用于增強(qiáng)促生長素抑制素免疫原性的組合物和方法

專利名稱：用于增強(qiáng)促生長素抑制素免疫原性的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及患有生長激素(GH)和/或胰島素樣生長因子1 (IGF-I)缺陷的患者的 治療。更具體地，本發(fā)明涉及通過使用基于促生長素抑制素的抗原/佐劑疫苗對(duì)患有GH和 /或IGF-I缺陷的患者的治療以及涉及所述治療的組合物和方法。背景自從18世紀(jì)晚期(1798年的天花疫苗)實(shí)施利用疫苗預(yù)防傳染病，包括使用疫苗 預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎、乙肝和流感。近來，疫苗還被確定用于治療癌癥，其中疫苗誘導(dǎo)患者的免 疫系統(tǒng)識(shí)別并破壞靶腫瘤細(xì)胞，即治療乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌等。由于使用患者自身免疫 系統(tǒng)擊敗侵入或致癌物質(zhì)的益處，正在開發(fā)用于疫苗治療的其他新的和有用的靶。大部分 情況下，疫苗包括所需免疫針對(duì)的抗原和佐劑以增強(qiáng)疫苗受體針對(duì)該抗原的應(yīng)答。生長激素是由前葉垂體合成和釋放的191個(gè)氨基酸的多肽激素。生長激素通常被 認(rèn)為是合成代謝激素，是兒童的生長/身高，鈣保留(骨強(qiáng)度)的增加，脂解作用的促進(jìn)，蛋 白合成的增加，肝臟中糖異生的促進(jìn)及其他類似功能所需要的。患有內(nèi)源性生長激素缺陷 的患者通常具有較低的骨密度，減弱的瘦體質(zhì)，減少的能量以及其他類似的全身癥狀。當(dāng)前，患有生長激素缺陷的患者用生長激素替代法進(jìn)行治療，通常使用在遺傳 工程化的細(xì)菌中表達(dá)的重組生長激素。這些治療方案通常是非常昂貴的(估計(jì)范圍從 $10，000到$30，000每年)且依賴于激素的外源替代(每天注射是典型的，經(jīng)?？缭?8個(gè) 月到患者一生)。結(jié)果，對(duì)于患有生長激素缺陷的患者來說需要新的、非外源的、長效的和花 費(fèi)較少的療法。此外，對(duì)于治療需要額外的、高于基準(zhǔn)水平的生長激素的患者(例如這些患者經(jīng) 常需要額外的生長激素用于治療肥胖癥、創(chuàng)傷愈合、燒傷愈合等)也需要這種療法。本發(fā)明目的在于克服上文討論的一或多個(gè)問題。實(shí)施方案概述本發(fā)明的實(shí)施方案提供用于治療生長激素缺陷的組合物和方法。對(duì)于本發(fā)明來 說，生長激素缺陷是與疾病狀態(tài)或生長障礙(由于缺乏足夠的內(nèi)源性生長激素分泌和/或 水平)有關(guān)的生長激素水平的任何降低。生長激素缺陷還包括以下情況其中存在正常內(nèi) 源性水平(對(duì)于該患者來說)的生長激素，但據(jù)信額外的生長激素有益于疾病或病癥的治 療例如肥胖癥的治療，創(chuàng)口的治療和燒傷的治療。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供用于治療胰島素樣生長因子1缺陷的組合物和方法。對(duì) 本發(fā)明來說，胰島素樣生長因子1缺陷是與疾病狀態(tài)或病癥(由于缺乏足夠的內(nèi)源胰島素 樣生長因子1分泌和/或水平)有關(guān)的胰島素樣生長因子1水平的任何降低。胰島素樣生長因子1缺陷還包括以下情況存在正常內(nèi)源性水平的胰島素樣生長因子1，但是據(jù)信額外 的胰島素樣生長因子1有益于疾病或病癥例如生長障礙，1型和2型糖尿病以及軟骨修復(fù)和 /或替代的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，為需要其的患者提供治療生長激素缺陷的方法。該方法包括 給患者施用免疫原性量的本發(fā)明基于促生長素抑制素的抗原疫苗并監(jiān)測(cè)患者的進(jìn)展?？梢?施用額外的接種以促進(jìn)患者生長激素缺陷的治療。需要這類治療的患者包括缺乏內(nèi)源性 生長激素(導(dǎo)致不充分的生長，先天性心臟疾病或其他類似心臟疾病，肥胖癥)的成人和兒 童，需要增強(qiáng)的燒傷修復(fù)的患者，和需要增強(qiáng)的創(chuàng)傷愈合的患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為需要其的患者提供治療胰島素樣生長因子1缺陷的方 法。該方法包括給患者施用免疫原性量的本發(fā)明基于促生長素抑制素的抗原疫苗并監(jiān)測(cè)患 者的進(jìn)展?？梢允┯妙~外的接種以促進(jìn)患者胰島素樣生長因子1缺陷的治療。需要這類治 療的患者包括患有早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)的嬰兒，肥胖的成人和/或兒童，患有1型或2 型糖尿病的成人和/或兒童，患有Rett' s綜合征的成人和/或兒童，肥胖的狗和/或貓， 需要軟骨替代和/或修復(fù)的馬，以及其他類似治療。本發(fā)明還提供具有增強(qiáng)的促生長素抑制素免疫原性的新的多肽以及編碼它們的 多核苷酸用于治療患有生長激素或胰島素樣生長因子1缺陷的患者。本發(fā)明的多肽包括通 過功能優(yōu)化的接頭與滅活的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白融合的促生長素抑制素-14。本發(fā)明的 多肽因?yàn)榇偕L素抑制素-14的高度保守的性質(zhì)而可用于全部脊椎動(dòng)物物種，長期保存是 穩(wěn)定的，高度免疫原性的以及在患者中對(duì)降解是抗性的。因此，本發(fā)明的嵌合多肽提供高效 和低成本的材料用于治療所有脊椎動(dòng)物的生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷。本發(fā)明還提供用于治療需要免疫原性應(yīng)答的患者的新的佐劑，特別是涉及需要生 長激素或胰島素樣生長因子缺陷的治療的患者。本文新的佐劑用于脊椎動(dòng)物是高度有效和 安全的，包括人，狗，馬，貓等。本發(fā)明還提供用于治療患有生長激素或胰島素樣生長因子缺陷的患者的新的疫 苗。疫苗用于脊椎動(dòng)物是高度有效和安全的，包括人，狗，馬，貓等。在閱讀下列詳細(xì)說明并瀏覽所附權(quán)利要求后，本發(fā)明的這些以及各種其他特征和 優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。附圖簡(jiǎn)述

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的pET30b CatSom質(zhì)粒的說明性示意圖。質(zhì)粒包括卡 那霉素抗性標(biāo)記，Lac操縱基因，T7啟動(dòng)子，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的CAT編碼序列，根據(jù)本發(fā) 明的接頭區(qū)并且還包括根據(jù)本發(fā)明的促生長素抑制素編碼區(qū)。圖2是說明性的染色SDS-PAGE，顯示對(duì)應(yīng)于本發(fā)明密碼子優(yōu)化的、CAT缺陷型促 生長素抑制素多肽的預(yù)測(cè)大小的^KD條帶。泳道1是LB+IPTG，還原的，泳道2是LB，還原 的，泳道3是LB+IPTG和泳道4是LB。圖3是遠(yuǎn)交小鼠中百分比基準(zhǔn)重量對(duì)包含促生長素抑制素的接種的散射圖。圖4是顯示7天期間每組小鼠的食品攝入的示意圖。圖5是顯示39天期間治療組小鼠的平均體重的圖示，用誤差線顯示檢測(cè)的每組。圖6是顯示39天期間治療組小鼠的基準(zhǔn)體重的百分比的圖示，用誤差線顯示檢測(cè) 的每組。
