含有乳香鋸緣青蟹提取物的協(xié)同增效消炎混合物的制作方法

專利名稱：含有乳香鋸緣青蟹提取物的協(xié)同增效消炎混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了協(xié)同增效作用的營養(yǎng)品或藥物或膳食補(bǔ)充消炎混合物， 其含有選擇性濃縮3-0-乙酰基-11-酮-β -乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)。所述的混合物可以用于預(yù)防，控制并治療炎癥和各種與炎癥相關(guān)的疾病狀況，包括哮喘，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，血管內(nèi)皮功能障礙等。本發(fā)明還包括對那些在炎癥疾病過程中會改變表達(dá)/產(chǎn)物的促炎性生物標(biāo)記蛋白或分子進(jìn)行改進(jìn)。
背景技術(shù)：
在印度的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中，乳香鋸緣青蟹(橄欖科)的樹膠脂一直被從業(yè)者用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)的治療。樹膠脂的各種提取物在實(shí)驗(yàn)動物上具有強(qiáng)烈的抗炎和抗動脈粥樣硬化活性[Cuaz-Perolin et al. , Arterioscler Thromb Vase Biol Feb 2008]。 一種乳香屬混合物分離得到的醋酸因香酚證實(shí)可用作核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑和用于抗炎化合物[Moussaieff et al.，MoI Pharmacol72，1657-1664，2007]。在過去已證實(shí)了乳香鋸緣青蟹的樹膠脂的乙醇萃取物在大鼠腹腔中性粒細(xì)胞中可抑制白細(xì)胞三烯B4的形成。白細(xì)胞三烯B4是炎癥反應(yīng)的重要中介物之一 [Ammon，H.P.T.et al.，Planta Medica,57,203(1991)]o乳香鋸緣青蟹被作為一種強(qiáng)效的抗關(guān)節(jié)炎劑[Kimmatkar et al ；Phytomedicine. 2003 Jan ； 10(1) :3_7·]，免疫調(diào)節(jié)齊[J [Pungle et al ；Indian JExp Biol. 2003 Dec ；41 (12) =1460-1462] 0乳香鋸緣青蟹能降低膽固醇也已被證實(shí)[Zutshi U et al, Indian J Pharmac. 18，182-183，1986.]。實(shí)事上，用乳香提取物在一群具有膝蓋骨關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行隨機(jī)，雙盲目，安慰劑對照，交叉臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)意義即改善了所涉及到的疼痛減少，水腫縮小和膝關(guān)節(jié)屈曲增加flexion [Kimmatkar N, et. al.，Phytomedicine 2003 ；10 :3-7]，在一開放性的，非隨機(jī)等效性的研究中，30例慢性結(jié)腸炎患者要么使用乳香樹膠(300毫克每日三次)要么水楊酸偶氮磺吡啶(1克每日三次)，乳香顯示的治療效果比得上水楊酸偶氮磺吡啶顯示的效果[Gupta I，et. al.，Planta Med. 2001 ；67 391-395]。在另一個等效性的研究中，在一個隨機(jī)，雙盲目對克隆氏病患者上研究得到乳香標(biāo)準(zhǔn)化提取物表現(xiàn)出與5-氨基水楊酸具有相當(dāng)或更好的療效[Gerhardt H，et. al.，Z Gastroenterol 2001;39:11-17]。在對改善具有支氣管哮喘患者進(jìn)行為期六周，雙盲目， 安慰對照研究中，乳香樹膠脂也顯示出具有統(tǒng)計(jì)意義[Gupta I, et.al. , Eur J Med Res 1998 ；3 511-51]。專利也描述了各種乳香的活性。若干引述如下PCT專利申請公開號W003074063A1和印度專利#205269中涉及一種用于生產(chǎn)餾分濃縮到100%的3-0-乙?；?11-酮-β -乳香酸的方法。用有機(jī)溶劑從乳香物種中提取的樹膠脂首先容易受到氧化，然后乙酰化，反之亦然。這些變化會降低強(qiáng)效乳香酸在AKBA餾分中的存在。這些精制過的餾分受到進(jìn)一步的通過層析分離技術(shù)的純化和分離來提高其純度并從中去除污染物。這個方法提供一個用于治療應(yīng)用的餾分濃縮到10-100% AKBA的應(yīng)用。
歐洲專利申請公開EP1637153A1涉及到乳香鋸緣青蟹與作為藥物特別是抗炎癥和纖維化過程的植物抗纖維化劑的聯(lián)合應(yīng)用。在這種應(yīng)用中，乳香鋸緣青蟹是以分量為重量5-50%的干燥提取物存在，和植物抗纖維化劑以分量為重量50-95%的干燥提取物存在。 美國專利US5629351中涉及一新餾分包括乳香酸的混合物，其特征在于該餾分具有抗炎和抗?jié)兓钚?。同時還揭露了一種具有抗炎，抗關(guān)節(jié)炎和抗?jié)兓钚缘男氯橄闼峄衔?。同時還揭露一種用于從乳香酸中分離乳香酸餾分和單體的方法。美國專利US5720975中涉及一種香(乳香)，香提取物，含有香物質(zhì)，其生理學(xué)上可接受的鹽，其衍生物和其生理鹽，純?nèi)橄闼?，其生理學(xué)上可接受的鹽，其衍生物，其衍生物的鹽，用于生產(chǎn)阿爾茨海默氏病的預(yù)防或治療藥物的應(yīng)用。美國專利US5888514中涉及一種治療具有骨骼或關(guān)節(jié)發(fā)炎特征狀況的哺乳動物，含有一種組成成分是乳香鋸緣青蟹提取物的混合物。PCT專利申請公開W008036932A2中涉及一種用采自具有獨(dú)特的升高揮發(fā)油，乳香酸和多糖化合物的乳香物種(乳香或乳香)來制造混合物，特別是人類口服給藥制劑，和用這種混合物對如用于治療/預(yù)防關(guān)節(jié)炎，炎癥性疾病，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕疾病和低腰痛有用的方法的混合物和方法。然而，本發(fā)明人所知，現(xiàn)有技術(shù)還沒有涉及到本發(fā)明包括的乳香提取物特別是 AKBA濃縮提取物與乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE) —起，控制和治療炎癥性疾病的混合物。發(fā)明概述本發(fā)明公開了協(xié)同增效作用的營養(yǎng)品或藥物或膳食補(bǔ)充消炎混合物，其含有選擇性濃縮3-0-乙酰基-1 1-酮- β -乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹或成分以及乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)形成的治療效果組合。所述的混合物可以用于預(yù)防，控制并治療炎癥和各種與炎癥相關(guān)的疾病狀況，包括哮喘，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，血管內(nèi)皮功能
