两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

Lcmv-gp-vsv假型載體和腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于腫瘤的治療的制作方法

文檔序號(hào):1179439閱讀:1305來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):Lcmv-gp-vsv假型載體和腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于腫瘤的治療的制作方法
lcmv-gp-vsv假型載體和腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于
腫瘤的治療 本發(fā)明涉及衍生自水泡性口炎病毒(VSV)的重組病毒和病毒載體其包含編碼淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因,涉及產(chǎn)生GP-LCMV-假型化VSV病毒粒子的包裝細(xì)胞,并涉及所述病毒粒子和包裝細(xì)胞用于制備用于治療實(shí)體腫瘤的藥物組合物的用途。
背景技術(shù)
惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(原生顱內(nèi)腦瘤的最大的組)代表至今未解決的治療問(wèn)題。雖然通過(guò)高強(qiáng)度的基礎(chǔ)研究,對(duì)此類(lèi)腫瘤的生物學(xué)的理解已增長(zhǎng),臨床過(guò)程和預(yù)后仍然很差。惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)上皮起源的腫瘤并且在細(xì)胞學(xué)上被劃分為室管膜瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、寡星狀細(xì)胞瘤、星狀細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。彌漫浸潤(rùn)性星狀細(xì)胞瘤(WHO級(jí)別II-IV)具有超過(guò)60%的比例,組成了顱內(nèi)腫瘤的最大的組。于2001年修訂的WHO分類(lèi)被最廣泛地作為星狀細(xì)胞瘤的分級(jí)方案。根據(jù)WHO,介由組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將腦瘤分為4種惡性級(jí)別(Kleihues和Cavenee,2000)。彌漫浸潤(rùn)性星狀細(xì)胞瘤的預(yù)后通常不良。預(yù)后一方面取決于惡性級(jí)別,另一方面取決于腫瘤的位置和治療方法。對(duì)于具有星狀細(xì)胞瘤WHO級(jí)別II 的患者,平均存活時(shí)間多于5年;對(duì)于具有星狀細(xì)胞瘤WHO級(jí)別III的患者,平均存活時(shí)間為2-5年;而對(duì)于具有WHO級(jí)別IV的星狀細(xì)胞瘤-膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(=膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的患者,平均存活時(shí)間少于1年。腫瘤的分子學(xué)發(fā)病機(jī)理是復(fù)雜的過(guò)程并且是由于負(fù)責(zé)控制細(xì)胞周期的不同基因的突變而產(chǎn)生的。腫瘤抑制因子基因P53中的突變是人類(lèi)腫瘤中最常發(fā)現(xiàn)的改變并且既負(fù)責(zé)低級(jí)別星狀細(xì)胞瘤的出現(xiàn)也負(fù)責(zé)向繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展。原發(fā)出現(xiàn)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤反而很罕見(jiàn)地具有P53突變。另一個(gè)指示彌散性星狀細(xì)胞瘤的惡性趨勢(shì)的基因被懷疑在染色體19的長(zhǎng)臂上。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的情形中其他經(jīng)常被改變的基因是致癌基因MDM2 和MDM4以及腫瘤抑制因子基因P14ARF,在細(xì)胞周期的p53依賴(lài)性控制中涉及它們(Dai和 Holland, 2001)。在30-40%的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到了 EGF受體基因的擴(kuò)增,因此其是此腫瘤組中最常被擴(kuò)增的致癌基因(Holland,2001)。大多數(shù)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)化學(xué)或放射療法的響應(yīng)不良。其原因被懷疑是細(xì)胞周期相關(guān)基因的突變,所述基因也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。因?yàn)閺默F(xiàn)存的治療方法(例如化學(xué)或放射療法)不再期待疾病預(yù)后的顯著改善, 亟需用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的更有效的治療方法。而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療提供了有希望的可能性,所述可能性需被開(kāi)發(fā)。為此目的,已開(kāi)發(fā)了多個(gè)不同的、非常有效的基因。對(duì)于其中的大多數(shù),也存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(Shir和LeVitzki,2001)。這些治療性基因可被劃分為四種不同的作用原理(i)所謂自殺基因的基因產(chǎn)物將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性分子。實(shí)例是單純皰疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK),與更昔洛韋的給藥相結(jié)合。特別的優(yōu)勢(shì)是有毒的更昔洛韋三磷酸鹽擴(kuò)散到臨近的細(xì)胞中,從而產(chǎn)生“旁觀者(bystander)”效應(yīng)。近年來(lái),此酶的所述活性被進(jìn)一步提高了。目前HSV TK是清除腫瘤細(xì)胞以及植入的載體產(chǎn)生細(xì)胞的很有效的可能性。(ii)免疫刺激性細(xì)胞因子(例如IL-4)在腫瘤中的表達(dá)可刺激抗腫瘤細(xì)胞的天然防御。(iii)抗血管生成蛋白(例如內(nèi)皮他丁)的分泌引起血管的缺少,并因此引起代謝上非?;钴S的腫瘤組織中營(yíng)養(yǎng)供給的缺少。腫瘤實(shí)際上在經(jīng)受饑餓。 (iv)最后,描述了一系列基因,其參與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制所述細(xì)胞的不受控生長(zhǎng)。然而,這些基因在臨床中的應(yīng)用可能性是受限的,因?yàn)檫@些基因僅在經(jīng)基因修飾的細(xì)胞自身中起作用,而不產(chǎn)生如所述第一個(gè)作用原理的“旁觀者”效應(yīng)。這意味著為了實(shí)現(xiàn)治療效果,實(shí)際上所有的惡性細(xì)胞均需經(jīng)過(guò)遺傳修飾,而即使使用理想的載體系統(tǒng),這也是沒(méi)有希望的。多個(gè)現(xiàn)存的、非常有效的作用原理產(chǎn)生了對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的成功的基因治療而言最重要的前提條件。然而,至此仍未解決的問(wèn)題是至今低效的基因轉(zhuǎn)移和治療性基因在靶細(xì)胞中的不良表達(dá)。這也是為什么盡管有許多有效的治療性基因,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療仍在臨床中失敗。病毒的基因轉(zhuǎn)移相比于物理化學(xué)轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)勢(shì)是更高的基因轉(zhuǎn)移率和基因的更長(zhǎng)期表達(dá),因?yàn)椴《景l(fā)展了特別有效的機(jī)制來(lái)將其基因組引入細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。作為溶瘤病毒(0V),目前特別使用的是能夠復(fù)制的病毒,例如單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒 (Ad)、新城疫病毒(NDV)、呼腸病毒和水泡性口炎病毒(VSV)。對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的最佳病毒治療而言,OV應(yīng)具有下列特征(i)它們應(yīng)該具有腫瘤特異性趨向性,從而使病毒復(fù)制和細(xì)胞裂解保持受限于腫瘤組織。此特性可通過(guò)修飾病毒包膜或通過(guò)使用腫瘤特異性啟動(dòng)子而被增強(qiáng)。由于人們假設(shè),僅有小部分神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在治療過(guò)程中分裂,既感染靜止細(xì)胞又感染增殖細(xì)胞的病毒是有利的。(ii)出于安全相關(guān)的考慮,具有高遺傳穩(wěn)定性和在腫瘤組織外的低毒性的病毒特別適合于臨床應(yīng)用。這允許高病毒滴度和在GMP條件下純化載體。理想地,所述OV對(duì)于人類(lèi)應(yīng)該是非致病性的并且在人群中應(yīng)該具有低的傳染率。已經(jīng)存在的免疫性將引起病毒的過(guò)早中和并因此將阻礙有效的治療。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中,溶瘤病毒的突出實(shí)例是減毒的HSV變體G207和1716 以及腺病毒0NYX-015。對(duì)于將溶瘤性的HSV用于治療CNS腫瘤的嚴(yán)重異議是其在正常腦細(xì)胞中的高水平復(fù)制,這從而可引起威脅生命的腦炎。此外,除了潛在的持續(xù)性外,存在潛伏的HSV再活化的可能性。通過(guò)缺失多個(gè)基因產(chǎn)生了 HSV變體1716,其選擇性地在快速增殖的CNS細(xì)胞中、而不在有絲分裂期后的神經(jīng)元中復(fù)制。由此,可顯著減少HSV的神經(jīng)毒性。在大鼠和小鼠中用HSV1716治療實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤引起腫瘤細(xì)胞的選擇性破壞而周?chē)哪X組織保持為未損傷的。0NYX-015是另外的被開(kāi)發(fā)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的溶瘤病毒。 通過(guò)在ElB基因中的缺失,此腺病毒會(huì)選擇性地裂解具有缺陷性p53的細(xì)胞。已在臨床上測(cè)試了溶瘤性HSV和0NYX-015用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這兩種減毒的溶瘤病毒均在臨床I/II期研究中具有足夠的安全性。不依賴(lài)于是否在腫瘤內(nèi)或在切除腔內(nèi)注射病毒,所述治療被良好地耐受且沒(méi)能觀察到嚴(yán)重的副作用。然而,細(xì)胞裂解的效應(yīng)僅僅是瞬時(shí)性質(zhì)的,總是繼以復(fù)發(fā)(Cutter等人,2006)。因?yàn)橥ǔI窠?jīng)膠質(zhì)瘤的增殖速率超過(guò)病毒的擴(kuò)增速率和擴(kuò)散波,僅通過(guò)溶瘤來(lái)破壞神經(jīng)膠質(zhì)瘤是值得懷疑的。相反地,對(duì)于有效的治療而言,需要多種作用原理的組合。通過(guò)在OV中使用自殺基因或免疫調(diào)節(jié)基因,可在臨床前的研究中顯示出協(xié)同效應(yīng)(Tyminski等人,2005 ;Fukuhara等人,2005)。除了前述DNA病毒外,溶瘤性RNA病毒也在開(kāi)發(fā)中。VSV是有包膜的負(fù)鏈病毒,其宿主譜包括嚙齒動(dòng)物和家畜。人類(lèi)的感染是罕見(jiàn)的且大多是無(wú)癥狀的。由于在人群中非常低的血清陽(yáng)性率,將不預(yù)期通過(guò)VSV中和性抗體破壞治療效率。VSV的感染和細(xì)胞質(zhì)復(fù)制不依賴(lài)于細(xì)胞類(lèi)型而發(fā)生,從而同等地感染分裂活躍的細(xì)胞和靜止的細(xì)胞。VSV對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效和優(yōu)選的裂解與這些細(xì)胞中大多有缺陷的干擾素信號(hào)通路和與之相伴的優(yōu)選的病毒復(fù)制有關(guān)(WoIlmarm等人,2007)。還可見(jiàn),不依賴(lài)于細(xì)胞的免疫應(yīng)答,在基因Myc、RaS或 P53中有缺陷的腫瘤細(xì)胞也支持VSV的繁殖(Barber,2004)。近年來(lái),通過(guò)制備重組病毒進(jìn)一步優(yōu)化了 VSV的腫瘤特異性。其中主要焦點(diǎn)在于具有M蛋白中的突變(ΔΜ51)的變體。 此變體不阻止健康細(xì)胞中的干擾素應(yīng)答,從而使這些細(xì)胞中的病毒復(fù)制被抑制。在具有缺陷性IFN應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞中,病毒能夠復(fù)制并因此有選擇性溶瘤活性。即使在全身性的施用之后,在小鼠模型中VSV"M51顯示對(duì)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的安全有效的溶瘤(Lim等人,2006)。直接在腦中施用病毒載體要求對(duì)于腫瘤細(xì)胞的高選擇性并且僅可能在相對(duì)小的體積中。因此,僅能通過(guò)極高度濃縮的、對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著趨向性的載體制備物 (> 107ml)來(lái)實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移。在Y反轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體的情況下,可通過(guò)整合非反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白來(lái)影響載體趨向性和載體穩(wěn)定性。通常用更穩(wěn)定的VSV的G蛋白來(lái)代替反轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白。此類(lèi)所謂假型載體的問(wèn)題在于VSV-G是細(xì)胞毒性的(即在產(chǎn)生其的細(xì)胞中以及對(duì)于周?chē)慕】到M織而言),這至今為止妨礙了此類(lèi)VSV-G-假型在臨床中的廣泛應(yīng)用。發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了反轉(zhuǎn)錄病毒載體類(lèi)型,其允許向CNS的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有效的基因轉(zhuǎn)移。在此新的載體類(lèi)型中,淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP作為病毒的包膜蛋白(Miletic等人,1999 ;Beyer等人,2002 ;EP 1 006 196)。