序列的鑒定和序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID NO 1AGCKNFFWKTFTSCSEQ ID NO 15GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTSEQ ID NO :2(His 192-> Gly，His 193- > Gly)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagt tttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgetcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagetggtgatatgggata gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctaca catatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccct gggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaag gtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO :3 (Hisl92_ > Gly, Hisl93_ > Gly)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetIsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsf d1ηνanmdnffapνftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlneIqqSEQ ID NO :4(Hisl93_ > Gly)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagt tttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgetcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagetggtgatatgggata gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctaca catatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccct gggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaag gtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO :5(lHisl93-> Ala)
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagt tttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgetcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagetggtgatatgggata gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctaca catatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccct gggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaag gtgctgatgccgctggcgattcaggttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO :6 (lHis+CAT wt)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagt tttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgetcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagetggtgatatgggata gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctaca catatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccct gggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaag gtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO 7( 一個(gè) H— > (；)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsf d1ηνanmdnffapνftmgkyytqgdkvlmplaiqvhgavcdgfhvgrmlneIqqSEQ ID NO :8 (H- > A)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsf d1ηνanmdnffapνftmgkyytqgdkvlmplaiqvhaavcdgfhvgrmlneIqq
SEQ ID NO 9tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatgSEQ ID NO 10weIhrsgprprprprpefmSEQ ID NO :11welhrsgp (rp)nefm 其中 η > 1SEQ ID NO :12Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagt tttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgetcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagetggtgatatgggata gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctaca catatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccct gggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaag gtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagtgggaactg caccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgcSEQ ID NO :13mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihiIarImna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfd lnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqqweIhrsgprprprprpefmagcknffwktftscSEQ ID NO :14mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihiIarImna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfd lnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqweIhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc詳細(xì)說明本發(fā)明提供用于在需要這類治療的患者中治療生長激素缺陷的組合物和方法。對(duì) 于本文的目的以及先前的描述，生長激素缺陷是與疾病狀態(tài)或病癥(由于患者缺乏足夠的 內(nèi)源性生長激素分泌和/或水平)有關(guān)的生長激素水平的任何降低。生長激素缺陷還包括 以下情況其中存在正常內(nèi)源性水平(即對(duì)患者來說是正常的)的生長激素，但據(jù)信額外的生長激素有益于對(duì)患者的目標(biāo)疾病或病癥的治療，例如肥胖癥的治療，創(chuàng)口的治療和燒傷 的治療。本發(fā)明還提供用于治療需要這類治療的患者的胰島素樣生長因子1缺陷的組合 物和方法。對(duì)于本文來說，胰島素樣生長因子1缺陷是與疾病狀態(tài)(由于缺乏足夠的內(nèi)源 性胰島素樣生長因子1分泌)有關(guān)的胰島素樣生長因子水平的任何缺陷。胰島素樣生長 因子1缺陷還包括以下情況其中存在正常水平(即對(duì)患者來說是正常的)的胰島素樣生 長因子，但據(jù)信額外的因子1有益于對(duì)患者的疾病或病癥例如肥胖癥，1型和2型糖尿病和 Rett' s綜合征的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供新的多肽和編碼它們的多核苷酸，包括通過功能優(yōu)化的 接頭與滅活的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白融合的促生長素抑制素-14的多肽。本發(fā)明的嵌合多 肽提供高效和低成本的材料用于治療生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供新的佐劑組合物用于治療患有生長激素和/或胰島素 樣生長因子1缺陷的患者。