障礙等。本發(fā)明另一方面提供了協(xié)同增效作用的混合物，其含有濃縮的AKBA提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物，能夠預(yù)防，控制及治療一種或多種消炎及與疾病相關(guān)的成分，所述的疾病非限制性地包括哮喘，動脈粥樣硬化，內(nèi)皮功能障礙，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，過敏性鼻炎，皮炎，牛皮癬，囊腫性纖維化，炎性腸道疾病，多發(fā)性硬化癥，糖尿病，認(rèn)知障礙障礙，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，膠原蛋白合成癥，抗衰老癥，代謝性疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，葡萄膜炎，后血管成形術(shù)后再狹窄，腎小球腎炎，胃腸過敏癥，腎炎，結(jié)膜炎，慢性阻塞性肺疾病， 職業(yè)性哮喘，濕疹，支氣管炎，花粉癥，蕁麻疹，過敏性疾病以及氣喘，呼吸困難，非生產(chǎn)性咳嗽，胸悶條件，頸部肌肉緊張，心跳加速，胸痛，關(guān)節(jié)痛等各種狀況和哺乳動物相關(guān)的其它狀況。本發(fā)明還有一方面是提供了協(xié)同增效作用的混合物，其含有濃縮AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)，能預(yù)防，控制及治療一種或多種其它炎癥疾病的成分，所述的疾病非限制性地包括關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎的非限制性實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(如軟組織風(fēng)濕病和非關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，纖維肌痛，纖維組織，肌肉風(fēng)濕，肌筋膜痛，肱骨外上髁炎，肩周炎，蒂策綜合征，筋膜炎，肌腱炎，腱鞘炎，滑囊炎)，幼年慢性病，關(guān)節(jié)紊亂，強(qiáng)直性脊椎炎(強(qiáng)直性脊椎炎)，骨關(guān)節(jié)炎，高尿酸血癥和急性痛風(fēng)，慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和退化性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還有一個 目的是提供協(xié)同增效作用的混合物，它能改進(jìn)與炎癥和/或炎癥類疾病，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，軟骨退化有關(guān)的生物分子或生物標(biāo)記的表達(dá)和/或制備，其非限制性地包括哺乳動物中的5-脂氧合酶(5-L0X)，5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)， 巨噬細(xì)胞/脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白-2(aP2/FABP)，干擾素-γ (IFN-γ ),白細(xì)胞介素-4(IL-4)，細(xì)胞間粘附分子(ICAM)-I，血管細(xì)胞粘附分子(VCAM)-I，基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) _3，月中 TNF- α 禾口 IL—1 β。


圖I 圖中所示的結(jié)構(gòu)式1-9是乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的典型化合物。圖II 圖中所示的HPLC色譜顯示了乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的植物化學(xué)情況。圖III 圖中所示的免疫印跡顯示了 5-脂氧合酶㈧和FLAP⑶的BE30% -誘導(dǎo)抑制在人體單核細(xì)胞THP-I細(xì)胞中的表達(dá)。在每個圖中，柱形圖代表了常規(guī)的密度值(任意單位)。柱a，b和c分別代表空白，LPS處理的和LPS+BE30%處理的細(xì)胞。圖IV 圖中顯示了選擇性濃縮3-0-乙?；?11-酮-β -乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物[ΒΕ30% ]，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)和混合物_2中的5-脂氧合酶抑制劑活性。其中的柱子代表BE30%，BNRE和混合物_2在25 μ g/mL的濃度下顯示的5-脂氧合酶抑制百分率。圖V 圖中是選擇性濃縮3-0-乙酰基-11-酮-β -乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物[ΒΕ30% ]，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)和混合物_2對基質(zhì)金屬蛋白酶(ΜΜΡ-3)產(chǎn)生的抑制。柱子代表ΒΕ30%，BNRE和混合物_2在TNF α誘導(dǎo)SW982人體滑液細(xì)胞中的50%抑制濃度(IC50)。柱子的值代表相應(yīng)的IC50值。圖VI 圖中顯示的柱形圖表示了選擇性濃縮3-0-乙?；?11-酮-β-乳香酸 (AKBA)至30%的乳香鋸緣青蟹提取物(BE30%，100mg/kg)和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE) (100mg/kg)，BE30%禾口 BNRE 比分別為 1 1 和 2 1 的混合物 _1 (100mg/kg) 和混合物-2(100mg/kg)，潑尼松(10mg/kg)對弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的SD大鼠的爪水腫體積抑制百分比。圖VII 圖中所示的柱形圖表示在不同組動物中血清TNFa (A)和IL-I β⑶的濃度。FCA激發(fā)14天后，可以用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D系統(tǒng)，美國)檢測血清TNFa (A)和 IL-I β⑶的數(shù)量。a-f柱分別代表加有對照，脫氫皮質(zhì)醇(10mg/kg)，BE30% (100mg/kg), BNRE (100mg/kg)，混合物-l(100mg/kg)和混合物_2 (lOOmg/kg)細(xì)胞因子水平。每個柱子代表士SD. N = 6，*Ρ0· 05 和 < 0. 005 (與對照相比)
具體實(shí)施例方式炎癥是血管組織在病原體，受損細(xì)胞或過敏劑等進(jìn)入人體時產(chǎn)生的一種應(yīng)答。它是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，這樣能夠清除有害的病原體或作用劑，保護(hù)組織。促炎癥細(xì)胞因子，如 TNF α、IL-I β、IL-6、GM-CSF 和 CD4+、Th2 亞群衍生的 IL-4、IL-5 和 IL-13 淋巴因子可以作為炎癥性疾病的免疫發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因素考慮[Knight D A, et. al.，J. Allergy CHn. Immunol. 2001 ； 108 797-803]。5-脂氧合酶在炎性過程的關(guān)鍵步驟，即花生四烯酸合成白三烯中是一種關(guān)鍵的酶。白三烯是炎癥性疾病中的關(guān)鍵中間體。