在比較性體外和體內(nèi)趨向性研究中,顯示了 LCMV-GP假型優(yōu)選地轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(Miletic等人,2004 ; Miletic等人,2007)。與之相反,VSV-G-假型特別地轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元,而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移不如用LCMV-GP-假型時(shí)有效。單個(gè)的浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞也通過(guò)LCMV-GP-假型被有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)。在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中,90%的大鼠通過(guò)腫瘤內(nèi)注射LCMV-GP假型化的慢病毒載體而被治愈(Miletic等人;2007b)。所使用的載體編碼單純皰疹病毒的胸苷激酶 (TK),從而在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中以及周?chē)募?xì)胞中,將更昔洛韋轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性的三磷酸鹽化合物。對(duì)于治療的成功而言,決定性的不僅是在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中選擇性的基因轉(zhuǎn)移,還有在整個(gè)腫瘤中高效的載體分布。因此,發(fā)明人開(kāi)發(fā)了腫瘤浸潤(rùn)性包裝細(xì)胞,其會(huì)在整個(gè)腫瘤中釋放假型化的載體(W02006/008074)。有前景的具有遷移能力的細(xì)胞類(lèi)型是多能成人祖細(xì)胞,其可從骨髓中被分離(Jiang等人,2002)。在移植實(shí)驗(yàn)中,借助大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型研究了這些細(xì)胞的遷移表現(xiàn)。其中可見(jiàn),祖細(xì)胞有效地穿透腫瘤團(tuán)塊,但不浸潤(rùn)周?chē)慕】的X組織(Fischer等人,2007)。已建立的細(xì)胞系(例如3T3小鼠纖維原細(xì)胞、Rat-I大鼠纖維原細(xì)胞或人293T)未顯示任何腫瘤浸潤(rùn)。事實(shí)上,這些細(xì)胞被局部限制在注射位點(diǎn)或附近且未顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性的遷移。在進(jìn)一步的研究中,發(fā)明人檢測(cè)了表達(dá)TK的祖細(xì)胞在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中的治療效力。這一研究的結(jié)果是,僅由于祖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的“旁觀者效應(yīng)”,在70%的大鼠中實(shí)現(xiàn)了腫瘤的破壞(Miletic等人,2007)。此外,通過(guò)成像方法證實(shí)了祖細(xì)胞的腫瘤內(nèi)定位。經(jīng)治療的、無(wú)癥狀的大鼠的組織學(xué)腦切片在腫瘤的位置處具有有顯著疤痕組織的腔;這表明動(dòng)物中的腫瘤通過(guò)基因治療被成功地清除了。由于這些祖細(xì)胞的強(qiáng)擴(kuò)增潛力,可能進(jìn)行遺傳修飾并隨后選擇單個(gè)的包裝細(xì)胞克隆。開(kāi)發(fā)了用于Y反轉(zhuǎn)錄病毒LCMV-GP假型的、基于祖細(xì)胞的包裝細(xì)胞。這些包裝細(xì)胞以l-7xlOE3TU/ml的滴度持續(xù)地產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述滴度在數(shù)周間以及在重復(fù)地凍融細(xì)胞之后保持穩(wěn)定(Fischer等人,2007)。目前,是低效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移而非缺少治療上有效的基因阻礙膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的成功的基因治療。至今為止已知的、用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療和溶瘤病毒治療的載體由于各種原因不是最佳的。迄今為止的基因轉(zhuǎn)移方法的效率、特異性和安全性應(yīng)被提高到這樣的程度以使得治療上有效的基因轉(zhuǎn)移在患者中是可能的。因此,本發(fā)明的任務(wù)是開(kāi)發(fā)治療性基因的高效溶瘤性病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),用于治療高度惡性的腦瘤(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和其他實(shí)體腫瘤。發(fā)明簡(jiǎn)述因而,本發(fā)明的主題是水泡性口炎病毒(VSV)假型載體,其包含編碼淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因,且不包含編碼VSV的包膜蛋白G的功能性基因。LCMV-GP可以是LCMV的糖蛋白GP-I或GP-2。根據(jù)另一個(gè)特征,在VSV-LCMV-GP假型載體中,VSV的包膜蛋白G被LCMV的 GP (LCMV-GP)代替。根據(jù)另一個(gè)特征,所述載體缺少至少一個(gè)選自下組的基因編碼VSV的N、L、P和M 蛋白的基因n、l、p和m。根據(jù)另一個(gè)特征,VSV的M蛋白包含降低VSV的致細(xì)胞病變性的突變。降低VSV 的致細(xì)胞病變性的突變的實(shí)例是在M蛋白的37PSAP4tl區(qū)域中的氨基酸置換,以及突變M33A、 M51A、V221F、S226R 或其組合。根據(jù)另一個(gè)特征,VSV-LCMV-GP假型載體包含至少一個(gè)治療上可應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因可以是自殺基因或免疫刺激性基因。自殺基因的實(shí)例是編碼單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脫氨酶、FKBP-FAS或Π(ΒΡ_胱天蛋白酶9的基因。免疫刺激性基因的實(shí)例是編碼細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-12、中和性抗TGF β或Flt3L的基因。根據(jù)另一個(gè)特征,VSV-LCMV-GP假型載體包含標(biāo)記基因。所述標(biāo)記基因可以是 LacZ、抗生素抗性基因或編碼熒光蛋白(GFP、RFP、GGP等)的基因。本發(fā)明的主題還是VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng),其包含至少兩種互補(bǔ)復(fù)制(kr)的 VSV載體;其中所述載體系統(tǒng)的一個(gè)載體包含編碼LCMV-GP的基因gp ;其中所述載體系統(tǒng)還包含編碼VSV的N、L、P和M蛋白的基因η、1、ρ和m,且不包含編碼VSV的包膜蛋白G的功能性基因;其中所述載體系統(tǒng)的各載體缺少基因gp、η、1、ρ和m( “互補(bǔ)基因”)之一,且其中所缺少的基因存在于所述載體系統(tǒng)的其他載體上。優(yōu)選地作為互補(bǔ)基因的是m和gp。根據(jù)另一個(gè)特征,VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)的M蛋白包含降低VSV的致細(xì)胞病變性的突變,如上文所述。
根據(jù)另一個(gè)特征,VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)包含至少一個(gè)治療上可應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因和/或標(biāo)記基因,如上文所述。所述轉(zhuǎn)基因/標(biāo)記基因可位于所述載體系統(tǒng)的任何載體上。本發(fā)明另外的主題是以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子,其包含LCMV的GP蛋白作為包膜蛋白。本發(fā)明另外的主題是病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其產(chǎn)生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子。根據(jù)另外的特征,病毒生產(chǎn)細(xì)胞是成人干細(xì)胞。所述成人干細(xì)胞可以是多能成人祖細(xì)胞(MAPC),神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或衍生自MSC的BM-TIC細(xì)胞(源自骨髓的腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞)。根據(jù)另外的特征,所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)選自下組的基因的
表達(dá)盒編碼VSV的N、L、P和M蛋白的基因η、1、P和m,以及編碼LCMV-GP糖蛋白的基因 gp°根據(jù)另外的特征,所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞還包含用于包裝為以LCMV-GP假型化的VSV 病毒粒子的基因轉(zhuǎn)移載體。根據(jù)另外的特征,所述基因轉(zhuǎn)移載體包含治療上可應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因和/或標(biāo)記基因,如上文所述。本發(fā)明的其它主題是將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的體外方法,在所述方法中,用以 LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞,其中所述病毒粒子包含轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的其它主題是將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的體外方法,在所述方法中,使細(xì)胞與病毒生產(chǎn)細(xì)胞接觸,所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子,其中所述病毒粒子包含轉(zhuǎn)基因。 優(yōu)選地,所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞,例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。本發(fā)明的其它主題是本發(fā)明的VSV-LCMV-GP假型載體或VSV_LCMV_GP假型載體系統(tǒng)用于制備藥物組合物的用途,所述藥物組合物用于治療實(shí)體腫瘤。本發(fā)明的其它主題是以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子用于制備藥物組合物的用途,所述藥物組合物用于治療實(shí)體腫瘤。本發(fā)明的其它主題是本發(fā)明的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于制備藥物組合物的用途,所述藥物組合物用于治療實(shí)體腫瘤。優(yōu)選地,所述實(shí)體腫瘤是腦瘤,特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤。根據(jù)另一個(gè)特征,至少使用兩個(gè)病毒生產(chǎn)細(xì)胞來(lái)制備用于治療實(shí)體腫瘤的藥物組合物,其中第一個(gè)病毒生產(chǎn)細(xì)胞包含VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)的第一種載體,且第二個(gè)包裝細(xì)胞包含VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)的第二種載體。本發(fā)明的主題還是藥物組合物,其包含VSV-LCMV-GP假型載體、VSV_LCMV_GP假型載體系統(tǒng)、以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子或產(chǎn)生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子的病毒生產(chǎn)細(xì)胞。所述組合物還可以包含合適的助劑和/或載體。


圖 1 通過(guò) LCMV GP 假型化 VSVgfp ncp- Δ G-載體圖2 用VSV(LCMV GP)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系圖 3 在 BM-TIC 中通過(guò) LCMV GP 假型化 VSVgfp ncp- Δ G-載體
8