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，基于促生長素抑制素的抗原可以與新 的佐劑組合并用于治療生長激素或胰島素樣生長因子1缺陷相關(guān)疾病狀態(tài)或病癥，例如兒 童的生長缺陷，成人的生長缺陷，缺乏足夠的內(nèi)源性生長激素分泌，燒傷、肥胖癥、心臟病的 治愈等。本文的佐劑被設(shè)計(jì)成最適用于脊椎動(dòng)物，尤其是人。本文的佐劑提供高于常規(guī)佐 劑的增強(qiáng)免疫原性，從而允許疫苗包括更小量的抗原。除了用于生長激素和/或胰島素樣 生長因子1缺陷的治療以外，本文的佐劑實(shí)施方案還可與其他抗原組合聯(lián)用。新的單獨(dú)的 佐劑實(shí)施方案因此屬于本發(fā)明的范圍，但本文的佐劑主要根據(jù)基于促生長素抑制素的抗原 進(jìn)行描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供引起抗促生長素抑制素的免疫原性的疫苗，這導(dǎo)致促 生長素抑制素的減少從而去除一定比例的促生長素抑制素對(duì)生長激素釋放進(jìn)而胰島素樣 生長因子1釋放的抑制。本文的疫苗實(shí)施方案在安全性和功能方面都進(jìn)行了優(yōu)化，在安全 和高效的佐劑組合物中具有高免疫原性的促生長素抑制素構(gòu)建體。本發(fā)明的疫苗需要相對(duì) 更小量的抗原(與常規(guī)疫苗相比)，具有增強(qiáng)的保存期限，成本更低。盡管本發(fā)明目標(biāo)在于人類中生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷的治療，但 可以預(yù)期其他脊椎動(dòng)物中這些缺陷的治療也屬于本發(fā)明的范圍。例如，可以利用本文描述 的組合物和方法治療顯示肥胖癥癥狀的狗和貓以及需要軟骨修復(fù)或替代的馬。提供下列定義以有利于本文經(jīng)常使用的一些術(shù)語的理解，其不是為了限制當(dāng)前公 開內(nèi)容的范圍。定義“氨基酸”是指20種天然存在的氨基酸以及任何修飾的氨基酸序列中的任一種。 修飾可以包括自然過程諸如翻譯后加工，或可以包括但不限于磷酸化，泛素化，乙?；?，糖 基化，黃素的共價(jià)粘附，ADP-核糖基化，交聯(lián)，碘化，甲基化等等。“抗體”是指具有一對(duì)抗原結(jié)合位點(diǎn)，鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)的Y形分子?？贵w的片段例 如抗原結(jié)合片段(Fab)、嵌合抗體、具有與鼠抗原結(jié)合區(qū)偶聯(lián)的人恒定區(qū)的抗體及其片段以 及其他公知的重組抗體包括在本發(fā)明抗體的定義內(nèi)?！胺蛛x”是指從其自然環(huán)境的至少一種污染物分離或回收的多核苷酸或多肽。一 些情況下，多核苷酸或多肽已經(jīng)從其自然環(huán)境的10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的污染物分離或回收。通常，利用至少一個(gè) 純化步驟制備分離的多核苷酸或多肽。在這方面，純化是指不含至少5 %，10 %，20 %，30 %， 40%，50%，60%，70%，80%，90%95%，96%，97%98%或99%污染多肽的靶多肽。從污染 多肽純化多肽可以通過許多公知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括硫酸銨或乙醇沉淀，陰離子或陽離子交 換層析，磷酸纖維素層析，疏水性相互作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和凝集素層析。“肥胖癥”是指超過理想體重至少20%的對(duì)象。例如對(duì)于人類，理想體重由對(duì)象的 身高、年齡、性別和體格(build)確定。本文肥胖癥包括術(shù)語溫和地肥胖(超過理想重量 20-40% )，適度地肥胖(超過理想重量40-100% )和嚴(yán)重地肥胖(超過理想重量100% )。“患者”是指需要本發(fā)明的組合物和/或方法的脊椎動(dòng)物，通常是哺乳動(dòng)物，例如需 要體重減輕的人(肥胖，例如)或需要軟骨修復(fù)的馬。“百分比”核酸或氨基酸序列相同性描述與參照多核苷酸或多肽相同的核酸序列 或氨基酸殘基的百分比。在一些情況下，序列被比對(duì)并引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大序列相同性。 在一些情況下，使用計(jì)算機(jī)程序計(jì)算百分比相同性，例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis package， Version 8 for Unix, Genetics Computer Group， University Research ParkiMadison Wisconsin)，其使用 Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.， 2 :482-489)的算法(每篇均以其全文援引加入本文)或ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序(參 見 W000/15796)?！岸嗪塑账帷笔侵负塑账岬木€性序列。核苷酸是多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸 的線性序列，或這兩者的混合物。本發(fā)明上下文中多核苷酸的實(shí)例包括單鏈和雙鏈DNA，單 鏈和雙鏈RNA，以及具有單鏈和雙鏈DNA和RNA的混合物的雜種分子。多核苷酸還包括一或 多種修飾的核苷酸和肽核酸(PNA)。“蛋白”，“肽”和“多肽”可以互換使用，表示氨基酸聚合物或一組兩或多個(gè)相互作 用或結(jié)合的氨基酸聚合物?！爸委煛笔侵冈谙鄬?duì)同等情況下對(duì)象相對(duì)于未經(jīng)治療對(duì)象的改善。治療通常表明通 過使用本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需的藥理和/或生理作用。治療可以包括預(yù)防性 治療?！耙呙纭笔侵笧榱吮疚拿枋龅哪康目梢源碳そ臃N對(duì)象的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的任意 組合物。生長激素生長激素是由垂體前葉中的促生長激素細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的191個(gè)氨基酸的肽。體 內(nèi)的生長激素水平由生長激素釋放激素(GHRH)和促生長素抑制素調(diào)節(jié)。GHRH引起生長激 素的合成和釋放(已知應(yīng)激，鍛煉等也是生長激素釋放的刺激劑)，而促生長素抑制素抑制 生長激素的釋放。生長激素(GH)通常參與體內(nèi)的各種生理功能，包括在整個(gè)兒童期增加身高，通 過肌原纖維節(jié)增生增加肌肉質(zhì)量，促進(jìn)脂解，促進(jìn)肝臟的糖異生，和參與燃料穩(wěn)態(tài)。生長 激素缺陷通常自身顯示為許多已知的疾病或生理狀態(tài)，包括矮小的身材/生長障礙(如 果缺陷發(fā)生在兒童期)，力量不足(strength deficits)，骨量損失，心血管風(fēng)險(xiǎn)的增加， 例如慢性心力衰竭(Tien et al. , Growth Hormone :A Promising Treatment for the Failing Heart, 2000, Pharmacotherapy 20(9) :1096_1106，以其全文援引加入本文)，和其他類似狀態(tài)。此外，給對(duì)象補(bǔ)充生長激素可能有利于治療創(chuàng)口，燒傷，肥胖等。Vickers et al. ，2002， Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesity induced by an adverse prenatal environment,J. Endocrinol, 175(3) :615-623 ；Ramirez et al. ，1998， Is there a role for growth hormone in the clinical management or burn injuries, Growth Hormone IGF Res. Suppl. B :99-105 ；禾口 Lal et al. ,2000, Growth hormone，burns and tissue healing,Growth Hormone IGF Res. 10 Suppl. B :539_543，為 了所有目的每篇均援引加入本文。抗擊生長激素缺陷的常規(guī)療法包括給患病個(gè)體補(bǔ)充重組人生長激素(參見例如 美國專利號(hào)4，446，235和4，601，980)。