5-脂氧合酶(5-L0X)的激活和基因表達(dá)是由病情決定的。5_脂氧合酶激活蛋白 (FLAP)是一個ISkDa組成的膜蛋白，它與花生四烯酸特異地結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為所述的酶來激活5-脂氧合酶[Mancini et. al.，1993]。于是FLAP就能應(yīng)答白三烯的產(chǎn)物。從而使阻斷或下調(diào)5-L0X和FLAP成為一種治療和控制炎癥狀態(tài)的新療法。動脈粥樣硬化也是一種炎癥性疾病，它是因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞功能障礙處幾十年形成的動脈損傷引起的。炎癥在動脈粥樣硬化斑塊不斷發(fā)展的許多階段發(fā)揮了重要作用。[KK Berg et al. , Scandinavian Journal of Immunology,69,36-42]基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性內(nèi)肽酶，它可以破壞所有的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，如膠原蛋白，它們通常在組織細(xì)胞的間隙中被發(fā)現(xiàn)。MMPs首先被分為三個主要的類，膠原酶形成的纖維細(xì)胞膠原酶-1 (MMP-I)，包括明膠酶A (MMP-2)和明膠酶B (MMP-9)的明膠酶，以及包括基質(zhì)降解酶-1蛋白酶(MMP-3)和基質(zhì)溶解酶(MMP-7)的基質(zhì)降解酶。過量的基質(zhì)金屬蛋白酶會使膠原蛋白，蛋白多糖和明膠等生物分子降解，這會使表皮上產(chǎn)生致使的結(jié)果，也會形成軟骨，炎癥等疾病。選擇性濃縮AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物(BE30%)多年來，乳香樹脂和提取物一直用于治療炎癥性疾病。乳香酸被發(fā)現(xiàn)可作為對乳香鋸緣青蟹產(chǎn)生有益效果的活性化合物。所述的低分子化合物3-0-乙?；?11-酮-β -乳香酸(AKBA)被發(fā)現(xiàn)是所有乳香酸中最有效的5-脂氧合酶抑制劑[Sailer ER et. al., British J Pharmacology. 1996,117(4) :615_8]。因此推定 AKBA 溶液中濃縮獲得的這些提取物或成分的效果比天然提取物的效果更好。發(fā)明人在其2005年5月7日遞交的申請?zhí)枮镻CT/IN05/000074，公開號為W003074063A1，進(jìn)入印度獲得授權(quán)的專利號為205269的 PCT申請中說明了一種從商用乳香鋸緣青蟹提取物中選擇性濃縮30-100%的AKBA，從而制備乳香鋸緣青蟹提取物的方法，所述的乳香鋸緣青蟹用滴定分析法測定含有約85 %的純?nèi)橄闼?，用HPLC分析法測定含有約3%的AKBA。所述的濃縮的乳香提取物是一種單一成分的化合物，它不含有普通乳香鋸緣青蟹中通常含有的大量三萜成分，除了 AKBA，AKBA 在普通的乳香提取物中是一種低含量的成分(到達(dá)3%)，但是它是所述的濃縮提取物的主要成分。普通乳香提取物中存在的成分為1) β _乳香酸，2) 3-0-乙?；?β -乳香酸， 3) 11-酮-β-乳香酸，4) 3-0-乙酰基-11-酮-β-乳香酸，5)9-烯-β-乳香酸，6)3 α-羥基-9，11-二烯-24-烏蘇酸，7)2 α，3 α-羥基-12-烯-24-烏蘇酸。本發(fā)明所述混合物中使用的AKBA中濃縮獲得的單一乳香鋸緣青蟹提取物的主要成分是1)3-0-乙?；橄闼?，2) 3-0-乙?；?9 (11)-脫氧-β -乳香酸，3) 3-0-乙?；?11-酮-β -香樹精，4) 3-0-乙酰基-11-酮-α-乳香酸。所述的乳香鋸緣青蟹提取物用試管分析檢測數(shù)次，發(fā)現(xiàn)其含有30 % ΑΚΒΑ(ΒΕ30% )，這個含量高于商用乳香鋸緣青蟹提取物中所含的3% AKBA(BE3% ) [RoyS. Kanna，et. al.，DNA and Cell Biology, 2005, 24 (4) :244_255]。在多個直接比較的實(shí)驗(yàn)中，所述濃縮的乳香鋸緣青蟹提取物(BE30% )在威斯塔阿爾比諾小鼠中抑制佐劑引起的炎癥應(yīng)答所獲得的效果也明顯高于天然的含有3% AKBA的乳香提取物[Roy S, et al., Antioxidants & Redox Signaling，8，3& 4, 2006] 乳香鋸緣青蟹提取物選擇性地濃縮至 30% AKBA(BE30% )可以用于本發(fā)明的示范。乳香鋸緣青蟹非酸件樹脂提取物(BNRE)
所述的乳香鋸緣青蟹樹脂含有酸性化合物，非酸性化合物和糖。在使用商用方法處理普通的乳香鋸緣青蟹提取物(85%乳香酸總含量，BE3% )時，所述的主要含有乳香酸等三萜酸的成分會從剩余的樹脂成分中分離出來。所述的糖和其它聚合物材料也會在所有乳香酸的濃縮過程中分離出來，進(jìn)入水相。剩余的不溶于水的非酸性低極性化合物會分離出來成為乳香油成分/提取物。這些非酸性或中性的低極性化合物既可以以低濃度的含量存在于商用乳香提取物和AKBA濃縮的乳香提取物中，也可以不存在。這些非酸性成分的含量甚至可以低于含量增加的濃縮AKBA的含量。所述的非酸性乳香油已經(jīng)是乳香鋸緣青蟹樹膠脂中一種重要的成分。但是它具有非常有限的商業(yè)利用價(jià)值，因此主要被作為一種廢料。這部分的潛在利用已經(jīng)延誤很長日期。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種不可預(yù)料的乳香鋸緣青蟹油的利用方法，即將其用于制備協(xié)同增效作用的混合物。乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)，將乳香鋸緣青蟹油中的揮發(fā)性油去除獲得的一種成分已經(jīng)在本發(fā)明中使用。乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)已經(jīng)通過下述方法獲得，a)過濾分離甲基異丁基酮(MIBKW)溶劑和不溶性膠材料中散布的乳香鋸緣樹膠脂，b)用2%的氫氧化鉀溶液反復(fù)萃取MIBK溶液，從而去除酸性成分，c)然后先后用水和鹽水沖洗MIBK層，d)在60-70°C下減壓蒸發(fā)MIBK層，于是在75-85°C的真空下將油性殘留物中的揮發(fā)性成分去除，獲得一種粘性油，下文中將稱之為乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物或BNRE?；蛘咚龅腂NRE也可以這樣制備獲得a)制備乳香鋸緣青蟹樹脂的乙醇提取物，b)在一種水堿性溶液和一種不溶于水的有機(jī)溶劑之間分離出乙醇提取物，c) 分離出所述的有機(jī)溶劑層，然后蒸發(fā)掉溶劑，獲得非酸性乳香油提取物，d)高溫真空下去除揮發(fā)性成分，獲得乳香鋸緣非酸性樹脂提取物(BNRE)。上述乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)不可預(yù)料地發(fā)現(xiàn)具有一種單一化合物。發(fā)明人反復(fù)利用柱層析法和高效液相色譜法獲得大量的單獨(dú)BNRE，分離出各種二萜和三萜類化合物。這些合物的結(jié)構(gòu)可以利用IH NMRU3C NMR、DEPT、HSQC和 HMBC、質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。如圖1所示，這些鑒定的化合物是愈創(chuàng)奧醇(guiol) (1)、西松烷酚醇(η印hthenol) (2)、鋸緣青蟹醇(serratol) (3)、二萜 X(diterpene X) (4)、羽扇豆醇(Iupeol) (5)、齊墩果-12-烯-3 β -醇(olean-12-enne-3 β _ol) (6)、 齊墩果-12-烯-3 α -醇(olean-12-enne-3 α -ol) (7)、羊毛甾-8，24- 二烯 _3 α -醇 (lanosta-8,24-dienne_3 α -01) (8)禾口烏蘇-12-煉 _3 α -醇(urs-12-enne-3 α -01) (9)。 所獲得的純化合物可以作為植物化學(xué)標(biāo)記使用，使乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE) 規(guī)范化。所述的植物化學(xué)分析的結(jié)果如表1所列，圖II顯示了 BNRE植物化學(xué)情況的色譜圖。含有乳香提取物的協(xié)同增效混合物發(fā)明人用大量的選擇性濃縮了 AKBA的乳香提取物和乳香鋸緣青蟹提取物進(jìn)行了多次的細(xì)胞體外消炎研究。這些研究不可預(yù)料地顯示了所述的選擇性濃縮了 30%的 3-0-乙?；?11-酮-β-乳香酸(AKBA) [ΒΕ30%]的乳香鋸緣青蟹提取物潛在地下調(diào)了體外THP-I人體-單核-巨噬細(xì)胞中LPS的5-L0X和FLAP誘導(dǎo)表達(dá)(圖III)。 