圖4 :kr VSV(LCMV-GP)載體系統(tǒng)的圖示。a)載體之一包含rfp來(lái)代替磷蛋白P 且包含LCMV-GP來(lái)代替VSV-G。b)互補(bǔ)的載體編碼a)中缺少的P蛋白,但是包含例如單純皰疹病毒的胸苷激酶(TK)作為治療性基因來(lái)代替病毒糖蛋白。兩種載體均包含經(jīng)修飾的 M 基因(Mncp)。圖5:病毒載體的圖示。在優(yōu)化的載體中,克隆治療性基因來(lái)代替P蛋白。除了免疫調(diào)節(jié)性基因(IL-12,F(xiàn)lt3L)之外,第二種載體還包含HSV的胸苷激酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及重組水泡性口炎病毒(VSV)和VSV載體。VSV基因組包含五個(gè)對(duì)于病毒的繁殖而言是關(guān)鍵的基因1、m、η、P和g,其編碼蛋白L、M、N、P和G。N是核蛋白,其包裝 VSV基因組RNA ;VSV基因組僅能作為RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物被復(fù)制。L和P —同形成聚合酶復(fù)合物,其復(fù)制VSV基因組并轉(zhuǎn)錄VSV mRNA。M是基質(zhì)蛋白,其在病毒顆粒中構(gòu)成脂包膜與核衣殼間的一種配件(Kit)并且其對(duì)于細(xì)胞膜上的顆粒出芽是重要的。G是包膜蛋白,其被嵌入病毒包膜中并且對(duì)于病毒的感染性是關(guān)鍵的。本發(fā)明的主題是VSV-LCMV-GP假型載體和以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子。本發(fā)明的載體包含編碼LCMV的GP蛋白的基因gp來(lái)代替編碼VSV的G蛋白的基因g。相應(yīng)地,本發(fā)明的病毒/病毒粒子包含LCMV-GP蛋白作為包膜蛋白。所述GP蛋白可以是GPl或 GP2。本發(fā)明包括來(lái)自不同LCMV株系的GP蛋白。特別的,LCMV-GP變體可衍生自LCMV野生型或 LCMV 株系 LCMV-WE、LCMV-ffE-HPI, LCMV-ffE-HPIopt (W02006/008074)。相比于反轉(zhuǎn)錄病毒載體,基于水泡性口炎病毒的載體具有多種優(yōu)勢(shì)(i) VSV載體是溶瘤性的并且與其他溶瘤性病毒載體相比,其具有特別高的溶瘤活性。(ii) VSV載體優(yōu)選在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并且與其他溶瘤性病毒載體相比,其具有特別高的復(fù)制能力。(iii) VSV載體感染分裂活躍的細(xì)胞以及靜止的細(xì)胞。(iv) VSV載體誘導(dǎo)強(qiáng)的先天的(innate)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。(v) VSV載體完全是胞質(zhì)復(fù)制,因此其作為RNA病毒,既不能整合到宿主細(xì)胞的基因組中也不能重組為能夠復(fù)制的病毒。(vi)VSV載體容易包裝。 (vi i) VSV糖蛋白與外來(lái)包膜蛋白是可互換的。迄今為止嵌入到VSV包膜中的糖蛋白的實(shí)例是:HIVgpl60 (Owens 和 Rosel993),HCVE1/E2 (Tani 等人,2007),SARS S (Ge 等人, 2006)和 Lassa GP (Garbutt 等人,2004)。綜上,VSV載體具有特別大的治療潛能。根據(jù)本發(fā)明的VSV-LCMV-GP假型載體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是以LCMV-GP假型化的VSV病毒針對(duì)健康的腦細(xì)胞(即神經(jīng)元)顯著降低的毒性。VSV的神經(jīng)毒性歸因于VSV的G蛋白 (Shinosaki等人,2005)。其實(shí),VSV-G假型優(yōu)選地感染正常的神經(jīng)元。由于對(duì)于溶瘤性VSV 的所有應(yīng)用而言,神經(jīng)趨向性是劑量限制性的,使用根據(jù)本發(fā)明的載體對(duì)于所有的腫瘤都是很有利的。此外,VSV-LCMV-GP假型載體對(duì)于腦瘤細(xì)胞具有增加的特異性,這源于所使用的LCMV-GP糖蛋白的神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性趨向性和VSV在腫瘤細(xì)胞中的選擇性轉(zhuǎn)錄/復(fù)制。與 VSV-G相反,LCMV-GP包膜蛋白對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有特別的趨向性。然而,根據(jù)本發(fā)明的載體也能夠被成功地用于CNS外的其他腫瘤中,因?yàn)閂SV的神經(jīng)毒性(特別是在全身性應(yīng)用的情況下)在那些地方也是劑量限制性的。以LCMV-GP假型化的載體具有未假型化的載體所沒(méi)有的三個(gè)決定性的特性,即(i) LCMV-GP不是細(xì)胞毒性的。(ii) LCMV-GP假型載體可通過(guò)超速離心法被濃縮而不喪失感染性。(iii) LCMV-GP假型載體顯示對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的優(yōu)選的趨向性,而神經(jīng)元被低效地感染。本發(fā)明既包括復(fù)制缺陷性的病毒也包括能夠復(fù)制的病毒。后者具有另外的優(yōu)勢(shì), 因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用能夠繁殖的病毒可實(shí)現(xiàn)高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。在這方面,能夠復(fù)制的溶瘤性病毒載體比不能復(fù)制的載體更有效。為了在治療性應(yīng)用中使用可復(fù)制的病毒時(shí)提高安全性,提供載體系統(tǒng),其確保VSV 病毒的復(fù)制、溶瘤和產(chǎn)生僅在被至少兩種彼此互補(bǔ)的復(fù)制缺陷性載體感染的細(xì)胞中發(fā)生。本發(fā)明的主題因此是VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng),其包含至少兩種互補(bǔ)的VSV載體。此類(lèi)互補(bǔ)復(fù)制性(kr)VSV載體能夠限制性地在腫瘤組織內(nèi)擴(kuò)散,這提高了基因轉(zhuǎn)移和溶瘤的效率。因此,根據(jù)本發(fā)明的載體系統(tǒng)使得能夠制備具有有限繁殖能力的溶瘤性 VSV-LCMV-GP假型載體,其用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其他實(shí)體腫瘤中的基因轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的載體系統(tǒng)的原理是所述系統(tǒng)的各載體缺少VSV的關(guān)鍵性基因m、n、l 和P之一或LCMV的gp,然而,所述缺少的基因存在于所述系統(tǒng)的其他載體上。編碼LCMV-GP 的基因gp和可選的其他基因(例如治療基因和/或標(biāo)記基因)可以存在于所述系統(tǒng)的任何載體上。根據(jù)本發(fā)明的載體系統(tǒng)的不同變體是可能的。例如,所述載體系統(tǒng)可由兩種載體組成,圖5中所示。第一種載體包含LCMV的GP來(lái)代替VSV的G,且缺失編碼P蛋白的基因 P。第二種載體也不包含VSV-G,但表達(dá)VSV的P蛋白。各載體表達(dá)VSV的核蛋白(N)和聚合酶(L)以及M蛋白的致細(xì)胞病變性較弱的變體(Mn。p)。所述第一種載體還攜帶標(biāo)記基因 rfp,而第二種載體攜帶自殺基因HSV-TK和標(biāo)記基因gfp。在圖6中所示的變體中,兩種載體均可包含治療性基因,其中第一種載體包含例如Flt3L或IL-12,且第二種載體包含例如 HSV-TK。迄今為止,已追蹤了治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的不同概念(i)轉(zhuǎn)移自殺基因,(ii)借助于免疫刺激性基因并介由基于細(xì)胞因子的免疫治療來(lái)消除膠質(zhì)母細(xì)胞瘤引起的免疫抑制, (iii)轉(zhuǎn)移阻礙腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的因子,(iv)使用細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑和(ν)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了本發(fā)明的目的,主要考慮前三種方式(i-iii)。除了其固有的溶瘤特性,根據(jù)本發(fā)明的VSV-LCMV-GP假型載體和基于其的載體系統(tǒng)可通過(guò)引入自殺基因或/和免疫刺激性基因而被進(jìn)一步改善。自殺蛋白的實(shí)例是單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脫氨酶、FKBP-FAS或FKBP-胱天蛋白酶9。免疫刺激性蛋白的實(shí)例是細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-4、11^-12和?1130、中和性抗16卩3。最多4. 5kb 大的基因插入被VSV基因組容忍,從而甚至能夠在一個(gè)VSV基因組中聯(lián)合兩個(gè)或更多個(gè)治療性基因(例如HSV-TK+細(xì)胞因子)。此外,基因產(chǎn)物也介由所謂的旁觀者效應(yīng)在未被感染的腫瘤細(xì)胞上發(fā)揮作用。被注射的病毒載體從注射位點(diǎn)向腫瘤組織中僅滲透幾毫米。為了優(yōu)化載體分布且為了靶向地破壞腫瘤,使用腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,所述腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞特異性地遷移到腫瘤中,從而在遠(yuǎn)離注射位點(diǎn)的位置釋放病毒。在本發(fā)明意義中,病毒生產(chǎn)細(xì)胞既包括用于從不能復(fù)制的載體生產(chǎn)病毒粒子的經(jīng)典包裝細(xì)胞,也包括用于從能夠繁殖的載體生產(chǎn)病毒粒子的生產(chǎn)細(xì)胞。包裝細(xì)胞通常包含一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)關(guān)鍵基因的質(zhì)粒,所述關(guān)鍵基因從待包裝的相應(yīng)載體中缺少和/或?qū)τ诋a(chǎn)生病毒粒子是必需的。在迄今為止的研究中,雖然包裝細(xì)胞被用于轉(zhuǎn)移病毒載體;然而,這主要涉及不向腫瘤中遷移的纖維原細(xì)胞(Short等人,1990, Culver等人,1992)。相反地,成人干細(xì)胞(特別是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC))具有高遷移潛力。他們保持被限制在腫瘤組織中,從而實(shí)現(xiàn)非常有效但也是特異性的、向腫瘤組織中的基因轉(zhuǎn)移。然而,這些干細(xì)胞在體外具有有限的傳代能力。成人間質(zhì)干細(xì)胞的亞群(所謂的BM_TIC(源自骨髓的腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞))在被注射到經(jīng)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中后浸潤(rùn)整個(gè)腫瘤,并且此外,其追蹤離開(kāi)腫瘤團(tuán)塊的單個(gè)腫瘤細(xì)胞(Miletic等人,2007)。BM-TIC是從成人骨髓中分離的,其具有高擴(kuò)展?jié)摿η铱杀挥米饔糜贛LV (Fischer等人,2007)和VSV載體的遷移性生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明的主題因此是產(chǎn)生溶瘤性VSV-LCMV-GP假型載體的病毒生產(chǎn)細(xì)胞。特別地,這些細(xì)胞是腫瘤浸潤(rùn)性的生產(chǎn)細(xì)胞,當(dāng)其在腫瘤內(nèi)遷移時(shí)釋放所述載體。優(yōu)選的是成人干細(xì)胞,特別是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。特別優(yōu)選的是衍生自MSC的BM-TIC 細(xì)胞。對(duì)于制備棒狀病毒的病毒生產(chǎn)細(xì)胞而言,障礙是蛋白M和G的致細(xì)胞病變性。由于在本發(fā)明的VSV-LCMV-GP假型載體中,VSV的G蛋白被神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性的和非細(xì)胞毒性的、LCMV的糖蛋白所代替,僅M蛋白仍然是問(wèn)題。為了在產(chǎn)生VSV的細(xì)胞系中減少M(fèi)蛋白的毒性,可使用M蛋白的非致細(xì)胞病變性變體。因此,本發(fā)明的病毒生產(chǎn)細(xì)胞以及相應(yīng)地由所述細(xì)胞產(chǎn)生的VSV-LCMV-GP假型載體可相應(yīng)地包含編碼突變的M蛋白的基因。這一載體變體對(duì)于腫瘤細(xì)胞是選擇性溶瘤性的,而其對(duì)于健康的細(xì)胞是無(wú)毒的。優(yōu)選的是在M蛋白的37PSAP4°區(qū)域中有氨基酸置換的M 變體,或在M蛋白的PSAP區(qū)域外具有單一 (M51R)或多重(V221F和S226R ;M33A和M51A) 突變的M變體。特別優(yōu)選的是包含突變M33A、M51R、V221F和S226R的M蛋白。為了確保包裝細(xì)胞中有效的病毒生產(chǎn),可用病毒干擾素拮抗劑穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染所述M變體。此外,本發(fā)明的主題是用于基因轉(zhuǎn)移的體外方法,其中將包含轉(zhuǎn)基因的 LCMV-GP-VSV假型載體或LCMV-GP-VSV假型載體系統(tǒng)直接地、或借助于本發(fā)明的病毒生產(chǎn)細(xì)胞(包裝細(xì)胞)引入細(xì)胞中。如果使用具有至少兩種載體的kr載體系統(tǒng),則使用至少兩個(gè)包裝細(xì)胞,其各產(chǎn)生所述(不能復(fù)制的)kr載體中的一種。VSV病毒的產(chǎn)生僅發(fā)生在被所述kr載體系統(tǒng)的所有載體所感染、并相應(yīng)地包含所有關(guān)鍵病毒基因的細(xì)胞中。此外,本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的載體和病毒生產(chǎn)細(xì)胞在治療方法中作為藥物的用途。特別地,本發(fā)明的載體和病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于實(shí)體腫瘤的治療。所述治療效果既通過(guò)所述重組載體和病毒的溶瘤特性也通過(guò)使用治療性基因而產(chǎn)生。
實(shí)體腫瘤可以是腦瘤、肝腫瘤(特別是肝細(xì)胞癌)、肺腫瘤(特別是支氣管癌)和腸腫瘤(特別是結(jié)腸癌)。優(yōu)選的腫瘤是腦瘤,例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤,特別是室管膜瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、寡星狀細(xì)胞瘤、星狀細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或髓母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的主題還是藥物組合物,其包含本發(fā)明的載體、病毒粒子、病毒生產(chǎn)細(xì)胞和可選地添加劑(例如載體和助劑)。為了提高病毒的溶瘤性和治療性基因的轉(zhuǎn)移效率,將持續(xù)釋放載體的、腫瘤浸潤(rùn)性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞配制為用于直接植入腫瘤中。根據(jù)下述實(shí)施例闡釋本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1 通i寸LCMV-GP-假型仆Jfe彳本轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)朐用編碼GFP但不編碼病毒包膜蛋白的缺陷性VSV載體(VSVgfp-ncp- Δ G)轉(zhuǎn)導(dǎo) ΒΗΚ-21和Vero細(xì)胞,所述ΒΗΚ-21和Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)而穩(wěn)定地表達(dá)LCMV的GP。每24孔板腔中接種 IxlO5 細(xì)胞(BHK-21, -GP,Vero, -GP),四小時(shí)后用 VSVgfp-ncp-Δ G 載體以 MOI = 5 進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。24小時(shí)后,收集培養(yǎng)物上清并通過(guò)對(duì)ΒΗΚ21中的GFP表達(dá)進(jìn)行FACS分析來(lái)確定滴度。圖1顯示,被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生LCMV-GP-假型化VSV載體,其中取決于所使用的細(xì)胞類(lèi)型,假型滴度在2-7xlOE 5TU/ml間變化。由于所述假型意在用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的基因轉(zhuǎn)移,檢測(cè)了所述載體對(duì)于不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。