生長激素補(bǔ)充療法通常需要連續(xù)基礎(chǔ)上的重組生長 激素皮下注射，即每天注射至少18個(gè)月是典型的，盡管很多個(gè)體需要終生治療。最近，生長 激素補(bǔ)充療法已經(jīng)用于多發(fā)性硬化(MS)的治療，纖維肌痛的治療，克羅恩氏病和/或潰瘍 性結(jié)腸炎的治療，老化逆轉(zhuǎn)作用的治療，燒傷的治療，和原發(fā)性矮小身材的治療。但是，利用 重組生長激素療法的治療已經(jīng)顯示可能增加糖尿病，結(jié)腸癌等的風(fēng)險(xiǎn)。此外，利用重組蛋白 治療患者通常缺乏內(nèi)反饋對(duì)照(提供恒定監(jiān)測(cè)和病人監(jiān)護(hù)的環(huán)境)，當(dāng)患者具有活躍的惡 性腫瘤時(shí)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)增加。另外，重組生長激素的獲得是極其昂貴的，按照通過注射的每天施 用方式，一或多年的使用成本會(huì)阻止其應(yīng)用。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案為治療這些生長激素 缺陷相關(guān)疾病或病癥提供出乎意料的和實(shí)質(zhì)上的益處。胰島素樣生長因子1 (IGF-I)IGF-I是在結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白激素。IGF-I是響應(yīng)生長激素在肝臟 和其他靶組織中產(chǎn)生，通常對(duì)釋放具有合成作用。通常，IGF-I通過AKT信號(hào)途徑(AKT代 表絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族)起作用。通常，IGF-I合成作用包括細(xì)胞生長和 增殖以及靶位點(diǎn)凋亡的抑制。許多因素涉及影響患者循環(huán)中的IGF-I水平，包括生長激素的水平，遺傳構(gòu)成， 時(shí)刻(time of day)，年齡，性別，鍛煉情況，應(yīng)激，體重指數(shù)，和疾病狀態(tài)。IGF-I缺陷的特 征在于生長遲滯或障礙，與數(shù)種病癥有關(guān)，包括肥胖癥，1型和2型糖尿病，心血管疾病，各 種應(yīng)激障礙等等。重組IGF-I已經(jīng)用于治療這類疾病中的數(shù)種，獲得混合的結(jié)果。最近，hcrelex: (由Tercica生產(chǎn)的重組IGF-1)已在美國上市用于治療目標(biāo)病癥，盡管臨床結(jié)果還有差別。促生長素抑制素促生長素抑制素是抑制例如垂體前葉釋放生長激素的肽激素。促生長素抑制素 通過與靶內(nèi)分泌細(xì)胞上G蛋白偶聯(lián)促生長素抑制素受體的相互作用調(diào)節(jié)各種內(nèi)分泌功能。 促生長素抑制素從下丘腦、胃、腸和胰的部位分泌。目標(biāo)動(dòng)物中促生長素抑制素水平的控 制最近被確定為提高農(nóng)畜產(chǎn)量的關(guān)注點(diǎn)，即促生長素抑制素水平的控制增強(qiáng)奶牛產(chǎn)奶量或 農(nóng)畜的大小等等(參見共同未決申請(qǐng)S/N 12/198，579，標(biāo)題為“Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT) -Defective Somatostatin Fusion Protein And Uses Thereof，，，為了 所有目的其援引加入本文)。在這些研究中，通過使用促生長素抑制素抗原的接種方案優(yōu)化農(nóng)畜的生產(chǎn)力。通 常，用促生長素抑制素免疫的農(nóng)畜平均每天體重增加10-20%，食欲降低9%，食物利用率 增加11%。用促生長素抑制素免疫的動(dòng)物以及它們的后代具有正確的比例，動(dòng)物重量在肌肉、骨和脂肪之間的分布與對(duì)照動(dòng)物相同(參見Reichlin，1987)。但是，替代性的促生長素 抑制素治療例如利用抗促生長素抑制素抗體對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的直接治療已被證明是過度昂貴 和功能不那么顯著的，從而因?yàn)椴粚?shí)際而放棄了直接抗體治療。Muromtsev G. S.，et al.， 1990,Basics of agricultural biotechnology,Agropromizdat,Moscow,ppl02_106o因此， 這些研究表明在目標(biāo)動(dòng)物中誘導(dǎo)促生長素抑制素免疫原性可以實(shí)現(xiàn)安全和有效的結(jié)果。本發(fā)明人在此獲得了驚奇和出乎意料的結(jié)果，這些接種方案的改變(包括其中的 方法和組合物)可用于治療人類疾病或生理狀態(tài)，尤其是治療人生長激素和/或IGF-I缺 陷。本發(fā)明的實(shí)施方案提供針對(duì)脊椎動(dòng)物(更具體地，哺乳動(dòng)物)生長激素缺陷的基 于促生長素抑制素的治療。典型實(shí)施方案是針對(duì)人，狗，貓和馬的治療。用促生長素抑制素 免疫的人和其他哺乳動(dòng)物接受本發(fā)明疫苗的治療(參見下文)以限制或抑制天然促生長 素抑制素對(duì)生長激素釋放的作用。例如，當(dāng)給缺乏生長激素或需要過量生長激素來治療燒 傷、心臟療法、糖尿病等的患者施用重組生長激素時(shí)，提供本發(fā)明的疫苗以產(chǎn)生額外的內(nèi)源 性生長激素釋放。疫苗抗原和佐劑被優(yōu)化用于脊椎動(dòng)物使用，尤其是人類使用和疾病治療。 因?yàn)榇偕L素抑制素在脊椎動(dòng)物中是高度保守的，本發(fā)明的實(shí)施方案可以使用本文的方法 和組合物在所有接種的目標(biāo)脊椎動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的重大利益是接種患者在加 強(qiáng)事件之間可持續(xù)數(shù)周到數(shù)月，允許患者的免疫系統(tǒng)限制或消除來自系統(tǒng)的促生長素抑制
ο本發(fā)明的實(shí)施方案還提供針對(duì)脊椎動(dòng)物(更具體地，哺乳動(dòng)物，例如人，狗，貓，馬 等)IGF-I缺陷的基于促生長素抑制素的治療。用本發(fā)明疫苗免疫的脊椎動(dòng)物限制或抑制 促生長素抑制素對(duì)該動(dòng)物中IGF-I水平的作用。治療實(shí)施方案可用于治療許多與IGF-I缺 陷有關(guān)的疾病和/或病癥或用于需要額外的IGF-I以改善接受治療的動(dòng)物的健康狀況或疾病。因此，本發(fā)明的一些方面有利于基于促生長素抑制素的免疫疫苗，通過提供高度 免疫原性材料用于預(yù)防和治療疾病和/或其他病癥。這些基于促生長素抑制素的免疫化合 物已經(jīng)為了表達(dá)和抗原性而進(jìn)行了優(yōu)化。在一些實(shí)施方案中，促生長素抑制素-14被表達(dá)為密碼子優(yōu)化的、CAT缺陷型促生 長素抑制素嵌合多肽。這些材料為用于治療基于生長激素和IGF-I缺陷的疾病以及生長激 素或IGF-I的額外水平有益于治療方案時(shí)提供出乎意料的治療效果。如下文更全面的描 述，本發(fā)明還為最大化密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制素嵌合多肽的作用而提供優(yōu) 化佐劑。本發(fā)明基于促生長素抑制素的抗原被設(shè)計(jì)為提供大的分子07，000+道爾頓對(duì)比 天然促生長素抑制素的1，600)，免疫原性以及對(duì)降解的抗性。采用這樣的方式，本發(fā)明基于 促生長素抑制素的抗原在接受治療的患者中存在更長(患者中半衰期更長)，更大的效果 (更大的免疫原性)。這些用于脊椎動(dòng)物的新抗原提供了為患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答的最佳 暴露。用于治療生長激素缺陷的新的疫苗實(shí)施方案促生長素抑制素具有兩種活性形式，通過多肽的選擇性切割產(chǎn)生。Costoff A.Section 5， Chapter 4 :Structure， Synthesis, and Secretion of Somatostatin. Endocrinology :The Endocrine Pancreas. Medical College of Georgia，第 16 頁，為了所有目的以其全文援引加入。盡管預(yù)期任一種促生長素抑制素形式均可用于本文基 于促生長素抑制素的抗原實(shí)施方案，但促生長素抑制素-14將被詳細(xì)描述。促生長素 抑制素-14是在下丘腦和胃腸道(胃，腸和胰)產(chǎn)生的生物活性十四肽。十四肽的氨 基酸序列是AGCKNFFWKTFTSC(SEQ ID NO :1)。