所述的物選擇性地濃縮了 AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物于是和一些選擇性的成分混合獲得具有較好消炎活性的混合物。檢測所述的單一成分的提取物和所述的混合物的抑制5-脂氧合酶(5-L0X)效果。最后驚人的發(fā)現(xiàn)一種由含有30%選擇性濃縮的 AKBA(BE30%)的乳香鋸緣青蟹樹膠脂和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)組合的混合物具有協(xié)同增效抑制5-L0X性能。所述的混合物-2由2 1質(zhì)量比的BE30%和BNRE組成，它在25μ g/mL濃度時具有37. 7 %的抑制性，而BE30%和BNRE在相同濃度時的抑制性分別為31. 8%和20. 6%。圖IV顯示了混合物-2及其中單獨(dú)成分對5-脂氧合酶抑制性的比較。然后檢測濃縮了 30% AKBA(BE30% )的乳香鋸緣青蟹提取物，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)和混合物-2對TNF α誘導(dǎo)的SW982人體滑液細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-3 (ΜΜΡ-3)產(chǎn)物的抑制性。所述的細(xì)胞自由培養(yǎng)上清中的ΜΜΡ-3產(chǎn)物用ELISA變化試劑盒(R&D System,Minneapolis,MN,USA)進(jìn)行檢測。出人意料地是，所述的混合物_2對滑液細(xì)胞中的MMP-3產(chǎn)物顯示出比那些單獨(dú)成分，即BE30%和BNRE更好的抑制性，從而證實(shí)了它對5-L0X的協(xié)同增效抑制?；旌衔颻2，BE30%和BNRE分別在46. 78，58. 75和119. 32 μ g/ mL的濃度下均產(chǎn)生50%的抑制濃度(IC50)。圖V中總結(jié)了混合物-2的協(xié)同增效抑制MMP-3 活性與其中的單獨(dú)成分BNRE和BE30%的比較。于是在SD大鼠的弗氏完全佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型體內(nèi)檢測混合物-2的體內(nèi)協(xié)同增效作用效果。所述的混合物-1和混合物_2，它們所含的選擇性濃縮了 30% 3-0-乙?；?1 1-酮-β-乳香酸(ΒΕ30%)的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣非酸性樹脂提取物(BNRE) 的質(zhì)量比分別為1 1和2 1，在SD大鼠的弗氏完全佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型體內(nèi)分別檢測它們的消炎效果，并將其與它們所含的單獨(dú)成分，ΒΕ30%和BNRE的效果相比較。治療組大鼠每公斤體重補(bǔ)充IOOmg的選擇性濃縮至30% ΑΚΒΑ(ΒΕ30% )的乳香提取物或乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)或混合物-1或混合物_2，并持續(xù)14天。所述的陽性對照組大鼠每公斤體重補(bǔ)充IOmg的脫氫皮質(zhì)醇。14天后，將弗氏完全佐劑皮下注射到每個動物的左后肢腳掌的分跖區(qū)。28天后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。規(guī)律間隔地從每個動物上收集血液樣本，并在FCA 注入的那天及FCA接種后第13天用體積描述設(shè)備測量爪子的體積。爪水腫體積的變化是對炎癥的應(yīng)答。所述的ΒΕ30%，BNRE,混合物-1，混合物_2和脫氫皮質(zhì)醇的體內(nèi)消炎應(yīng)答是通過測量與CMC補(bǔ)充對照相比較而言抑制爪水腫的百分率檢測的。補(bǔ)充了 30% AKBA的乳香鋸緣蟹青(BE30% )和乳香鋸緣蟹青非酸性樹脂提取物 (BNRE)的治療組分別顯示了 37%和10%的爪水腫減少率。但是，補(bǔ)充了混合物_1和混合物-2的治療組在相同的劑量水平下顯示了更好的爪水腫減少率，它們分別達(dá)到了 44%和 54的爪水腫減少率。所述的補(bǔ)充了脫氫皮質(zhì)醇的陽性對照組在10mg/kg劑量水平時是53% 的抑制率。圖VI中總結(jié)的結(jié)果證明了本發(fā)明混合物-1&-2的體外協(xié)同增效作用效果。此外還檢測了治療組和對照組的血清中所含的生物標(biāo)記，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白細(xì)胞介素1β (IL-Ιβ)水平。如圖VII所示(Α和B)，補(bǔ)充了混合物_1 和混合物_2的治療組與補(bǔ)充了單獨(dú)成分ΒΕ30 %和BNRE相比，具有更好地降低了生物標(biāo)記， TNF-α 和 IL-I β 水平。因此，上述數(shù)據(jù)說明由AKBA濃縮的乳香提取物和乳香鋸緣蟹青非酸性樹脂提取物(BNRE)組合的混合物與相同劑量水平的單獨(dú)成分相比，是更強(qiáng)效消炎劑，這些提取物結(jié)合產(chǎn)生了一種無法預(yù)料的協(xié)同增效作用。 含有30 % 3-0-乙?；?11-酮-β -乳香酸(AKBA)的選擇性濃縮乳香鋸緣提取物在本發(fā)明中被舉例說明。但是任意其它AKBA質(zhì)量含量從10% -100%的選擇性濃縮乳香鋸緣提取物也可以與乳香鋸緣青蟹非酸性樹酯提取物(BNRE)混合制成協(xié)同增效混合物。AKBA質(zhì)量含量從10% _100%的濃縮乳香鋸緣青蟹提取物可以用下述一種或多種方法制備而成，它們非限制性地包括(1)使用發(fā)明人在其2005年5月7日遞交的申請?zhí)枮?PCT/IN05/000074,公開號為W003074063A1，進(jìn)入印度獲得授權(quán)的專利號為205269的PCT申請中公開的方法將商用乳香鋸緣青蟹提取物中其它β _乳香酸轉(zhuǎn)化為35-45%的AKBA提取物，(2)然后用藥物或食物可接受的載體或稀釋劑稀釋轉(zhuǎn)化產(chǎn)物使AKBA含量為10-45%或 (3)使用一些步驟的組合來純化上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，使AKBA含量為90-99%，所述的步驟非限制性地包括柱層析，分離，結(jié)晶等，然后用藥物或食物可接受的載體或稀釋劑或低濃度的商用乳香鋸緣青蟹提取物來稀釋純化后的ΑΚΒΑ，直到達(dá)到預(yù)計(jì)的AKBA濃度(20-99% )，(4)或者純化樹膠脂中天然存在的ΑΚΒΑ，使之達(dá)到一個在10-90%之間的預(yù)計(jì)濃度，使用一些步驟的組合，所述的步驟非限制性地包括濃縮，柱層析，分離，結(jié)晶等，然后用藥物或食物可接受的載體或稀釋劑或低濃度的商用乳香鋸緣青蟹提取物來稀釋高百分率的成分。下面將概述本發(fā)明的不同實(shí)施例本發(fā)明一方面提供了協(xié)同增效消炎混合物，其含有選擇性濃縮了 3-0-乙?；?1 1-酮-β-乳香酸(AKBA)的乳香提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)。所述的混合物可以用于預(yù)防或治療或治療炎癥和/或與炎癥相關(guān)的一種或多種疾病狀態(tài)。本發(fā)明的另一個方面是發(fā)現(xiàn)選擇性濃縮了 AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)以某個特定比例混合的混合物在有效治療質(zhì)量時能產(chǎn)生一個協(xié)同增效增效的消炎效果，這個效果比混合物中的單獨(dú)成分所產(chǎn)生的效果更好，并且對促炎性生物分子/蛋白標(biāo)記的表達(dá)或產(chǎn)物具有一個協(xié)同增效的改進(jìn)。