測(cè)試了兩種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、G44)和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(9L)。BHK-21再次被用作對(duì)照。每24孔板腔中接種IxlO5細(xì)胞,四小時(shí)后用 VSV-LCMV-GP假型載體以MOI = 0. 3 (在BHK-21上滴定)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。24小時(shí)后,通過(guò)FACS 分析確定表達(dá)GFP的細(xì)胞的百分比并由此計(jì)算出滴度。圖2顯示,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系有效地被LCMV-GP假型化VSV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)了。實(shí)施例2 在多能祖細(xì)胞中包裝VSV-LCMV-GP假型載體發(fā)明人已經(jīng)顯示了根據(jù)C. Verfaillie的方案分離的干細(xì)胞(Jiang等人,2002) 具有腫瘤浸潤(rùn)的特性。由于僅檢測(cè)了其遷移潛力而沒(méi)檢測(cè)其分化潛力,將這些細(xì)胞稱(chēng)為BM-TIC(源自骨髓的腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞)。為了測(cè)試BM-TIC對(duì)于VSV載體的包裝能力, 以缺陷性的VSV-GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)LCMV-GP的BM-TIC。每24孔板腔中接種IxlO5細(xì)胞 (BM-TIC,-GP,BHK-21),四小時(shí)后用VSVgfp-ncp-AG載體以MOI = 5進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。24小時(shí)后, 收集培養(yǎng)物上清并在BHK-21細(xì)胞上滴定。圖3顯示,也可以在BM-TIC中制備VSV-LCMV-GP 假型。然而,滴度相比于例如BHK-21GP細(xì)胞較低(見(jiàn)圖1)。實(shí)施例3 開(kāi)發(fā)互補(bǔ)復(fù)制性(kr) VSV-LCMV-GP假型載體用能夠繁殖的病毒允許實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。為了提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的基因轉(zhuǎn)移率并同時(shí)確保高度的安全性,建立了受限的、能夠復(fù)制的VSV假型載體。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒 (Trajcevski等人,2004)和不同的黃病毒(Ri印1和Mandl,2007),已描述了具有互補(bǔ)的缺陷性病毒的復(fù)制系統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)的原理是在兩個(gè)不完全的復(fù)制子中分配病毒基因組。當(dāng)同一個(gè)細(xì)胞被兩種載體均感染時(shí)才能產(chǎn)生感染性的病毒,并且只有通過(guò)這種共感染,才包含所有用于包裝病毒基因組的必要組份。圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的載體系統(tǒng)的互補(bǔ)性載體的實(shí)例。為了有效的復(fù)制和包裝,第一種載體缺少磷蛋白P。為了能夠更簡(jiǎn)單地確定這些載體的病毒滴度,所述載體編碼紅色熒光蛋白(rfp)來(lái)代替P。所缺少的P功能通過(guò)用第二種載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞而得到補(bǔ)給。 然而,所述第二種載體單獨(dú)不能夠繁殖,因?yàn)槠淙鄙訇P(guān)鍵的包膜蛋白VSV-G。治療性基因借助于此載體而被施用。正鏈RNA病毒的基因組RNA單獨(dú)地就是感染性的,而負(fù)鏈RNA病毒(例如VSV)為了從克隆的病毒cDNA產(chǎn)生感染性的病毒粒子,除病毒RNA基因組外還至少需要病毒核蛋白 (N)和病毒聚合酶(L)。制備重組VSV的系統(tǒng)是基于病毒(+)RNA和病毒蛋白N、P和L的胞質(zhì)表達(dá),所述胞質(zhì)表達(dá)借助于構(gòu)成性地在BSR T7/5細(xì)胞中表達(dá)的T7-RNA聚合酶。為了制備所需要的載體,用基因組構(gòu)建體與N、P和L的表達(dá)質(zhì)粒以及還有VSV-G的表達(dá)質(zhì)粒在載體 b)的情況下(圖4)) 一同共轉(zhuǎn)染到BSR T7/5中。通過(guò)將如此獲得的病毒傳遞給反式(in trans)表達(dá)所缺少的組份的細(xì)胞,能夠可觀地提高滴度。對(duì)于LCMV-GP缺陷性載體,建立了穩(wěn)定表達(dá)GP的BHK-21細(xì)胞系。對(duì)于P缺陷性載體,建立了表達(dá)P蛋白的BHK-21細(xì)胞系。制備和表征kr LCMV-GP-假型化VSV載體在關(guān)于其滴度和其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率表征了單個(gè)載體后,在體外檢測(cè)了所述載體的擴(kuò)散。 為此,用兩種載體共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并通過(guò)將培養(yǎng)物上清在天然BHK-21上的系列傳遞來(lái)檢測(cè)復(fù)制以及新載體的出現(xiàn)。用作為單層以及作為橢球體培養(yǎng)的不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 (G44、G62、U87)重復(fù)了這些實(shí)驗(yàn)。腫瘤橢球體是三維的器官樣細(xì)胞組,其比單層培養(yǎng)物更好地反映腫瘤的性質(zhì)和異質(zhì)性。分裂活躍的腫瘤細(xì)胞以松散的集合位于細(xì)胞聚集體的邊緣處,而更深處的細(xì)胞不再分裂并且也在此發(fā)生壞死區(qū)域的形成(Carlson等人,1984)。所述橢球體實(shí)驗(yàn)提供了關(guān)于 krVSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)的腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)和溶瘤效果的信息。因此,此類(lèi)橢球體使得能夠?qū)λ鱿到y(tǒng)進(jìn)行初始優(yōu)化而不必進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物模型中檢測(cè)了 kr LCMV-GP-假型化VSV載體可能的毒性、溶瘤的治療效果和去除腫瘤后病毒的殘存(見(jiàn)實(shí)施例6)。病毒RNA聚合酶沒(méi)有重組酶活性且在細(xì)胞質(zhì)中也沒(méi)有細(xì)胞的重組酶,從而兩個(gè)負(fù)鏈RNA病毒間的重組僅能通過(guò)RNA聚合酶的模板交換實(shí)現(xiàn)。然而,這是極其罕見(jiàn)的事件 (Finke和Conzelmann,2005 ;Spann等人,2003)。重組的、可復(fù)制的VSV的產(chǎn)生提出了安全性風(fēng)險(xiǎn)并對(duì)此進(jìn)行了檢測(cè)。其中,在不同的時(shí)間點(diǎn)從經(jīng)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中分離病毒RNA并用轉(zhuǎn)基因特異性(例如gfp)探針在RNA印跡中進(jìn)行檢測(cè)。如果具有“過(guò)度長(zhǎng)度”的RNA種類(lèi)是可檢測(cè)的,對(duì)來(lái)自上清的病毒進(jìn)行噬斑純化并介由標(biāo)準(zhǔn)方法就其感染性進(jìn)行檢測(cè)并隨后進(jìn)行分子生物學(xué)表征。實(shí)施例4 建立用于制備治療上有效的VSV(LCMV-GP)假型載體的遷移性生產(chǎn)細(xì)胞對(duì)于kr VSV載體和不能復(fù)制的VSV-LCMV-GP載體建立了遷移性的VSV-LCMV-GP 生產(chǎn)細(xì)胞。不同M變體的制備和表征VSV M蛋白在VSV循環(huán)中有兩個(gè)重要的任務(wù)。一方面,其作為病毒粒子的結(jié)構(gòu)組份對(duì)于病毒的裝配和出芽是關(guān)鍵的。另一方面,所述VSV M蛋白通過(guò)其宿主蛋白合成的“宿主關(guān)閉”活性以及通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而顯著地促成病毒致病。在此關(guān)聯(lián)中,M蛋白的重要的功能是抑制IFN mRNA的核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。由此,細(xì)胞抵抗病毒感染的第一個(gè)防御機(jī)制就被抑制了。由于此種強(qiáng)毒性效果,不可能長(zhǎng)期在細(xì)胞系中表達(dá)M蛋白。然而,已知M蛋白中引起病毒的減毒的多個(gè)突變。Irie和同事們表明了通過(guò)在M蛋白的所謂37PSAP4°區(qū)中的氨基酸置換,產(chǎn)生了具有大大降低的致細(xì)胞病變性的VSV突變體(Irie等人,2007)。此外,如在小鼠實(shí)驗(yàn)中所顯示的,在所述PSAP區(qū)域之外有單個(gè)突變(M51R)或多個(gè)突變(V221F和 S226R ;M33A 和 M51A)的 M 變體也被大大減毒了(Desforges 等人,2001 Jayakar 和 Whitt, 2002)。這些病毒不抑制IFN-a/β的釋放并因而誘導(dǎo)保護(hù)動(dòng)物抵抗感染的抗病毒狀態(tài)。然而,在經(jīng)常在IFN系統(tǒng)中有缺陷的腫瘤中,這些病毒能夠繁殖并溶解腫瘤。由于安全性技術(shù)的原因,此類(lèi)減毒的變體對(duì)于基因治療有特別的意義,因?yàn)槠鋬?yōu)選地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。發(fā)明人也克隆了 M蛋白的非致細(xì)胞病變性變體(Mnep),其包含所述的突變M33A、 M51R、V221F和S226R且不再抑制IFN-β的合成。此變體以類(lèi)似于親本病毒的效率在IFN 不健全的細(xì)胞上復(fù)制,但其在IFN健全的細(xì)胞上是減毒的。為了確保BM-TIC中有效的病毒生產(chǎn),用病毒干擾素拮抗劑(Haller等人,2006)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。制備和表征用于VSV-LCMV-GP假型載體的衍牛自BM-TIC的牛產(chǎn)細(xì)胞因?yàn)榛赩SV-LCMV-GP假型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性趨向性,主要是腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo),也可備選地使用仍顯示一定的致細(xì)胞病變性的M變體。為了使毒性效應(yīng)在BM-TIC中保持是低的,應(yīng)通過(guò)Tet-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子使抗病毒的MxA蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。具有Tet-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的反轉(zhuǎn)錄病毒載體是已知的(L5W等人,2006)。也通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體將 Tet-反應(yīng)性元件(tTA)引入BM-TIC中。MxA是干擾素誘導(dǎo)的、具有針對(duì)RNA病毒的抗病毒活性的GTP酶(Pavlovic等人,1992 ;Staheli和Pavl0vic,1991)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其以大
寡聚體的形式存在,其是無(wú)毒的且通過(guò)迄今仍不清楚的機(jī)制抑制VSV的復(fù)制。用Tet-調(diào)控的MxA和tTA載體轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)LCMV-GP的BM-TIC,且隨后用VSV載體感染所述表達(dá)LCMV-GP 的BM-TIC。只要培養(yǎng)基中存在抗生素,細(xì)胞就通過(guò)MxA而對(duì)VSV(LCMV-GP)的生產(chǎn)性感染有抗性。直至體內(nèi)應(yīng)用期間才去除抗生素并且逐漸發(fā)生VSV(LCMV-GP)的病毒復(fù)制和生產(chǎn)。 由于具有兩天的半衰期的MxA是非常穩(wěn)定的,備選地使用突變體MxA(L612K)。MxA(L612K) 以與野生型蛋白相同的效力抑制VSV的感染,但不形成寡聚體。由此其被去穩(wěn)定化并具有僅兩小時(shí)的短的半衰期(Janzen等人,2000)。產(chǎn)生具有非致細(xì)胞病變性M的載體的BM-TIC和通過(guò)表達(dá)MxA來(lái)防止VSV-相關(guān)裂解的BM-TIC這兩種生產(chǎn)細(xì)胞如下被表征(i)確定載體的滴度和載體產(chǎn)生的持續(xù)時(shí)間。(ii)分析細(xì)胞的冷凍和融化對(duì)于載體滴度的影響。(iii)首先在橢球體模型中,隨后在動(dòng)物模型中分析細(xì)胞是否仍具有腫瘤浸潤(rùn)的特性和在腫瘤組織中達(dá)到了何種轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。(iv)檢測(cè)所產(chǎn)生的載體上清中可復(fù)制的VSV的存在。實(shí)施例5 治療性基因的克隆和包裝自殺基因可用于作為根據(jù)本發(fā)明的治療性基因。此類(lèi)基因的實(shí)例是單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK),對(duì)其在臨床中有最多的經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)HSV-TK的構(gòu)成性表達(dá),可以在治療結(jié)束時(shí)可靠地清除包裝細(xì)胞和被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞,從而沒(méi)有危險(xiǎn)可產(chǎn)生自有有絲分裂活性的包裝細(xì)胞。
14