促生長素抑制素_14的序列在脊椎動(dòng)物 中是高度保守的(Lin Xff et al. Evolution of neuroendocrine peptide systems gonadotropin-releasing hormone and somatostatin. Comp. Biochem.Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1998 119(3) :375-88.)。該十四肽由以下核酸序列編 碼:GCTGGCTGCAAGMTTTCTTCTGGMGACTTTCAC ATCCTGT (SEQ ID NO 15)(應(yīng)注意其他核酸序 列可用于編碼SEQ ID NO :1，但是提供SEQ ID NO 15用于說明目的)。已知促生長素抑制素-14對(duì)參與動(dòng)物的生長和食物利用的大量激素具有強(qiáng)抑制 作用。如先前在美國專利號(hào)6，316，004和美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/198，579 (為了所有用途每篇 均援引加入本文)中所述，促生長素抑制素和促生長素抑制素的嵌合形式可用于動(dòng)物的免 疫以增加每天重量，以及合適情況下增加產(chǎn)奶量。這些免疫方法利用常規(guī)佐劑進(jìn)行。促生 長素抑制素-14免疫還沒有被用于治療任意特定的生長激素缺陷狀態(tài)。本發(fā)明的一個(gè)方面提供分離的核酸分子，其編碼具有優(yōu)化的促生長素抑制素免疫 原性活性的嵌合蛋白。特別地，本發(fā)明的實(shí)施方案包括新的核酸構(gòu)建體，其編碼具有促生長 素抑制素的免疫原性活性的CAT融合蛋白。已經(jīng)針對(duì)在免疫方法和治療生長激素和/或胰 島素樣生長因子1缺陷(尤其是治療哺乳動(dòng)物生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷) 的用途中的最佳功能活性鑒定了這些多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有如圖1所示的簡(jiǎn)圖的構(gòu)建體以編碼本發(fā)明的嵌合多 肽。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體通常編碼沒有10個(gè)C端氨基酸的無活性CAT酶并且包括一或兩 個(gè)組氨酸置換氨基酸。通過去除Hisl93的咪唑基(典型的CATm變體中的His 195)滅活 CAT酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過去除His 193和鄰近的His 192 (對(duì)于CATm來說分別是 Hisl95和Hisl94)的咪唑基滅活CAT酶。從CAT的活性位點(diǎn)去除重要的His 193 (CAT111 中是His 195)咪唑基以及用丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸的置換引起CAT酶的基本 上失活(參見例如 Lewendon A et al. (1994) Replacement of catalytic histidine—195 of chloramphenicol acetyl transferase :evidence for a general base role for glutamate. Biochemistry. 33(7) :1944-50 ；White et al. , (2000)Characterization of Chloramphenicol and Florfenicol Resistance in Escherichia coli associated with Bovine Diarrhea. J. Clin. Micro 38 (12)p4593_4598，為 了所有目的每篇均援引加入本 文)。最后，本文實(shí)施方案還可以包括通過單獨(dú)去除Hisl92(對(duì)于CAT111來說是Hisl94)的 咪唑基的CAT酶失活。至于Hisl93，置換可以用丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸。在一些方面，一或多個(gè)置換的組氨酸氨基酸由位于SEQ ID NO :2的位置號(hào) 574-576和577-579(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3中氨基酸編號(hào)192和19 的核酸編碼。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列包括SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。本文包 括組氨酸置換構(gòu)建體的本發(fā)明嵌合蛋白提供很少或沒有CAT活性的高免疫原性蛋白，是對(duì) 現(xiàn)有領(lǐng)域的顯著改進(jìn)。滅活的CAT酶實(shí)施方案與本發(fā)明的促生長素抑制素多肽結(jié)合。這種 結(jié)合直接完成或利用接頭完成(下文將更全面的描述)。Hisl92和Hisl93位點(diǎn)的CAT失活可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量方法實(shí)現(xiàn)，包括定點(diǎn)誘變和合成基因組裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼組氨酸193或組氨酸192的核酸序 列被修飾以編碼丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼組氨酸192 和193 二者的核酸序列被修飾為編碼丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸。對(duì)于192和193嵌 合多肽的典型置換包括丙氨酸，丙氨酸，丙氨酸，甘氨酸，甘氨酸，丙氨酸，甘氨酸，甘氨酸。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括本發(fā)明CAT缺陷型多肽的氨基酸序列，包括具有SEQ ID NO :7、8和3的氨基酸序列(對(duì)應(yīng)于193位的his- > gly，193位的his- > ala以及192和 193 位的 his- > gly)。本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)以下事實(shí)CAT酶可以被滅活并用做治療本文的疾病和 /或病癥(特別是哺乳動(dòng)物)中呈遞促生長素抑制素-14的載體蛋白。未滅活的CAT已經(jīng)被 描述成在多個(gè)世界范圍的革蘭氏陰性菌分離物中引起對(duì)氯霉素和氟苯尼考(Florfenicol) (氟化類似物)的質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌抗性的酶。未滅活的CAT的用途(如US 6316004B1所 述)在這些科學(xué)發(fā)現(xiàn)之前。因此，根據(jù)現(xiàn)在理解和建立的標(biāo)準(zhǔn)，由于安全性的關(guān)注(即產(chǎn)生 更多抗生素抗性宿主)而使用未滅活的CAT是禁忌的。氯霉素在約60年前發(fā)現(xiàn)，主要用做 抗生素。數(shù)種健康關(guān)注由這類使用引起，包括藥物受體患上再生障礙性貧血。此外，當(dāng)持續(xù) 使用抗生素氟化類似物時(shí)(例如在牛產(chǎn)業(yè)中)，由于質(zhì)粒編碼的基因，增加數(shù)種細(xì)菌菌株變 為是抗生素抗性的。盡管氯霉素被持續(xù)用于滴眼劑以治療細(xì)菌性結(jié)膜炎，但在美國它不被 用于治療帶有其他細(xì)菌的疾病。因此，在哺乳動(dòng)物尤其是人中在任意物質(zhì)中使用滅活CAT 酶的實(shí)現(xiàn)和發(fā)展是令人驚奇的，其中本說明書自始至終描述的基于載體蛋白使用的效益同 時(shí)避免活性CAT的顯著健康關(guān)注提供對(duì)本文描述的疫苗的顯著改進(jìn)。應(yīng)注意與小分子一起使用的這些CAT的“載體”相關(guān)改進(jìn)描述于共同未決和相關(guān) 的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US08/68195以及美國專利號(hào)6，316，004，為了所有目的這兩篇 均援引加入本文。尤其是，本發(fā)明人在此處出乎意料地發(fā)現(xiàn)滅活的CAT酶作為促生長素抑 制素-14的載體蛋白可以避免與酶有關(guān)的顯著健康風(fēng)險(xiǎn)，其利用嵌合蛋白增強(qiáng)的免疫原性 能力，對(duì)酶降解的抗性，增加的半衰期和患者巨噬細(xì)胞增強(qiáng)的攝取。