本發(fā)明還有一個方面是提供了含有選擇性濃縮了 AKBA提取物的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的協(xié)同增效混合物對與炎癥相關(guān)的生物分子/生物標(biāo)記/某些氧化還原敏感的促炎性基因的表達(dá)和產(chǎn)物的改進(jìn)，它們非限制性地包括的動物體中必需的5-脂氧合酶(5-L0X)，5-脂氧合酶活性蛋白(FLAP)，巨噬細(xì)胞/脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2/FABP)，IFN- γ，IL_4，ICAM，VCAM，ΜΜΡ-3和MMP-I等基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，NFKB TNF- α 禾口 IL-1 β。本發(fā)明還有另一個方面是提供了含有選擇性濃縮了 AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的協(xié)同增效混合物來預(yù)防，控制并治療與炎癥相關(guān)的一種或多種疾病狀態(tài)，所述的炎癥非限制性地包括哮喘，動脈粥樣硬化，內(nèi)皮功能障礙，過敏性鼻炎，皮炎，牛皮癬，囊腫性纖維化，炎性腸道疾病，間質(zhì)性膀胱炎，偏頭痛，心絞痛，慢性前列腺炎，陽光灼傷，牙周疾病，多發(fā)性硬化癥，葡萄膜炎，后血管成形術(shù)后再狹窄， 腎小球腎炎，胃腸過敏癥，腎炎，結(jié)膜炎，慢性阻塞性肺疾病，職業(yè)性哮喘，濕疫，支氣管炎， 花粉癥，蕁麻疹，過敏性疾病和氣喘，呼吸困難，非生產(chǎn)性咳嗽，胸悶條件，頸部肌肉緊張，心跳加速，胸痛，關(guān)節(jié)痛，紫外線照射引起的膠原蛋白降解，皮膚皺紋和皮膚老化等各種狀況和哺乳動物相關(guān)的其它狀況。
本發(fā)明還有一個方面是提供了含有選擇性濃縮了 AKBA提取物的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的協(xié)同增效混合物來預(yù)防，控制并治療炎癥，關(guān)節(jié)炎，認(rèn)知障礙障礙，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，阿爾茨海默氏病，膠原蛋白降解，皮膚老化，膽固醇降低，代謝紊亂和癌癥中的一種或多種。關(guān)節(jié)炎的非限制性實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (如軟組織風(fēng)濕病和非關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，纖維肌痛，纖維組織，肌肉風(fēng)濕，肌筋膜痛，肱骨外上髁炎，肩周炎，蒂策綜合征，筋膜炎，肌腱炎，腱鞘炎，滑囊炎)，幼年慢性 病，關(guān)節(jié)紊亂，強(qiáng)直性脊椎炎(強(qiáng)直性脊椎炎)，骨關(guān)節(jié)炎，高尿酸血癥和急性痛風(fēng)，慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和退化性關(guān)節(jié)炎。 在另一個優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了一種制備乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的方法，其包括有一種不溶于水的有機(jī)溶劑提取乳香鋸緣青蟹的樹膠脂，然后用一種水堿性溶液，如氫氧化鉀溶液沖洗掉有機(jī)溶劑，接著用水和鹽水沖洗，于是在真空中最后蒸發(fā)掉有機(jī)層，并在高溫真空下去除揮發(fā)性化合物獲得BNRE。所述的不溶于水的有機(jī)溶劑可以是正己烷，氯仿，二氯甲烷，醋酸乙酯，甲基異丁基酮或任何其他不溶于水的溶劑或它們的混合物。在另一個實(shí)施例中，所述的乳香鋸緣青蟹原油也可以替換BNRE來用于制備所述的協(xié)同增效的混合物。在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了制備混合物的方法，其包括以下步驟(a)用一種不溶于水的有機(jī)溶劑提取乳香鋸緣青蟹樹膠脂，過濾提取物，完全地去除未溶解的殘留材料，然后用一種水堿性溶液，如氫氧化鉀溶液反復(fù)沖洗有機(jī)溶劑，接著先后用水和鹽水沖洗，于是在真空中最后蒸發(fā)掉有機(jī)層，并升高溫度去除溶劑，然后在高溫真空下去除油性殘留物中的揮發(fā)性化合物獲得乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)，(b)選擇性濃縮乳香鋸緣青蟹樹膠脂的酸性提取物，獲得濃縮至質(zhì)量含量 10-100% AKBA(BE)的乳香鋸緣青蟹提取物，(c)將乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)與濃縮了 AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物以預(yù)計(jì)的比率混合，獲得本發(fā)明的混合物。(d)將所述的混合物選擇性地與一種或多種生物或藥物可接受的賦形劑，稀釋劑和添加劑成分混合。上述步驟中所述的不溶于水的有機(jī)溶劑可以是正己烷，氯仿，二氯甲烷，醋酸乙酯，甲基異丁基酮，叔丁醇或任何其他不溶于水的溶劑。濃縮AKBA必需的乳香鋸緣青蟹樹膠脂酸性提取物可以使用一種公知的方法從樹膠脂中制備獲得，或者用一組市售的乳香鋸緣青蟹提取物標(biāo)定的乳香酸，優(yōu)選用一種提取物通過滴定分析法標(biāo)定的約含85%的總酸。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE) 的方法，其包括下述步驟a)鑒定BNRE中作為標(biāo)記的的主要化合物，分離出它們使其純度>98%，然后使用光譜數(shù)據(jù)來識別它們；b)將每種標(biāo)記化合物以一個公知的量單獨(dú)地注入到一個菲羅門Lima苯基己基色譜柱(4.6X250mm，5y)中，將色譜柱安裝到一個具有PDA探測器的HPLC系統(tǒng)中，其中所述的色譜柱保持在30°C的溫度，并用一種雙溶劑混合物洗提，包括分別為27%和73%的 0. 1% ν/ν正磷酸的水溶液和乙腈，流速為1. 5mL/min，然后使用UV檢測儀檢測每個標(biāo)記在 2IOnm和248nm下的停留時間和峰面積；然后c)在相似的條件下分析一種已知量的BNRE樣本，比較樣本與那些標(biāo)準(zhǔn)樣的峰值停留時間，選擇性地將樣本與每種標(biāo)記共注入，并通過比較其峰值面積與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的峰值面積來檢 測每種標(biāo)記在樣本中的百分率，然后d)計(jì)算所有標(biāo)記共同的百分率，獲得BNRE的組成，其非限制性地包括西松烷酚醇(Mphthenol)、鋸緣青蟹醇(serratol)、二萜X (diterpene X)、羽扇豆醇 (Iupeol)、齊墩果-12-烯-3 β -醇(olean-12-ene-3 β -ol)、齊墩果-12-烯-3 α -醇 (olean-12-ene-3 α -01)、羊毛留 _8，24- 二煉 _3 α -醇(lanosta—8，24-diene_3 α -01)禾口烏蘇-12-烯-3 α -醇(urs-12-ene-3 α -ol)和愈創(chuàng)奧醇(guiol)，然后使用所述的混合物與BNRE的其它樣本進(jìn)行比較。在本發(fā)明的另一個方面，所述的含有選擇性濃縮了 AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的協(xié)同增效的消炎混合物可以選擇性地含有一種或多種藥物或保健品或食物可授受的賦形劑或稀釋劑或鹽或添加劑。本發(fā)明的其它實(shí)施例還提供了以粉碎的形式和/或未變性型，如粒狀或粉末或糊狀地利用，或者加入一種傳統(tǒng)的生物或藥物可接受的鹽或添加劑或賦形劑使其活性成分形成一種固體，半固體或液體劑型。