為了惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的免疫治療,即為了強(qiáng)化在腦中較弱地產(chǎn)生的局部免疫應(yīng)答,可使用免疫調(diào)節(jié)性基因。此類(lèi)基因的實(shí)例是細(xì)胞因子,特別是IL-12和Flt3L。在抗原刺激之后,IL-12被抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞)天然地分泌并介導(dǎo)強(qiáng)的基于Thl的抗腫瘤免疫應(yīng)答。其增強(qiáng)了天然T細(xì)胞的生長(zhǎng)和其向Thl細(xì)胞的分化并因此阻礙了神經(jīng)膠質(zhì)瘤所誘導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞增殖和IFNy的產(chǎn)生的抑制。IL-12增強(qiáng)天然殺傷者細(xì)胞和⑶8+細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性且此外具有抗血管生成的活性(Majewski等人,1996)。 在多個(gè)動(dòng)物模型中,已經(jīng)令人印象深刻地表明了 IL-12介導(dǎo)的免疫應(yīng)答抵抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效力(Toda等人,1998 ;Kikuchi等人,1999)。細(xì)胞因子Flt3L對(duì)于呈遞抗原的樹(shù)突細(xì)胞的增殖和分化是關(guān)鍵的,因此其似乎特別適于基因治療方法。Sumia和同事(2004)在用 Flt3L基因在大鼠/小鼠中皮內(nèi)(i.e.)轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤后,觀察到強(qiáng)的樹(shù)突細(xì)胞的局部匯聚。70%經(jīng)治療的大鼠顯示出腫瘤的衰退并存活了。細(xì)胞因子和自殺基因(TK)的組合不僅提供最大的安全性,也由于“旁觀者效應(yīng)” 允許了僅以低的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行成功的治療。此方法聯(lián)合了三種作用原理,即病毒溶瘤作用、 自殺基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和局部的免疫刺激,以提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療效率。首先,將IL-12和Flt3L克隆到VSV載體中。IL-12是有物種特異性活性的,從而必須使用鼠類(lèi)的IL-12來(lái)在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中進(jìn)行測(cè)試。相反地,人和鼠類(lèi)的Flt3L 是超過(guò)70%同源的并且在兩個(gè)物種中是交叉反應(yīng)的。將免疫刺激性基因克隆到ρ基因的位置處,而第二種載體上的TKgfp或gfp代替了 VSV-G基因。將下列基因組合克隆到kr VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)的兩種載體中(圖5)1)載體 a = IL12 或 Flt3L+ 載體 b = TKgfp (或 TK)2)載體 a = IL12 或 Flt3L+ 載體 b = gfp3)載體 a = IL12 或 Flt3L+載體 b =空白4)載體 a =空白 + 載體 b = TKgfp (或 TK)5)載體a =空白+載體b = gfp6)載體a =空白+載體b =空白克隆之后,轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和BM-TIC,并在ELISA中檢驗(yàn)上清中細(xì)胞因子的濃度。產(chǎn)生有生理學(xué)意義的量,然后通過(guò)超速離心濃縮所述載體。所述載體首先用于轉(zhuǎn)導(dǎo)橢球體并在此系統(tǒng)中檢測(cè)其“旁觀者致死”的能力。然后,將載體上清與所制備的包裝細(xì)胞一同送到Bergen我們的合作伙伴處。在那里,在同系大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試。施用更昔洛韋后評(píng)估了經(jīng)處理的大鼠的存活率。與此同時(shí),檢測(cè)了沒(méi)有TK時(shí)免疫治療的治療效果。載體組合6)提供了關(guān)于溶瘤作用的效力的信息。通過(guò)MRI和PET觀察了腫瘤的大小及治療成果(Miletic等人,2007)。借助于檢測(cè)浸潤(rùn)性細(xì)胞的免疫組織化學(xué)方法評(píng)估免疫調(diào)節(jié)基因的效果。如下文中所述,也在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中檢測(cè)了所述治療方法。^MM 6 在兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤樽型φ測(cè)丨試?臺(tái)療^^乍用Jj^串首先在體外表征所述重組VSV載體,并隨后在動(dòng)物模型中研究其效力。為此,使用了兩種特別有意義的大鼠模型。將同系的9L大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型用于免疫學(xué)方面的檢測(cè)或免疫治療方法的實(shí)施。為此,將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系植入Fisher大鼠的腦中,所述Fisher大鼠于是在幾天后產(chǎn)生腫瘤。分離自Fisher大鼠的9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞在此作為腫瘤細(xì)胞系。然后將各種載體或細(xì)胞系立體地注射到所誘導(dǎo)的腫瘤中。此大鼠模型具有下列特征(i)其表現(xiàn)為具有低的個(gè)體間變化的可良好重復(fù)的系統(tǒng)。(ii)腫瘤具有與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤類(lèi)似的特性,例如入侵性的和侵略性的生長(zhǎng)行為以及產(chǎn)生TGFii 2作為免疫抑制因子。(iii)與SCID/裸鼠模型或大鼠異種移植模型相反,所述系統(tǒng)允許免疫學(xué)方面的檢測(cè)或免疫治療方法的測(cè)試。裸大鼠中的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型被用于測(cè)試根據(jù)本發(fā)明的載體和細(xì)胞針對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的溶瘤活性。大鼠異種移植模型模仿人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的各種生長(zhǎng)特性。在此,不使用確定的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系而是使用來(lái)自患者的原發(fā)性腫瘤材料用于建立腫瘤,從而允許模仿人神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)的異質(zhì)性(Sakariassen等人,2006)。通過(guò)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤在裸大鼠中的連續(xù)傳代,可展現(xiàn)惡性腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期并檢測(cè)治療成果。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型特別適于研究治療性方法,因?yàn)槠渚哂邢铝刑卣?i)腫瘤具有與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤相似的特征,例如入侵性的和侵略性的生長(zhǎng)行為。不是使用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系而是使用原發(fā)的患者材料來(lái)建立腫瘤。(ii)通過(guò)腫瘤的連續(xù)傳代,可展現(xiàn)惡性腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期并檢驗(yàn)治療成果。第一代的腫瘤生長(zhǎng)緩慢,是高度入侵性的并具有低度的神經(jīng)血管生成。通過(guò)傳代產(chǎn)生了具有強(qiáng)的增殖和減少的入侵的高度血管生成性表型。(iii)高度入侵、非血管生成的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞表型與腫瘤干細(xì)胞相似。因此, 此動(dòng)物模型使得能夠在人GBM的干細(xì)胞組份上測(cè)試我們的概念的治療效果??蓞^(qū)分兩類(lèi)腫瘤(i)具有慢的、高度侵略性生長(zhǎng)行為的早期腫瘤。這些腫瘤僅具有低度的血管生成。(ii)高度供血且快速生長(zhǎng)的晚期腫瘤。此表型表現(xiàn)低的入侵性。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型非常適于研究自殺基因療法以及病毒的溶瘤作用。然而,目前為止,不存在可用于分析基因治療方法的免疫治療效力的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的動(dòng)物模型。介由成像方法并最終用組織學(xué)技術(shù)分析和評(píng)估了治療成果。首先,通過(guò)在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中腫瘤內(nèi)注射濃縮的載體上清檢測(cè)了互補(bǔ)復(fù)制性VSV(LCMV-GP)假型的作用方式。幾天后,借助對(duì)冷凍切片的熒光顯微分析檢測(cè)了編碼gfp的載體在腫瘤內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和分布。此外,以免疫組織化學(xué)的方式判斷了免疫細(xì)胞的溶瘤作用和遷入。作為補(bǔ)充,也在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的動(dòng)物模型中檢測(cè)了所述效力。在相同的模型中,檢測(cè)了 BM-TIC生產(chǎn)細(xì)胞的遷移能力和所產(chǎn)生的VSV載體的感染性。為此,使細(xì)胞負(fù)載綠色染料,而所釋放的載體編碼rfp。前述方法允許基于熒光簡(jiǎn)單地區(qū)分BM-TIC和經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞。最后,比較了編碼單個(gè)轉(zhuǎn)基因的假型的治療效率。為此,應(yīng)將包裝細(xì)胞以及同時(shí)將濃縮的載體上清注射到已建立的9L腫瘤中。載體應(yīng)包含與TK相組合的免疫刺激性基因。 立體施用所述載體或包裝細(xì)胞后幾天,開(kāi)始施用更昔洛韋。一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包含僅有TK的載體,并用于評(píng)估載體中免疫調(diào)節(jié)組份的治療效率。處理完成后,基于腫瘤的大小用成像方法 (MRI ;PET)評(píng)估單個(gè)治療概念的效力。經(jīng)免疫治療的大鼠的腦的一部分被用于表征免疫狀態(tài)。介由免疫組織化學(xué)方法在冷凍切片上檢測(cè)MHC分子的表達(dá)和T細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分布。此外,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了皮內(nèi)浸潤(rùn)性細(xì)胞的數(shù)量和表型組成。針對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療,調(diào)適具有最佳治療效果的制劑。此種原型可被直接轉(zhuǎn)移到臨床前的安全性研究中,并且在建立了用于GMP生產(chǎn)的相應(yīng)方法后,可被轉(zhuǎn)移到臨床測(cè)試中。參考文獻(xiàn)1. Barber GN. Vesicular stomatitis virus as an oncolytic vector. Viral Immunol. 2004 ; 17 (4) :516_272.Beyer WR, Westphal M,Ostertag W, von Laer D. Oncoretrovirus and lentivirus vectors pseudotyped with lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein !generation, concentration, and broad host range(2002). J Virol. 76 1488-953.Carlsson J,Yuhas JM. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results Cancer Res. 1984 ;95 :1_234. Culver KW,Ram Z, Wallbridge S,Ishii H,Oldfield EH,Blaese RM. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors.Science. 1992Jun 12 ;256 (5063) :1550_25. Cutter JL,Kurozumi K,Chiocca EA,Kaur B. Gene therapeutics :the future of brain tumor therapy ? Expert Review of Anticancer Therapy ;2006,6(7) 1053-10646. Dai C,Holland EC. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 2001Aug 31 ; 1551(1) :M19-277.Desforges M, Charron J, Berard S, Beausoleil S, Stojdl DF, Despars G, Laverdiere B, Bell JC, Talbot PJ, Stanners CP, Poliquin L.Different host-cell shutoff strategies related to the matrix protein lead to persistence of vesicular stomatitis virus mutants on fibroblast cells.Virus Res. 2001Jul ; 76(1) 87-1028. Finke S,Conzelmann KK. Recombinant rhabdoviruses :vectors for vaccine development and gene therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 2005 ;292 165-2009. Fischer YH, Miletic H, Giroglou T, Litwak S, Stenzel W, Neumann H, von Laer D. A retroviral packaging cell line for pseudotype vectors based on glioma-infiltrating progenitor cells (2007)Journal of Gene Medicine 9:335-34410. Fukuhara H,Martuza RL, Rabkin SD, Ito Y,Todo T. Oncolytic herpes simplex virus vector g47delta in combination with androgen ablation for the treatment of human prostate adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2005Nov 1 ;11 (21) 7886-9011.Garbutt M, Liebscher R, Wahl-Jensen V, Jones S, Moller P, Wagner R, Volchkov V,Klenk HD, Feldmann H,Stroher U. Properties of replication-competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses. J Virol. 