如圖1所示，可以通過不同長度的接頭或間隔物將無活性的CAT酶與促生長素抑 制素-14連接。要求間隔物確保編碼的促生長素抑制素在球形表面呈現(xiàn)。本文的間隔物實(shí) 施方案提供最佳蛋白酶抗性和最佳表位暴露，并且顯示相對(duì)于沒有本發(fā)明接頭序列的構(gòu)建 體的出乎意料的改進(jìn)。因此，間隔物實(shí)施方案已經(jīng)在長度和組成上被優(yōu)化以確保CAT缺陷型促生長素抑 制素在各種微生物尤其是大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。美國專利號(hào)6，316，004描述的原始 構(gòu)建體包括具有稀有大腸桿菌密碼子的間隔物和需要來自第二或輔助質(zhì)粒的稀有tRNA的 共表達(dá)。本文的間隔物實(shí)施方案去除這些罕見的大腸桿菌密碼子，從而去除對(duì)第二輔助質(zhì) 粒的需要，是對(duì)先前技術(shù)的改進(jìn)。在典型實(shí)施方案中，間隔物具有 tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctc gcccacgtccggaattcatg (SEQ ID NO 9)的核酸序列。本發(fā)明間隔物的一個(gè)實(shí)例具有 welhrsgprprprprpefm(SEQ ID NO :10)的氨基酸序列。本發(fā)明間隔物的典型氨基酸序列是 WelhrSgp(rp)nefm，其中η > 1(SEQ ID NO :11)。如上所述，這些新的間隔物序列提供增強(qiáng) 的蛋白酶抗性(從而允許與美國專利號(hào)6，316，004公開的構(gòu)建體相比增加的產(chǎn)量)和最佳 促生長素抑制素-14暴露。當(dāng)為了疾病治療而用于免疫目標(biāo)患者時(shí)，通過最佳配置的接頭將促生長素抑制素與滅活CAT酶連接的這種組合顯示出乎意料的改進(jìn)。這些構(gòu)建體被用作 抗原治療基于生長激素和胰島素樣生長因子1缺陷的疾病。此外，與單獨(dú)的促生長素抑制素-14相比，這些嵌合構(gòu)建體顯示增強(qiáng)的保存穩(wěn)定 性。此外，本發(fā)明基于促生長素抑制素的抗原提供患者中更長的半衰期，給予這些材料對(duì)降 解增強(qiáng)的抗性。注意到其他載體多肽可以取代滅活的CAT來連接促生長素抑制素。例如， 促生長素抑制素-14可以與替代滅活CAT酶的KLH、破傷風(fēng)類毒素或CRM組合。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供用于增強(qiáng)目標(biāo)患者中體液免疫的誘導(dǎo)的新的佐劑組合 物。這些佐劑組合物提供在誘導(dǎo)體液應(yīng)答方面相對(duì)常規(guī)材料的顯著改進(jìn)并且對(duì)于用于人類 目標(biāo)是安全的。本文的佐劑組合物被用于基于促生長素抑制素的抗原以產(chǎn)生本發(fā)明的疫 苗。本發(fā)明的疫苗然后被用于治療基于GH和/或IGF-I缺陷的疾病或病癥。在本文的實(shí)施方案中，佐劑組合物的所有成分具有非人來源，從而消除了接種人 被可能污染的佐劑成分的可能的交叉污染。例如，本文的實(shí)施方案可以利用不含動(dòng)物來源 的Tween 80。令人驚訝的是，與動(dòng)物來源的Tween 80相比，不含動(dòng)物來源的Tween 80在本 文的疫苗使用中顯示顯著更好的結(jié)果，并且消除了基于動(dòng)物的對(duì)疫苗污染的可能性，例如 牛海綿狀腦病(BSE)。此外，與動(dòng)物來源的Tween 80相比，不含動(dòng)物來源的Tween 80顯示 更好的乳化能力，為其按照本文實(shí)施方案的用途提供額外的出乎意料的益處。此外，本文的佐劑實(shí)施方案也不含苯和其他類似致癌化合物。這些實(shí)施方案提供 大部分常規(guī)佐劑復(fù)合物中沒有的安全效益。例如，本文實(shí)施方案利用Carbopol 974P或不 含苯的多環(huán)酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫佐劑包括Carbopol基質(zhì)，角鯊烯基質(zhì)和阿拉伯半乳聚糖 溶液。更詳細(xì)地，Carbopol基質(zhì)使用于水或鹽水的Carbopol 974P制備。角鯊烯基質(zhì)是從 角鯊烯、非動(dòng)物來源的Tween 80和Span 85的組合制備的。在一些實(shí)施方案中，角鯊烯基 質(zhì)是MF59 (Chiron Corp. , Emeryville, CA) 0阿拉伯半乳聚糖溶于PBS或鹽水。佐劑組合 物與本發(fā)明的嵌合多肽組合產(chǎn)生本發(fā)明疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫佐劑包括Carbopol基質(zhì)，角鯊烯基質(zhì)和西黃蓍膠素溶 液。更詳細(xì)地，Carbopol基質(zhì)使用于水或鹽水的Carbopol 974P制備。角鯊烯基質(zhì)是從角 鯊烯、非動(dòng)物來源的Tween 80和Span 85的組合制備的。純化的西黃蓍膠素溶于PBS或鹽 水。佐劑組合物與本發(fā)明嵌合多肽組合產(chǎn)生本發(fā)明疫苗。具體的佐劑組合和濃度顯示于實(shí)施例3。根據(jù)本發(fā)明的佐劑對(duì)于人類使用是安全 和有效的，避免了動(dòng)物產(chǎn)品，避免了基于石油的烴類，并且避免了致癌化合物。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明多核苷酸分子的載體，以及利用這類載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞?？梢詫⒈景l(fā)明的任意多核苷酸分子與載體(其通常包括選擇性標(biāo)記和感興趣增殖宿主 的復(fù)制起點(diǎn))相連。宿主細(xì)胞被遺傳工程化以包括這些載體，從而表達(dá)本發(fā)明的多肽。通 常，本文的載體包括與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列(諸如用于微生物或病毒宿主細(xì)胞的那 些)可操作的連接的本發(fā)明多核苷酸分子。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，操縱基因，或 增強(qiáng)子，mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的適當(dāng)序列。當(dāng)本文的調(diào)節(jié)序列功能 上涉及本發(fā)明的嵌合多肽編碼多核苷酸時(shí)，核苷酸序列是可操作連接的。典型的載體包括質(zhì)粒，酵母穿梭載體，桿狀病毒，滅活的腺病毒等。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是被修飾的pET30b CatSom質(zhì)粒(參見圖1)。用于本文的靶宿主細(xì)胞包括細(xì)菌 宿主，例如大腸桿菌，酵母，SF-9昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，綠色植物等。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列包括用于在大腸桿菌或其他類似微生物中表達(dá)本發(fā) 明嵌合多肽的T71aC，CAT，Trp或T5啟動(dòng)子。這些調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域已知的，在合適的和已 知的條件下使用。已經(jīng)構(gòu)建出本發(fā)明的各種質(zhì)粒以通過使用靶調(diào)節(jié)序列表達(dá)本發(fā)明的嵌合多肽。示 例性的質(zhì)?？砂═71ac啟動(dòng)子(參見圖1)。用于表達(dá)靶嵌合多肽的宿主細(xì)胞包括原核生物，酵母和更高級(jí)的真核細(xì)胞。示 例性的原核宿主包括埃希氏菌屬(Escherichia)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和沙門氏菌屬 (Salmonella)以及假單胞菌屬(I^seudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的細(xì)菌。在典 型實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞屬于埃希氏菌屬，可以是大腸桿菌。宿主細(xì)胞(酵母或細(xì)菌)還可 以用于產(chǎn)生作為病毒樣粒子(VLP)的本發(fā)明靶多肽。如下文實(shí)施例所示，本發(fā)明的構(gòu)建體提供各種條件下最佳的CAT缺陷型促生長素 抑制素表達(dá)。