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的新型混合物的治療有效量，它以一個特定的劑型給藥，如口服，外用，經(jīng)皮給藥，腸外或在一個試劑盒的形式給所需的目標(biāo)或病人使用。形成本發(fā)明所述混合物的特定劑型非限制性地包括口服劑，如片劑，軟膠囊， 硬膠囊劑，丸劑，顆粒劑，散劑，輸液，注射液，霜，凝膠，乳液，藥膏，灌腸，藥用包裝，食品補(bǔ)充劑，乳液，懸浮液，糖漿，顆粒，吸入劑，口腔噴劑等；以及注射，滴注，栓劑等注射劑。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供了一種試劑盒，其包括選擇性濃縮了 3-0-乙?；?11-酮-β-乳香酸(AKBA)的乳香提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的混合物。所述的試劑盒還包括使用所述的混合物來控制，預(yù)防并治療炎癥及非限制性地包括哮喘，關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等炎癥狀態(tài)的使用說明書。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述的混合物還包括一種或多種藥物或保健品或食物可接受試劑的有效量，它們非限制性地包括抗氧化劑，適應(yīng)原劑，消炎劑，防止糖尿病劑， 防止肥胖劑，防止動脈粥樣硬化劑，生物保護(hù)劑和/或生物可用性增強(qiáng)劑和微量金屬或一種賦形劑或藥物可接受的鹽或添加劑，以及上述成分的混合物，它們可以使用上述方法規(guī)范地給藥。本發(fā)明中使用的藥物可接受的消炎劑實(shí)例非限制性地包括脫氫皮質(zhì)醇，氫化可的松，甲氨蝶呤，柳氮磺胺吡啶，萘普生，雙氯芬酸和布洛芬。本發(fā)明中使用的生物或藥物可接受載體實(shí)例非限制性地包括表面活性劑，賦形齊 ，粘合劑，稀釋劑，粉碎機(jī)，潤滑劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，緩沖液，懸浮液和藥物輸送系統(tǒng)。固體載體或稀釋劑或賦形劑的優(yōu)選實(shí)施例非限制性地包括葡萄糖，果糖，蔗糖，麥芽糖，黃糊精，白糊精，氣溶膠，微晶纖維素，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，山梨糖醇，甜菊糖甙，玉米糖漿，乳糖，檸檬酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸，乳酸酸，L-抗壞血酸和dl- α -維生素Ε，甘油，丙二醇，甘油脂肪酸酯，聚甘油脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯，失水山梨醇脂肪酸酯， 丙二醇脂肪酸酯，阿拉伯樹膠，卡拉膠，酪蛋白，明膠，果膠，瓊脂，B族維生素，煙酰胺，泛酸鈣，氨基酸， 鈣鹽，色素，香精和防腐劑。液體載體(稀釋液)的優(yōu)選實(shí)施例包括蒸餾水，生理鹽水，葡萄糖水溶液，酒精 (如乙醇)，丙烯乙二醇和聚乙二醇；以及各種動物和植物油等含油載體，白軟蠟，石蠟和蠟。在本發(fā)明的優(yōu)選性方面，本發(fā)明所述的混合物還可以是控釋片形式，通過現(xiàn)有技術(shù)中公知的納米，微膠囊，膠體載波系統(tǒng)與其他藥物輸送系統(tǒng)等技術(shù)使用控釋聚合物基涂層。所述的形式可以一天給藥一次或一天給藥多次。如本發(fā)明所述，本發(fā)明的混合物也可以形成或添加到現(xiàn)有或新型食物和飲料，如谷類食品、嬰兒食品、巧克力或營養(yǎng)棒等固體食物，奶油或果醬或凝膠等半固體食物，清涼飲料，咖啡，茶，含飲料的牛奶，乳制品，乳酸菌飲料，湯，滴液，糖果，口香糖，巧克力，軟糖糖果，酸奶，冰淇淋，布丁，軟紅豆涼粉，果凍，餅干，糕點(diǎn)等。這些各種各樣的混合物或制品或食物和飲料可以作為一種健康食品來治療和/或預(yù)防炎癥和/或一種或多種與炎癥有關(guān)的疾病狀態(tài)，這些疾病非限制性地包括哮喘，關(guān)節(jié)炎，炎性腸道疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，難治性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥/骨吸收，冠心病，動脈粥樣硬化，血管炎，潰瘍性結(jié)腸炎，銀屑病，成人呼吸困難癥， 糖尿病，代謝紊亂，遲發(fā)型超敏反應(yīng)的皮膚疾病與阿爾茨海默氏病。本發(fā)明的各種實(shí)施例提供了所述的協(xié)同增效混合物對人體或動物的給藥或補(bǔ)充量可以是不同的，并根據(jù)配方的性質(zhì)和提取物或成分所建議的人體或動物體劑量確定為各種各樣的，但是優(yōu)選的是每天每公斤體重0. l_750mg，更優(yōu)選的是每天每公斤體重 0. 5-500mg。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供了本發(fā)明的混合物在上述各種形式，食物和飲料混合物中的質(zhì)量可以是不同的，并根據(jù)配方的性質(zhì)和提取物或成分所建議的人體或動物體劑量確定為各種各樣的，例如約為0. 001% -99%，更優(yōu)選0. 001-90wt%。在一個重要的實(shí)施例中，選擇性濃縮的乳香鋸緣青蟹提取物中的AKBA質(zhì)量濃度為 10% -100%。在另一個實(shí)施例中，選擇性濃縮的乳香鋸緣青蟹提取物中的AKBA質(zhì)量濃度優(yōu)選為 25% -45%。在另一個實(shí)施例中，在所述的協(xié)同增效混合物中，選擇性濃縮了 3-0-乙?；?11-酮-β-乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物的質(zhì)量含量為10% _90%，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的質(zhì)量含量為90% -10%。在另一個實(shí)施例中，在所述的協(xié)同增效混合物中，選擇性濃縮了 3-0-乙?；?11-酮-β-乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物的質(zhì)量含量為30%-70%，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的質(zhì)量含量為70% -30%。本發(fā)明的另一個實(shí)施例是保健食品或飲料，其含有食物或保健食品質(zhì)量0. 001% to 80%的上述協(xié)同增效混合物的任意成分，優(yōu)選0. 001 % -50%。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供了協(xié)同增效混合物的質(zhì)量是復(fù)方總質(zhì)量的 1% -100%。