2004May ;78 (10) :5458_6512.Ge J,Wen Z,Wang X,Hu S,Liu Y,Kong X,Chen H,Bu Z.Generating vesicularstomatitis virus pseudotype bearing the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike envelope glycoprotein for rapid and safe neutralization test or cell-entry assay. Ann N Y Acad Sci. 20060ct ;1081 246-813.Irie T,Carnero E,Okumura A,Garcia-Sastre A,Harty RN. Modifications of the PSAP region of the matrix protein lead to attenuation of vesicular stomatitis virus in vitro and in vivo. J Gen Virol. 2007Sep ;88 (Pt 9) :2559_6714. Hanika A,Larisch B,Steinmann E,Schwegmann-Wesse1s C,Herrler G, Zimmer G. Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus pseudotypes. J Gen Virol. 2005May ;86 (Pt 5) 1455-6515. Haller 0,Kochs G, Weber F. The interferon response circuit-induction and suppression by pathogenic viruses. Virology. 2006Jan 5 ;344(1) 119-3016. Holland EC. Gliomagenesis :genetic alterations and mouse models. Nat Rev Genet. 2001Feb ;2 (2) 120-917.Janzen C,Kochs G,Haller 0. A Monomeric GTPase-Negative MxA Mutant with Antiviral Activity. J Virol2000 Sept.,74 (17) :8202_820618.Jayakar HR, Whitt MA. Identification of two additional translation products from the matrix (M) gene that contribute to vesicular stomatitis virus cytopathology. J Virol. 2002Aug ;76 (16) :8011_819. Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL, Schwartz RE,Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR,Reyes M,Lenvik T,Lund T,Blackstad M,Du J,Aldrich S,Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM. (2002)Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418 :41_920. Kikuchi,T.,Joki,T.,Akasaki,Y.,Abe,T,Ohno,Τ. (1999) Cancer Lett. 135, 47-512 1. Kleihues,P. and Cavenee , W. K. World Health Organization Classification of Tumours-Pathology and Genetics, Tumours of the Nervous system. 2000(International Agency for Research on cancer, Lyon)22.Loew R,Vigna E,Lindemann D,Naldini L,Bujard H. Retroviral vectors containing Tet-controlled bidirectional transcription units for simultaneous regulation of two gene activities. J Mol GenMed 2006,2(1),107-11823. Lun X,Senger DL, Alain T,Oprea A,Parato K,Stojdl D,Lichty B,Power A,Johnston RN,Hamilton M,Parney I, Bell JC, Forsyth PA. Effects of intravenously administered recombinant vesicular stomatitis virus (VSV (deltaM51))on multifocal and invasive gliomas. J Natl Cancer Inst. 2006Novl ;98(21) 1546-5724. Majewski, S.,Marczak,Μ.,Szmurlo, Α.,Jablonska,S. & Bollag,W. (1996) J.Invest. Dermatol. 106,1114-111825. Miletic H,Bruns M, Tsiakas K, Vogt B,Rezai R,Baum C,Kuhlke K, Cosset FL, Ostertag W, Lother H,von Laer D (1999)Retroviral vectors pseudotyped with lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 73 6114-6
26. Miletic H,F(xiàn)ischer YH,Neumann H,Hans V,Stenzel W,Giroglou T,Hermann M,Deckert M,Von Laer D. (2004). Selective transduction of malignant glioma by lentiviral vectors pseudotyped with lymphocytic chor iomeningitis virus glycoprote ins. Hum Gene Ther. 15 :1091_10027. Miletic H,F(xiàn)ischer YH, Litwak S,Giroglou T,Waerzeggers Y,Winkeler A,Li H,Himmelreich U,Lange C,Stenzel W, Deckert M,Neumann H,Jacobs AH, von Laer D. Bystander Killing of Malignant Glioma by Bone Marrow-Derived Tumor Infiltrating Progenitor Cells Expressing a Suicide Gene (2007). Molecular Therapy 15 :1373-138128. Miletic H, Fischer YH, Giroglou T ;Rueger MA, Winkeler A, Li H, Himmelreich U,Stenzel W, Jacobs AH, von Laer D. Normal brain cells contribute to the bystander effect in suicide gene therapy of malignant glioma. (2007b) Jorurnal of Clinical Cancer Research, in press29.Owens RJ, Rose JK. Cytoplasmic domain requirement for incorporation of a foreign envelope protein into vesicular stomatitis virus. J Virol. 1993Jan ; 67(1) 360-530.Pavlovic J,Haller 0,Staeheli P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 1992Apr ; 66(4) 2564-931. Riepl C,Mandl C.Two non-infectious flaviviruses can form an infectious alliance. Niirnberg,2007. Poster at the annual Meeiting of the Gesellschaft fiir Virologie32.Sakariassen PO, Prestegarden L, Wang J, Skaftnesmo KO, Mahesparan R, Molthoff C,Sminia P,Sundlisaeter EiMisra A,Tysnes BB,Chekenya MiPeters H,Lende G,Kalland KH, Oyan AM,Petersen K,Jonassen I,van der Kogel A,F(xiàn)euerstein BG, Terzis AJiBjerkvig R,Enger PO. Angiogenesis-independent tumor growth mediated by stem-like cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 20060ct 31 ;103(44) 16466-7133. Shinosaki K,Ebert 0,Suriawinata A,Thung SN, Woo SL. Prophylactic alpha interferon treatment increases the therapeutic index of oncolytic vesicular stomatitis virus virotherapy for edvanced hepatocellular carcinoma in immune-competent rats. J Virol. 2005Nov ;79 (21) :13705_1334.Shir A,Levitzki A. Gene therapy for glioblastoma :future perspective for delivery systems and molecular targets. Cell Mol Neubiol. 2001Dec ;21 645~6035. Short MP, Choi BC, Lee JK, Malick A, Breakefield XO, Martuza RL. Gene delivery to glioma cells in rat brain by grafting of a retrovirus packaging cell line. J Neurosci Res. 1990Nov ;27 (3) 427-3936.Staeheli PiPavlovic J. Inhibition of vesicular stomatitis virus mRNA synthesis by human MxA protein. J Virol. 1991Aug ;65 (8) 4498-50137. Sumia A,Curtin JF,Zirger JM,Xiong W,King GD,Barcia C,Liu C,PuntellM,Goverdhana S,Lowenstein PR, Castro MG. Inflammatory and Anti-glioma Effects of an Adenovirus Expressing Human Soluble Fms-Iike Tyrosine Kinase 3 Ligand (hsFlt3L) Treatment with hsFlt3L Inhibits Intracranial Glioma Progression. Molecular Therapy (2004) 10,1071-108438.Tani H,Komoda Y,Matsuo E,Suzuki K,Hamamoto I,Yamashita T,Moriishi K, Fujiyama K, Kanto T, Hayashi N, Owsianka A, Patel AH, Whitt MA, Matsuura Y. Replication-competent recombinant vesicular stomatitis virus encoding hepatitis Cvirus envelope proteins. J Virol. 2007Aug ;81 (16) :8601_12· Epub 2007Jun 639. Toda, Μ. ,Martuza, R. L. ,Kojima, H. & Rabkin, S. D. (1998) J. Immunol. 160, 4457-446440. Trajcevski S,Solly SK, Frisen C,Trenado A,Cosset FL, Klatzmann D. Characterization of a semi-replicative gene delivery system allowing propagation of complementary defective retroviral vectors.J Gene Med. 2005Mar ; 7(3) 276-8741. Tyminski EiLeroy SiTerada KiFinkelstein DMiHyatt JLiDanks MKiPotter PM,Saeki Y,Chiocca EA. Brain tumor oncolysis with replieation-conditional herpes simplex virus type lexpressing the prodrug-activating genes,CYP2B1 and secreted human intestinal carboxylesterase, in combination with cyclophosphamide and irinotecan. Cancer Res. 2005 Augl ;65 (15) :6850_742. Wollmann G,Robek MD, van den Pol AN. Variable deficiencies in the interferon response enhance susceptibility to vesicular stomatitis virus oncolytic actions in glioblastoma cells but not in normal human glial cells.J Virol. 2007Feb ;81 (3) :1479_9143. Zimmer G,Conzelmann KK,Herrler G. Cleavage at the furin consensus sequence RAR/KR(109) and presence of the intervening peptide of the respiratory syncytial virus fusion protein are dispensable for virus replication in cell culture. J Virol. 2002Sep ;76 (18) :9218_2權(quán)利要求