這些構(gòu)建體對(duì)于在原核宿主(尤其是埃希氏菌屬的細(xì)菌)中表達(dá)特別有效。用于本發(fā)明疫苗的不含內(nèi)毒素的融合蛋白本發(fā)明的方面包括使用不含內(nèi)毒素的、密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制 素。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用合適的含促生長素抑制素的載體轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞來制備本發(fā)明 的包括嵌合免疫原性促生長素抑制素的蛋白。如上所述，用于本文的載體包括適于在選定 的靶細(xì)胞中表達(dá)的已知質(zhì)粒和載體系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在靶宿主細(xì)胞中表達(dá)包括嵌合免疫原性促生長素抑制素的 蛋白。利用靶調(diào)節(jié)序列進(jìn)行嵌合蛋白表達(dá)。在一些方面，為了在大腸桿菌中表達(dá)已經(jīng)將嵌 合多肽優(yōu)化(特別是關(guān)于本文公開的間隔物序列)。然后根據(jù)已知的蛋白純化技術(shù)(包括例如溶菌酶裂解，包涵體的差速離心，篩網(wǎng) 層析等)純化嵌合蛋白。重折疊方法可以在堿性PH的氯化胍和尿素中進(jìn)行，然后進(jìn)行透析 和凍干。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用含密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制素質(zhì) 粒-pET30b CatSom轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；pET30b CatSom具有用于表達(dá)的合適大腸桿菌基礎(chǔ) 調(diào)節(jié)序列。一些情況下，大約十升這些細(xì)胞的發(fā)酵提供至少500克總生物量，一些情況下提 供600克總生物量，產(chǎn)生約4-6克的總蛋白。從銀和考馬斯藍(lán)染色估算約一半的蛋白是靶 嵌合蛋白(參見實(shí)施例2和圖2)。在本文一些實(shí)施方案中，從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞純化處于基本上不含內(nèi)毒素狀態(tài)的本 發(fā)明嵌合蛋白。額外的純化將內(nèi)毒素去除或降低到根據(jù)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)人來說可接受的水平。因此，本文的一些實(shí)施方案涉及用于疫苗的基本上不含內(nèi)毒素的嵌合蛋白的產(chǎn) 生。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)毒素水平是lEU/ml或低于lEU/ml，在其他實(shí)施方案中，內(nèi)毒素水 平被基本上消除，即本發(fā)明的嵌合多肽基本上不含內(nèi)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，從裂解宿主細(xì)胞回收的IB用不含內(nèi)毒素的清洗液清洗多次。 任選地，清洗回收的IP沉淀直至內(nèi)毒素水平低于大約lEU/ml (內(nèi)毒素檢測(cè)可以使用一或 多種已知的測(cè)定法進(jìn)行，包括商品化供應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，來自MP Biochemicals, CharlesRiver等)。在一些實(shí)施方案中，清洗緩沖液是不含內(nèi)毒素的，包括一或多種蛋白水解蛋白 抑制劑，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)。在一些實(shí)施方案中，清洗緩沖液是含有抑制有效量的 PMSF和/或氨乙基-苯磺酰氟鹽酸鹽(AEBSF)的磷酸緩沖鹽水(PBS)。在一些方面，基本上不含內(nèi)毒素的沉淀可以用pH 12. 5的含尿素的蛋白解折疊溶 液處理并在含降低摩爾濃度的尿素以及精氨酸、甘油和/或蔗糖的蛋白重折疊溶液中進(jìn)行 重折疊。將純化的嵌合蛋白濃度調(diào)整為1到^rig/ml之間，通常是大約1. 4到1. 8mg/ml。一 些情況下，按照約1. 5到5mg/2ml劑量和更常見的2. 0到3. 5mg/2ml劑量給疫苗制劑提供 基本上不含內(nèi)毒素的嵌合蛋白。還可以使用其他內(nèi)毒素去除方法，例如商品化供應(yīng)的離子 交換內(nèi)毒素去除柱，疏水柱等。疫苗本發(fā)明的疫苗是本文描述的免疫佐劑與用于預(yù)防或治療人疾病狀態(tài)的靶抗原的組合。用于本文疫苗實(shí)施方案的藥物劑量包括l_5mg嵌合多肽。在本文所有實(shí)施方案 中，疫苗應(yīng)當(dāng)是無菌的、液體的并且在制備和保存條件下是穩(wěn)定的?？梢酝ㄟ^添加各種抗細(xì) 菌劑和抗真菌劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，山梨酸，硫柳汞等)實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用 的預(yù)防。本文的疫苗通常包括總蛋白量從約lmg/2ml到3mg/2ml劑量的抗原，其中大約5% 到25%的劑量是佐劑，更常見的約10%到20%的劑量是佐劑。在一些實(shí)施方案中，佐劑占 劑量的約18%。為了說明目的，本發(fā)明的佐劑與基于促生長素抑制素的多肽組合以提供用于治療 基于人生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷的疾病和/或病癥的疫苗。應(yīng)注意本文描 述的佐劑可以與其他抗原組合以產(chǎn)生用于治療其他目標(biāo)人類疾病的新的疫苗。治療人類疾病的方法本發(fā)明提供包含本發(fā)明嵌合多肽和佐劑的藥物等級(jí)疫苗。可以給患有生長激素和 /或胰島素樣生長因子1缺陷的患者施用這類疫苗以促進(jìn)來自患者內(nèi)源的適當(dāng)釋放。給患有生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷的患者提供本發(fā)明的疫苗。在一 個(gè)實(shí)施方案中，在治療期間提供本發(fā)明的疫苗1到2次，以及3到5次加強(qiáng)。典型的疫苗抗 原量是1到5mg/ml嵌合多肽?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)施用疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過皮 下注射施用疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過皮內(nèi)注射，肌肉注射或輸注施用疫苗。本發(fā)明的疫苗實(shí)施方案還可以包括分散劑或濕潤劑，懸浮劑，或其他類似材料。例 如，實(shí)施方案可以包括無菌油類，合成的甘油單酯或甘油二酯，脂肪酸或油酸。疫苗通常被制備為無菌水溶液。這些溶液在制備和保存條件下是穩(wěn)定的。一些方 面，疫苗可以包括其他物質(zhì)以預(yù)防微生物作用，例如抗細(xì)菌劑或抗真菌劑。本發(fā)明的疫苗溶液通過加入需要量的材料(抗原，佐劑，其他成分)來制備，之后 是最終消毒，例如通過紫外線或臭氧處理?？蛇x的，在最后配制之前使用分別滅菌的成分制 備本發(fā)明的疫苗溶液(這種情況下不需要最終消毒)?？梢员O(jiān)測(cè)接受本發(fā)明疫苗實(shí)施方案的患者的治療進(jìn)展并提供額外的施用。生長激 素水平的增加，胰島素樣生長因子1水平的增加以及功能上的利益(例如肥胖患者可接受 的體重減輕)都是監(jiān)測(cè)治療有效性的靶。此外，當(dāng)1型或2型糖尿病或肥胖癥正在接受治療時(shí)，可以監(jiān)測(cè)血糖，IGF-I水平，脂譜，胰島素水平和血紅蛋白結(jié)合的Alc(HbAlc)水平以 確定對(duì)患者治療的有效性。根據(jù)個(gè)體患者的進(jìn)展，可以使用更多或更少的本發(fā)明抗原進(jìn)行 額外的疫苗注射。此外，由衛(wèi)生保健專業(yè)人員確定，可以使用可選擇的佐劑組合來改變特定 患者對(duì)接種的應(yīng)答。本文的實(shí)施方案可以與用于目標(biāo)生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷疾病狀 態(tài)或病癥的其他常規(guī)療法組合。例如，本發(fā)明的接種可以與1型糖尿病治療的胰島素替代 法組合，或接種可以與嚴(yán)重肥胖癥患者的體重減輕手術(shù)或低熱量飲食組合。已經(jīng)大概描述了本發(fā)明，通過參考下列實(shí)施例(提供其是為了解釋而不是作為限 制)相同內(nèi)容將更容易理解。
