培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，CaCO3在培養(yǎng)基中的濃度為3g/L ； 所述培養(yǎng)基的PH值為6.5;和/或，所述發(fā)酵的條件為溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為12mm，時(shí)間為30天，。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵后，包括如 下提取步驟用不溶于水的且在25°C是液態(tài)的有機(jī)溶劑對(duì)所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液 進(jìn)行萃取，取有機(jī)相；所述不溶于水的且在25°C是液態(tài)的有機(jī)溶劑為氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯或乙酸乙酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述提取后，包括 用硅膠柱分離純化的步驟；所述用硅膠柱分離純化包括如下洗脫步驟先用300ml石油醚 體積丙酮體積為25 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，再用300ml 石油醚體積丙酮體積為20 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，再用 300ml石油醚體積丙酮體積為15 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫， 再用300ml石油醚體積丙酮體積為10 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行 洗脫，再用360ml石油醚體積丙酮體積為5 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流動(dòng)相 進(jìn)行洗脫，再用400ml石油醚體積丙酮體積為3 1的石油醚和丙酮的混合溶液作為流 動(dòng)相進(jìn)行洗脫，再用400ml石油醚體積丙酮體積為1 1的石油醚和丙酮的混合溶液作 為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集所述用400ml石油醚體積丙酮體積為1 1的石油醚和丙酮的 混合溶液作為流動(dòng)相洗脫下來(lái)的溶液；和/或，所述用硅膠柱分離純化中，所用的填料為200-300目的硅膠；和/或，所述硅膠柱的大小為高30cm和直徑3cm ；和/或，每個(gè)所述硅膠柱中裝40g硅膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用硅膠柱分 離純化后，包括用凝膠色譜柱分離純化的步驟；所述用凝膠色譜柱分離純化包括如下洗脫步驟用50ml甲醇進(jìn)行第1次洗脫，用50ml甲醇進(jìn)行第2次洗脫，收集第2次洗脫下來(lái)的 溶液；和/或，所述用凝膠色譜柱分離純化中，所用的填料為葡聚糖凝膠S印hadex LH-20 ；和/或，所述凝膠色譜柱的大小為高50cm和直徑1. 5cm ；和/或，每個(gè)所述凝膠色譜柱中裝20g所述葡聚糖凝膠S印hadex LH-20。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用凝膠色譜 柱分離純化后，包括高效液相色譜分離的步驟；所述高效液相色譜分離中，填充介質(zhì)為C18 鍵合硅膠，流動(dòng)相為甲醇和水的混合溶液，以甲醇與水的體積比為85 15的混合溶液為 起始液，以甲醇為終止液，進(jìn)行線性梯度洗脫，線性梯度洗脫時(shí)間為25min，收集保留時(shí)間為 14. 8min的洗脫峰。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述用硅膠柱分離純化中，是將 所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液或所述有機(jī)相進(jìn)行分離純化；所述用凝膠色譜柱分離純化中，是將所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液、所述有機(jī)相或所 述用石油醚體積丙酮體積為11的石油醚和丙酮的混合溶液洗脫下來(lái)的溶液進(jìn)行分離 純化；所述高效液相色譜分離中，是將所述含有粉擬青霉素的發(fā)酵液、所述有機(jī)相、所述用石 油醚體積丙酮體積為11的石油醚和丙酮的混合溶液洗脫下來(lái)的溶液或所述第2次洗 脫下來(lái)的溶液進(jìn)行分離。
9.式I所示化合物在制備具有抑制白色念珠球菌(Candidasporogenes)功能的產(chǎn)品 中的應(yīng)用；式I所示化合物在制備具有抑制大腸桿菌(Escherichia coli)功能的產(chǎn)品中的 應(yīng)用；式I所示化合物在制備具有抑制肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)功能的產(chǎn) 品中的應(yīng)用；式I所示化合物在制備具有抑制釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)功能 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；和/或式I所示化合物在制備具有抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用；式I所示化合物在抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)中的應(yīng)用；式I所 示化合物在抑制大腸桿菌(Escherichia coli)中的應(yīng)用；式I所示化合物在抑制肺 炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中的應(yīng)用；式I所示化合物在抑制釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中的應(yīng)用；和/或式I所示化合物在抑制金黃色葡萄球菌 (Stapylococcusaureus)中的應(yīng)用；所述應(yīng)用中不包括疾病的診斷或治療方法；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)，所 $月市H連5求 (Streptococcus pneumoniae)為月市 連王求 (Streptococcuspneumoniae CGMCC 1. 1692)，所述大腸桿菌(Escherichia coli)為大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC 1. 2340)，所述白色念珠球菌(Candida sporogenes)為白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001),(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomycescerevisiae ATCC18824)；和/或，所述產(chǎn)品為藥物或者抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備粉擬青霉素的方法及其專用菌株。該菌株為粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)6.48，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3627。本發(fā)明的菌株粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)6.48 CGMCC No.3627具有產(chǎn)生粉擬青霉素的功能。本發(fā)明制備粉擬青霉素的方法，產(chǎn)率高，產(chǎn)率可達(dá)10mg/g菌體，其中純化方法的提取率高，提取率可達(dá)1％，由本發(fā)明方法制備得到的粉擬青霉素的純度可達(dá)99％，而且本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、省時(shí)省力。本發(fā)明還提供了粉擬青霉素在制備抗細(xì)菌和抗真菌活性的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P31/10GK101864367SQ20101012506
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者劉杏忠, 劉述春, 孫炳達(dá), 車永勝, 鄒先偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所