1.VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述載體包含編碼淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因且不包含編碼VSV的包膜蛋白G的功能性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述VSV的包膜蛋白G被 LCMV的GP代替。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,VSV的M蛋白包含降低 VSV的致細(xì)胞病變性的突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述假型載體包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因編碼自殺蛋白、 免疫刺激性蛋白或標(biāo)記蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述自殺蛋白是單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、細(xì)胞因子脫氨酶、FKBP-FAS或FKBP-胱天蛋白酶9。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的VSV-LCMV-GP假型載體,其特征在于,所述免疫刺激性蛋白是 IL-2、IL-4、IL-12、中和性抗 TGF β 或 Flt3L。
8.VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng),其特征在于,所述系統(tǒng)包含至少兩種互補(bǔ)復(fù)制性VSV載體,其中所述系統(tǒng)包含編碼VSV的N、L、P和M蛋白的基因n、l、p和m,編碼LCMV-GP的基因 gp,且不包含功能性的、編碼VSV的G蛋白的基因,并且其中所述系統(tǒng)的各載體缺少基因η、 1、P、m和gp之一,并且其中所缺少的基因存在于所述系統(tǒng)的其它載體上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng),其特征在于,VSV的M蛋白包含至少一個(gè)降低VSV的致細(xì)胞病變性的突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng),其特征在于,所述系統(tǒng)包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因。
11.假型化VSV病毒粒子,其特征在于,所述病毒粒子包含LCMV的GP蛋白作為包膜蛋白。
12.病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求11的假型化VSV病毒粒子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞是成人干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述成人干細(xì)胞是成人多能祖細(xì)胞(MAPC)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSC),間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或BM-TIC(源自骨髓的腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞包含用于表達(dá)選自下組的基因中的至少一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒編碼VSV的N、L、P和M蛋白的基因 η、1、ρ和m,和編碼LCMV-GP糖蛋白的基因gp。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞包含用于包裝為以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子的基因轉(zhuǎn)移載體,其中所述基因轉(zhuǎn)移載體包含轉(zhuǎn)基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因是編碼自殺蛋白、免疫刺激性蛋白和/或標(biāo)記蛋白的基因。
18.用于在體外將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法,其特征在于,用根據(jù)權(quán)利要求11的假型化VSV病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞,其中所述病毒粒子包含轉(zhuǎn)基因。
19.用于在體外將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法,其特征在于,使所述細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求16或17的病毒生產(chǎn)細(xì)胞相接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法,其特征在于,所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的VSV-LCMV-GP假型載體、根據(jù)權(quán)利要求8_10中任一項(xiàng)的VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)、根據(jù)權(quán)利要求11的假型化VSV病毒粒子、或根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于制備藥物組合物的用途,所述藥物組合物用于實(shí)體腫瘤的治療。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途,其特征在于,所述腫瘤為腦瘤。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途,其特征在于,所述腫瘤為惡性腦瘤。
24.藥物組合物,其特征在于,所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的 VSV-LCMV-GP假型載體、根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的VSV-LCMV-GP假型載體系統(tǒng)、根據(jù)權(quán)利要求11的假型化VSV病毒粒子、或根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP以代替VSV的G蛋白的重組VSV病毒和病毒載體,涉及產(chǎn)生LCMV-GP-假型化VSV病毒粒子的病毒生產(chǎn)細(xì)胞,并且涉及所述載體和細(xì)胞用于治療實(shí)體腫瘤、特別是腦瘤的用途。
文檔編號(hào)A61K35/76GK102224248SQ200980146679
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2009年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者多蘿特·馮·萊爾, 薩南·黑曼 申請(qǐng)人:多蘿特·馮·萊爾
網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
性色avwww在线观看| 高清不卡的av网站| 午夜av观看不卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 九九爱精品视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 好男人视频免费观看在线| 99久国产av精品国产电影| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av综合色区一区| 久久精品国产a三级三级三级| 一级爰片在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女人精品久久久久毛片| 五月开心婷婷网| 在线免费观看不下载黄p国产| 色94色欧美一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲精品美女久久av网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美精品一区二区大全| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 97在线视频观看| 免费在线观看黄色视频的| 在线精品无人区一区二区三| xxxhd国产人妻xxx| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲内射少妇av| 黄片播放在线免费| 老司机亚洲免费影院| 久久人人爽人人片av| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产av国产精品国产| 下体分泌物呈黄色| 色播在线永久视频| 久久久久久久久免费视频了| 精品久久久精品久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产av一区二区精品久久| 秋霞伦理黄片| 欧美+日韩+精品| 伦理电影大哥的女人| 欧美成人精品欧美一级黄| 丁香六月天网| 三上悠亚av全集在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av.在线天堂| 国产精品二区激情视频| 久久这里有精品视频免费| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 热re99久久国产66热| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日韩精品网址| 亚洲人成电影观看| 国产精品无大码| 欧美xxⅹ黑人| 高清黄色对白视频在线免费看| 捣出白浆h1v1| 成年av动漫网址| 99久久人妻综合| 久久这里有精品视频免费| 欧美日韩av久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线观看人妻少妇| 99re6热这里在线精品视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 91精品三级在线观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 高清视频免费观看一区二区| 精品人妻在线不人妻| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费看不卡的av| 一级毛片我不卡| 韩国高清视频一区二区三区| av线在线观看网站| 亚洲国产欧美在线一区| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美清纯卡通| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人91sexporn| 国产精品不卡视频一区二区| 国产成人一区二区在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一国产av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国精品久久久久久国模美| 黄色视频在线播放观看不卡| 韩国av在线不卡| 男人舔女人的私密视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 又大又黄又爽视频免费| av天堂久久9| 亚洲精品国产av成人精品| 蜜桃国产av成人99| 精品人妻在线不人妻| 熟女电影av网| 捣出白浆h1v1| videossex国产| 欧美国产精品va在线观看不卡| 麻豆av在线久日| 久久久久国产网址| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产片内射在线| 人妻人人澡人人爽人人| 又黄又粗又硬又大视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲内射少妇av| 国产精品二区激情视频| av网站免费在线观看视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美bdsm另类| av在线观看视频网站免费| 日本午夜av视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 日韩人妻精品一区2区三区| 国产97色在线日韩免费| 国产成人精品无人区| 亚洲欧洲国产日韩| 在线观看三级黄色| 热99久久久久精品小说推荐| 永久网站在线| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久久久久人人人人人人| 老汉色av国产亚洲站长工具| 人妻 亚洲 视频| 精品酒店卫生间| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产日韩欧美视频二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 波多野结衣av一区二区av| av不卡在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| tube8黄色片| 女人久久www免费人成看片| 黑丝袜美女国产一区| 深夜精品福利| 交换朋友夫妻互换小说| 91aial.com中文字幕在线观看| 各种免费的搞黄视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| www.