另一個實(shí)施例中，本發(fā)明還包括將本發(fā)明的混合物與各種成分混合用作動物飼料進(jìn)行治愈，預(yù)防或治療炎癥和各種與炎癥相關(guān)的疾病，如哮喘，動脈粥樣硬化和關(guān)節(jié)炎等?；旌衔锘驈?fù)方添加到動物飼料中的形式?jīng)]有特定限制，可以以一種混合物的形式添加到各種煮熟或加工食物制品中。其質(zhì)量可以與食物制品中使用的相同。相似地，這些成分也可以在動物飼料的制備過程中或制備之后添加到飼料中。下述實(shí)施例，包括優(yōu)選的實(shí)施例將說明本發(fā)明的具有應(yīng)用，應(yīng)理解為這些特例是用于舉例說明并僅作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。例 1■體籠__■■勿(BNRE)乳香鋸緣青蟹樹膠脂(100克)分散在600毫升甲基異丁基酮(MIBK)溶劑中，并在室溫下攪拌60分鐘。將不溶性樹膠顆粒通過過濾分離。甲基異丁基酮溶液反復(fù)用2%的氫氧化鉀溶液(3X200毫升)萃取以去除酸性化合物。然后用水(400毫升)和鹽水(200 毫升)連續(xù)洗滌甲基異丁基酮層。在60-70°C下將甲基異丁基酮層真空濃縮并在75-85°C 真空下從油性殘留物中去除揮發(fā)性成分得到乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物或BNRE粘性油(12克)?；蛘撸瑥娜橄沅従壡嘈分杏眉状?300毫升X3)萃取并將甲醇提取物混合濃縮得到樹膠脂(250克)。殘留物(50克)溶于乙酸乙酯(400毫升)并用2N氫氧化鉀(3X100 毫升)萃取三次。有機(jī)層用水(2X200毫升)和鹽水(200毫升)洗滌并濃縮得到乳香油。在75-85°C真空下?lián)]發(fā)性化合物從油中揮發(fā)得到22克乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物 (BNRE)。該BNRE經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)硅膠色譜柱?；赥LC將相同的餾分混合并將混合的餾分分別反復(fù)地經(jīng)過采用正己烷/乙酸乙酯或正己烷/丙酮作的混合物作為洗液的硅膠柱從而獲得純凈的化合物。一些摻雜餾分進(jìn)一步經(jīng)過預(yù)備的反相C18硅膠柱的HPLC從而獲得純凈的化合物。通過IH核磁共振，13C核磁共振，DEPT，HSQC和HMBC和大量的光譜數(shù)據(jù)，然后將所知道的化合物與這些數(shù)據(jù)比較建立結(jié)構(gòu)。鑒別出如圖I所示的九種主要化合物如愈創(chuàng)奧醇 (guiol) (1)、西松烷酚醇(η印hthenol) (2)、鋸緣青蟹醇(serratol) (3)、二萜 X (diterpene X) (4)、羽扇豆醇(Iupeol) (5)、齊墩果-12-烯-3 β -醇(olean-12-ene-3 β -ol) (6)、齊墩果-12-烯 _3α -醇(olean-12-ene_3a -ol) (7)、羊毛甾 _8，24-二烯 _3 a -醇(lanosta-8， 24-diene_3 α-ol) (8)和烏蘇-12-烯 _3 α -醇(urs-12-ene-3 α -ol) (9)。然后，采用 HPLC 方法利用這些純凈化合物來標(biāo)準(zhǔn)化乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)?；贖PLC和保留時間(Rt)分析法對新BNRE混合物的鑒別如表1所述和HPLC色譜圖如圖II所示。用于乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的分析法的HPLC。表 1乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的成分
權(quán)利要求
1.協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于含有選擇性濃縮了 3-0-乙?；?11-酮- β -乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的有效治療混合，用于控制，預(yù)防并治療炎癥或一種或多種與炎癥相關(guān)的疾病狀態(tài)，非限制性地包括哮喘，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和血管內(nèi)皮功能障礙。
2.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于選擇性濃縮的乳香鋸緣青蟹提取物中所含的AKBA質(zhì)量濃度為10% -100%。
3.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于選擇性濃縮的乳香鋸緣青蟹提取物中所含的AKBA質(zhì)量濃度為25% -95%，更優(yōu)選為 25% -45%。
4.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于所述的乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)是一種低極性的中性乳香鋸緣青蟹樹脂提取物，它選擇性地去除了酸性化合物。
5.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于制備這些混合物的方法包括以下步驟(a)用一種不溶于水的有機(jī)溶劑提取乳香鋸緣青蟹樹膠脂，過濾提取物，完全地去除未溶解的殘留材料，然后用一種水堿性溶液，如氫氧化鉀溶液反復(fù)沖洗有機(jī)溶劑，接著先后用水和鹽水沖洗，于是在真空中最后蒸發(fā)掉有機(jī)層，并升高溫度去除溶劑，然后在高溫真空下去除油性殘留物中的揮發(fā)性化合物獲得乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)，(b)選擇性濃縮乳香鋸緣青蟹樹膠脂的酸性提取物，獲得含有質(zhì)量含量10-100% AKBA(BE)的乳香鋸緣青蟹提取物，(c)將乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)與濃縮了AKBA的乳香鋸緣青蟹提取物 (BE)以預(yù)計(jì)的比率混合，獲得權(quán)利要求1所述的混合物，(d)將所述的混合物選擇性地與一種或多種賦形劑，稀釋劑和添加劑成分混合。
6.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于在所述的混合物中，選擇性濃縮了 3-0-乙?；?1 1-酮-β-乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物的質(zhì)量含量為10% _90%，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的質(zhì)量含量為 90% -10%。
7.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于在所述的混合物中，選擇性濃縮了 3-0-乙?；?1 1-酮乳香酸(AKBA)的乳香鋸緣青蟹提取物的質(zhì)量含量為 30% -70%，乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的質(zhì)量含量為70% -30%。
8.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于所述的混合物選擇性地含有一種或多種保健品或藥品或食物可接受的賦形劑或稀釋劑或添加劑。
9.如權(quán)利要求8所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于所述的保健品或藥品或食物可接受的賦形劑或稀釋劑或添加劑非限制性地包括蒸餾水，生理鹽水，葡萄糖水溶液，酒精(如乙醇)，丙烯乙二醇和聚乙二醇；以及各種動物和植物油的含油載體，白軟蠟，石蠟和蠟，葡萄糖，果糖，蔗糖，麥芽糖，黃糊精，白糊精，氣溶膠，微晶纖維素，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，山梨糖醇，甜菊糖甙，玉米糖漿，乳糖，檸檬酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸，乳酸酸，L-抗壞血酸和 dl-α -維生素Ε，甘油，丙二醇，甘油脂肪酸酯，聚甘油脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯，失水山梨醇脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯，阿拉伯樹膠，卡拉膠，酪蛋白，明膠，果膠，瓊脂，B族維生素，煙酰胺，泛酸鈣，氨基酸，鈣鹽，色素，香精和防腐劑。
10.如權(quán)利要求1或8所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于其還選擇性地含有一種或多種公知的藥物可接受的抗氧化劑，適應(yīng)原劑，消炎劑，防止糖尿病劑，防止肥胖劑，防止動脈粥樣硬化劑。