熟女人妻精品国产| 日韩av免费高清视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美一区二区三区国产| av在线老鸭窝| 久久精品夜色国产| 久久久a久久爽久久v久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费观看性生交大片5| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美av亚洲av综合av国产av | 精品第一国产精品| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲国产成人一精品久久久| 少妇人妻 视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品自拍成人| 最黄视频免费看| 国产片内射在线| a 毛片基地| 97在线人人人人妻| 人妻 亚洲 视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲一区中文字幕在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲综合色惰| 黑人猛操日本美女一级片| 在线 av 中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 最近手机中文字幕大全| 午夜激情久久久久久久| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久欧美国产精品| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品国产av在线观看| 美女中出高潮动态图| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 丝袜人妻中文字幕| 男女国产视频网站| 亚洲综合精品二区| 成年av动漫网址| 久久久国产精品麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 寂寞人妻少妇视频99o| 中文字幕色久视频| 国产精品女同一区二区软件| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久久久国产电影| 多毛熟女@视频| 亚洲av.av天堂| 97人妻天天添夜夜摸| 成年动漫av网址| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级,二级,三级黄色视频| 1024香蕉在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 一区在线观看完整版| 国产一区二区 视频在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 自线自在国产av| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品国产三级专区第一集| 国产国语露脸激情在线看| 久久久久国产网址| 亚洲精品自拍成人| 五月伊人婷婷丁香| 多毛熟女@视频| 国产在视频线精品| 国产 精品1| 婷婷色av中文字幕| 视频区图区小说| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 婷婷色综合大香蕉| av免费观看日本| 桃花免费在线播放| 久久久久国产网址| 成人手机av| 国产成人精品婷婷| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人免费观看视频高清| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产 一区精品| 久久精品亚洲av国产电影网| av在线观看视频网站免费| 午夜精品国产一区二区电影| 国产 精品1| 免费看不卡的av| 日本黄色日本黄色录像| 在线看a的网站| 国产 一区精品| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久国内精品自在自线图片| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久网色| 涩涩av久久男人的天堂| 国产又爽黄色视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 久久99精品国语久久久| 欧美另类一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品人妻在线不人妻| 国产成人精品在线电影| 又大又黄又爽视频免费| 又黄又粗又硬又大视频| 好男人视频免费观看在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 26uuu在线亚洲综合色| 成人国产麻豆网| 99九九在线精品视频| 亚洲精品在线美女| 久久久久久人人人人人| 午夜福利,免费看| 国产国语露脸激情在线看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲综合精品二区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| av.在线天堂| 久久久久久伊人网av| 国产麻豆69| 亚洲国产色片| 国产精品不卡视频一区二区| 久久av网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 最近手机中文字幕大全| 国产精品一二三区在线看| 久久久久国产网址| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看免费高清a一片| 精品一区在线观看国产| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 一区二区av电影网| 国产人伦9x9x在线观看 | 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久久久久久精品精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲欧洲日产国产| 婷婷色av中文字幕| 久久久久国产网址| 亚洲av.av天堂| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 18禁观看日本| 黑丝袜美女国产一区| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品国产av成人精品| 18+在线观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 青春草视频在线免费观看| 免费高清在线观看日韩| 久久精品国产亚洲av高清一级| 制服人妻中文乱码| 韩国av一区二区三区四区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品 欧美亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 真人做人爱边吃奶动态| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 高清av免费在线| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| av福利片在线| 两个人看的免费小视频| 岛国在线观看网站| 亚洲第一青青草原| 1024视频免费在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 99国产精品一区二区三区| 免费av毛片视频| 亚洲人成77777在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲第一青青草原| 啦啦啦免费观看视频1| 99香蕉大伊视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲情色 制服丝袜| ponron亚洲| 日本五十路高清| 久久久久久久精品吃奶| 母亲3免费完整高清在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜影院日韩av| 性色av乱码一区二区三区2| 成人18禁在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 老司机靠b影院| 精品免费久久久久久久清纯| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费高清视频大片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品国产av在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| av电影中文网址| 久久中文看片网| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲一区高清亚洲精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲国产精品sss在线观看 | 大码成人一级视频| 麻豆久久精品国产亚洲av | 国产激情欧美一区二区| 日本 av在线| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲成a人片在线一区二区| 超碰97精品在线观看| 美女午夜性视频免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜91福利影院| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产人伦9x9x在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲自拍偷在线| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲,欧美精品.| 国产单亲对白刺激| 久久久国产一区二区| 国产精品影院久久| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜免费观看网址| 国产区一区二久久| 一本综合久久免费| a级片在线免费高清观看视频| 99国产精品免费福利视频| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜老司机福利片| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| √禁漫天堂资源中文www| 久久国产精品影院| 淫秽高清视频在线观看| 很黄的视频免费| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美日韩av久久| av在线天堂中文字幕 | 亚洲 欧美一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品免费视频内射| 欧美日本亚洲视频在线播放| 咕卡用的链子| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 中文字幕高清在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99国产精品免费福利视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 日本五十路高清| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品无人区| 在线观看免费高清a一片| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕最新亚洲高清| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 老汉色∧v一级毛片| 欧美午夜高清在线| 成人三级做爰电影| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美精品一区二区免费开放| 九色亚洲精品在线播放| 五月开心婷婷网| 国产人伦9x9x在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 中出人妻视频一区二区| 国产精品国产高清国产av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色播在线永久视频| 另类亚洲欧美激情| 日本一区二区免费在线视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 十八禁人妻一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久狼人影院| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲精品在线观看二区| 电影成人av| 欧美最黄视频在线播放免费 | 精品免费久久久久久久清纯| 咕卡用的链子| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品日产1卡2卡| 成人三级黄色视频| 宅男免费午夜| 啪啪无遮挡十八禁网站| 两人在一起打扑克的视频| 自线自在国产av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 中文字幕高清在线视频| 美女午夜性视频免费| 婷婷丁香在线五月| 村上凉子中文字幕在线| e午夜精品久久久久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 无遮挡黄片免费观看| 精品久久久久久电影网| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线免费观看的www视频| 国产激情久久老熟女| 老司机靠b影院| 99香蕉大伊视频| 激情视频va一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美乱色亚洲激情| 午夜免费观看网址| av网站在线播放免费| 午夜a级毛片| 多毛熟女@视频| 91九色精品人成在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄色a级毛片大全视频| 国产在线观看jvid| 午夜免费激情av| 无限看片的www在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲美女黄片视频| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩欧美在线二视频| 在线永久观看黄色视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 性欧美人与动物交配| 男女午夜视频在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 三上悠亚av全集在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 大香蕉久久成人网| 中文字幕最新亚洲高清| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看 | 91精品国产国语对白视频| 一级a爱片免费观看的视频| 99久久综合精品五月天人人| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日韩视频一区二区在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 淫秽高清视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 91大片在线观看| 免费高清视频大片| 丝袜美足系列| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲国产精品合色在线| 午夜福利在线观看吧| av国产精品久久久久影院| 欧美老熟妇乱子伦牲交| xxxhd国产人妻xxx| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产成年人精品一区二区 | 黄色视频不卡| av国产精品久久久久影院| 亚洲av电影在线进入| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲男人天堂网一区| 国产99久久九九免费精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 男女下面进入的视频免费午夜 | 大码成人一级视频| 黄色女人牲交| 两个人看的免费小视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 级片在线观看| 亚洲男人天堂网一区| e午夜精品久久久久久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久午夜综合久久蜜桃| 看片在线看免费视频| 欧美日韩乱码在线| 麻豆成人av在线观看| 国产av又大| 日韩精品青青久久久久久| 性色av乱码一区二区三区2| 在线观看66精品国产| 成年人黄色毛片网站| 国产深夜福利视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 韩国精品一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 精品一品国产午夜福利视频| 精品久久久久久电影网| 一区福利在线观看| 国产97色在线日韩免费| av免费在线观看网站| 欧美日韩一级在线毛片| 成人三级黄色视频| 国产高清videossex| 成人免费观看视频高清| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久久午夜电影 | videosex国产| www日本在线高清视频| 深夜精品福利|