11.如權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于所述的與炎癥相關(guān)的疾病非限制性地包括炎性腸道疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎， 難治性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥/骨吸收，冠心病，動脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮功能障礙，血管炎，潰瘍性結(jié)腸炎，銀屑病，成人呼吸困難癥，糖尿病，遲發(fā)型超敏反應(yīng)的皮膚疾病，哮喘，血管內(nèi)皮功能障礙，紫外線照射引起的膠原蛋白降解，皮膚皺紋和皮膚老化。
12.如權(quán)利要求1，8或10所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于所述的混合物是對一個所需目標(biāo)進(jìn)行口服，外用或吸入或腸外式給藥來治療炎癥疾病，給藥的形式是一種輸液，注射液，片劑，膠囊，乳霜，凝膠劑，顆粒劑，軟膏，灌腸劑，藥用包裝或食物補(bǔ)充劑。
13.如權(quán)利要求1，8或10所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物，其特征在于所述的混合物是口服劑型，如片劑，膠囊劑，軟膠囊，硬膠囊劑，丸劑，顆粒劑，粉劑， 乳劑，懸浮劑，糖漿或顆粒；或者是注射劑，如注射液，滴，栓劑；或者是經(jīng)皮給藥劑型，如貼齊 ，外用藥乳霜和凝膠或飲料和食物成分。
14.鑒定用于制備如權(quán)利要求1所述協(xié)同增效混合物的乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)的方法，其特征在于所述的方法包括i.鑒定BNRE中作為標(biāo)記的的主要化合物，分離出它們使其純度>98%，然后使用光譜數(shù)據(jù)來識別它們；ii.將每種標(biāo)記化合物以一個公知的量單獨(dú)地注入到一個菲羅門Lima苯基己基色譜柱(4.6X250mm，5y)中，將色譜柱安裝到一個具有PDA探測器的HPLC系統(tǒng)中，其中所述的色譜柱保持在30°C的溫度，并用一種雙溶劑混合物洗提，該雙溶劑混合物包括體積含量分別為27%和73%的正磷酸(體積含量為0. )水溶液和乙腈，流速為1. 5mL/min，然后使用UV檢測儀檢測每個標(biāo)記在210nm和248nm下的停留時間和峰面積；然后iii.在相似的條件下分析一種已知量的BNRE樣本，比較樣本與那些標(biāo)準(zhǔn)樣的峰值停留時間，選擇性地將樣本與每種標(biāo)記共同注入，并通過比較其與已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰值面積來檢測每種標(biāo)記在樣本中的百分率，然后iv.計(jì)算所有標(biāo)記共同的百分率，獲得BNRE的組成，這些標(biāo)記非限制性地包括西松烷酚醇、鋸緣青蟹醇、二萜X、羽扇豆醇、齊墩果-12-烯-3 β -醇、齊墩果-12-烯-3 α -醇、羊毛甾-8，24- 二烯-3 α -醇、烏蘇-12-烯_3 α -醇和愈創(chuàng)奧醇，然后使用所述的混合物與 BNRE的其它樣本進(jìn)行比較。
15.一種治療炎癥疾病的方法，其特征在于包括使用如權(quán)利要求1，8或10所述混合物的一個有效治療量向一個所需目標(biāo)給藥。
16.一種治療炎癥，認(rèn)知障礙，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，阿爾茨海默氏病，膠原蛋白合成癥，抗衰老癥，膽固醇降低癥和其他代謝紊亂的方法，其特征在于包括使用如權(quán)利要求1，8或10所述混合物的一個有效治療量向一個所需目標(biāo)給藥。
17.一種治療炎癥和一種或多種與炎癥相關(guān)疾病的方法，所述的疾病非限制性地包括炎性腸道疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，難治性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥/骨吸收，冠心病，動脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮功能障礙，血管炎，潰瘍性結(jié)腸炎，銀屑病，成人呼吸困難癥，糖尿病，遲發(fā)型超敏反應(yīng)的皮膚疾病，哮喘，血管內(nèi)皮功能障礙，其特征在于包括使用如權(quán)利要求1，8或10所述混合物的一個有效治療量向一個所需目標(biāo)給藥。
18.如權(quán)利要求1，8或10所述的協(xié)同增效混合物，其特征在于所述的混合物用于改進(jìn)炎癥標(biāo)記，這些標(biāo)記非限制性地包括5-脂氧合酶(5-LOX)，5-脂氧合酶活性蛋白(FLAP)， 巨噬細(xì)胞/脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)，IFN- y , IL-4，ICAM，VCAM, MMPs, TNF-α禾口 IL-I β。
19.使用如權(quán)利要求1，8或10所述的協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物， 其特征在于所述的混合物是按每日劑量形成的粉末型和/或未變性型，其給藥的劑型是粉末，膠囊，片劑，顆粒劑，沉淀劑，萃取劑，干燥提取物和/或分泌物。
20.一種治療炎癥疾病患者的方法，所述的炎癥疾病是由激活和脫顆粒的肥大細(xì)胞分泌的生物分子引起的，該炎癥疾病是骨關(guān)節(jié)炎，癌癥，纖維肌痛，動脈粥樣硬化，炎癥性腸道疾病，間質(zhì)性膀胱炎，腸易激綜合癥，偏頭痛，心絞痛，慢性前列腺炎，濕疹，關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，牛皮癬，陽光灼傷或牙周病，其特征在于所述的方法包括使用如權(quán)利要求1，8或10 所述混合物的一個有效治療量向一個所需目標(biāo)給藥的步驟。
21.—種改進(jìn)目標(biāo)所患炎癥中某些生物分子/生物標(biāo)記的方法，所述的生物分子/生物標(biāo)記為5-脂氧合酶(5-LOX)，5-脂氧合酶活性蛋白(FLAP)，巨噬細(xì)胞/脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)，IFN- y , IL-4，ICAM，VCAM, MMPs, TNF-α 和 IL-I β，其特征在于所述的方法包括使用如權(quán)利要求1，8或10所述協(xié)同增效的保健品或藥物或食物補(bǔ)充混合物的一個有效治療量向一個所需目標(biāo)給藥的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了協(xié)同增效作用的營養(yǎng)品或藥物或膳食補(bǔ)充消炎混合物，其含有由乳香鋸緣青蟹衍生的，選擇性濃縮3-O-乙?；?11-酮-β-乳香酸(AKBA)的一種提取物和和乳香鋸緣青蟹非酸性樹脂提取物(BNRE)形成的治療效果組合。所述的混合物可以用于預(yù)防，控制并治療炎癥和各種與疾病相關(guān)的炎癥，包括哮喘，骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，血管內(nèi)皮功能障礙等。本發(fā)明還包括對那些在炎癥疾病過程中會改變表達(dá)/產(chǎn)物的促炎性生物標(biāo)記蛋白或分子進(jìn)行改進(jìn)。
文檔編號A61K36/324GK102170892SQ200980134335
公開日2011年8月31日 申請日期2009年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月15日
發(fā)明者G·R·古卡拉吉, K·布湖帕瑟拉吉, R·R·古卡拉吉, T·吉拉考提, V·K·R·R·古卡拉吉, V·K·R·阿魯瑞 申請人:萊拉營養(yǎng)食品有限公司