實(shí)施例提供下列實(shí)施例只是為了說明目的，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 構(gòu)建CAT-缺陷型促生長素抑制素融合蛋白當(dāng)前實(shí)施例舉例說明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的CAT缺陷型促生長素抑制素融合 蛋白的產(chǎn)生。在質(zhì)粒pET30b-Cat-Som上進(jìn)行定點(diǎn)誘變以用甘氨酸殘基置換Hisl92和 Hisl93 (修飾后:Glyl92和Glyl93)。Hisl93 (和Hisl92)殘基的失活消除了 CAT酶接受質(zhì) 子的能力，從而提供CAT的完全失活。相同pET30b-Cat-SOm(具有His置換)中的間隔物為了在沒有共表達(dá)的tRNA分 子的情況下由大腸桿菌表達(dá)而進(jìn)行密碼子優(yōu)化。修飾的CAT缺陷型促生長素抑制素核酸構(gòu)建體如SEQ ID N0:12所示。CAT缺陷 型促生長素抑制素融合蛋白序列如SEQ ID NO :13所示，與未修飾的CAT促生長素抑制素融 合蛋白(SEQ ID NO 14)進(jìn)行比較。實(shí)施例2 =CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白可以高水平表達(dá)如實(shí)施例1描述的密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制素構(gòu)建體用于在 BL21 (DE3)細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在LB中生長并用0. 4mMIPTG誘導(dǎo)大約3小時(shí)。 將1毫升來自密度為OD 0. 7的培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀，在100μ 1 SDS樣品緩沖液中在70°C加 熱十分鐘。每條泳道上樣40 μ 1細(xì)胞提取物樣品進(jìn)行SDS-PAGE。如圖2所示，用IPTG誘導(dǎo)后在泳道1 (LB+IPTG，還原的)和3 (LB+IPTG)觀察到一 條^KD條帶，其對(duì)應(yīng)于密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白的預(yù)測(cè)大小。在 對(duì)照泳道2(LB，還原的)和4(LB)沒有看到表達(dá)。與預(yù)期一致，當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)或還原條件下電泳 時(shí)融合蛋白的大小不存在差異。實(shí)施例3 包含無內(nèi)毒素的密碼子優(yōu)化的CAT缺陷型促生長素抑制素的疫苗根據(jù)本發(fā)明的示例性疫苗試劑溶液LCarbopol 基質(zhì)a.將0. 5克Carbopol 974P溶于水或鹽水；b.混合并煮沸以溶解，然后高壓滅菌；c. 4°C 保存。2.角鯊烯基質(zhì)
a.混合 58. Iml 角鯊烯，4. 6ml 非動(dòng)物來源的 Tween 80 和 5. 2mlSpan 85 ；b.通過0. 2 μ濾器將混合物過濾；c. 4°C 保存。3.西黃蓍膠素溶液a.利用甲醇提取西黃蓍膠；b.收集不溶于甲醇的組分；c.在室溫干燥；d.室溫下干燥狀態(tài)保存；e.將1克干的西黃蓍膠素添加到水或鹽水中；f.混合并煮沸以溶解，然后高壓滅菌；g. 4°C 保存。疫苗制備1.按照5mg/ml或更低在鹽水或PBS中制備疫苗抗原；2.向混合瓶中添加6. 79ml角鯊烯基質(zhì)；3.向角鯊烯基質(zhì)中添加IOml Carbopol基質(zhì)(CS)；4.充分混合；5.向CS溶液中添加IOml西黃蓍膠素溶液；6.充分混合；7.添加未稀釋的或稀釋的用于鹽水或PBS的疫苗抗原到終體積82ml ；8.添加Iml的1 %硫柳汞溶液，充分混合；9. 4°C保存疫苗直至使用。根據(jù)本發(fā)明的另外可選的示例性疫苗試劑溶液LCarbopol 基質(zhì)a.將0. 5克Carbopol 974P溶于水或鹽水中；a.混合并煮沸以溶解，和高壓滅菌；b. 4°C 保存。2.角鯊烯基質(zhì)a.混合58. Iml角鯊烯，4. 6ml非動(dòng)物來源的Tween 80和5. 2mlSpan 85，并通過 0. 2 μ濾器過濾；b. 4°C 保存。3.阿拉伯半乳聚糖溶液a.將1-10克阿拉伯半乳聚糖加入PBS或鹽水中；b.混合并煮沸以溶解，和高壓滅菌；c. 4°C 保存。疫苗制備1.按照5mg/ml或更低在鹽水或PBS中制備疫苗抗原；2.向混合瓶中添加6. 79ml角鯊烯基質(zhì)；3.向角鯊烯基質(zhì)中添加IOml Carbopol基質(zhì)；
4.徹底混合并添加IOml阿拉伯半乳聚糖溶液；5.添加未稀釋或稀釋的用于鹽水或PBS的本發(fā)明抗原到終體積82ml ；6.添加Iml的1 %硫柳汞溶液，混合疫苗；和7. 4°C保存疫苗直至使用。實(shí)施例4 使用實(shí)施例3的疫苗治療心血管病本實(shí)施例使用患有左心室功能障礙的大鼠，按照Genentech，1995刊登的方案制 備。將大鼠分為兩組(每組中每個(gè)成員具有結(jié)扎的左冠狀動(dòng)脈)，第一治療組接受本發(fā)明 的接種，第二對(duì)照組(沒有接種，但其他方面的治療相同)。治療組的每個(gè)成員接受接種， 21天后然后接受第二次接種，肌內(nèi)施用(lml/劑量)。在第0天、第21天和第42天測(cè)量血 清IGF-I水平和抗促生長素抑制素抗體。在第42天還測(cè)量兩組的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)并且測(cè) 定梗塞面積和心臟指數(shù)。預(yù)期接受兩次接種(如實(shí)施例3所述)的大鼠組與對(duì)照組相比具有實(shí)質(zhì)上改善的 心臟功能(減少的梗塞面積和改善的心臟指數(shù))。實(shí)施例5 使用實(shí)施例3的疫苗治療肥胖癥使用Vickers等Q001)描述的大鼠肥胖癥模型來確定本發(fā)明疫苗對(duì)肥胖癥的作 用。給大鼠喂食高熱量飲食30到60天。稱重高熱量大鼠，將其分成三組一鹽水對(duì)照組， 繼續(xù)高熱量飲食的接種組，和正常熱量飲食組。接受接種的大鼠在第0天和第21天接受 2Xlml的肌內(nèi)劑量。在整個(gè)研究期間每周稱重所有大鼠。第42天，稱重所有大鼠，收集血 清進(jìn)行IGF-I分析、尿素分析和抗促生長素抑制素抗體水平。預(yù)期接受實(shí)施例3所述接種的大鼠將相對(duì)鹽水對(duì)照組具有實(shí)質(zhì)上改善的重量控 制并顯示相應(yīng)的血清結(jié)果(與生長激素改變引起的重量控制有關(guān))。接種組將顯示與正常 熱量攝入組基本上相同的重量控制。實(shí)施例6 使用實(shí)施例3的疫苗治療生長缺陷使用Iml劑量每月接種3周齡Cox (CD)大鼠，共3個(gè)月。每次接種在肌內(nèi)或皮下進(jìn) 行。對(duì)照大鼠將接受鹽水注射，使用相同的施用方式和相同體積的施用材料。稱重所有大 鼠以確定每周基礎(chǔ)上的生長并在第0，4，8，12和16周采血。按照類似的日程表收集血清， 分析IGF-1、尿素和抗促生長素抑制素抗體水平。預(yù)期接受實(shí)施例3所述接種的CD大鼠與對(duì)照CD大鼠相比將具有實(shí)質(zhì)上改善的生 長。治療大鼠應(yīng)當(dāng)顯示證實(shí)接種對(duì)治療大鼠作用的血清結(jié)果。實(shí)施例7 增加的促生長素抑制素導(dǎo)致小鼠體重增加進(jìn)行小鼠肥胖癥研究以觀察外源施用的促生長素抑制素是否將造成小鼠體重增 加。在遠(yuǎn)交小鼠上進(jìn)行七天研究，其中將3種不同的本發(fā)明佐劑與重組促生長素抑制素組 合(佐劑被稱為JH 14，JH 17和JH 18)。每份佐劑添加lmg/ml重組產(chǎn)生的促生長素抑制 素(2009年生產(chǎn))，一種佐劑(JH14)還添加2007年產(chǎn)生的濃度為2. 57mg/ml的促生長素抑 制素。對(duì)照組的小鼠接受無菌鹽水注射。在研究開始時(shí)稱重每只小鼠以確定基準(zhǔn)重量。在第0天通過IP注射0. 5ml疫苗 進(jìn)行每只小鼠的接種。給雌性小鼠施用在JH17和18佐劑中的促生長素抑制素，給雄性小 鼠施用在JH14中的促生長素抑制素。在7天期間給小鼠喂食正常飲食，第7天再稱重每只 小鼠。
如圖3所示，接受促生長素抑制素的遠(yuǎn)交小鼠維持健康狀態(tài)，在一周研究期間幾 乎不顯示不利作用。JH17組的雌性小鼠具有重量增加，而雌性JH18小鼠的重量增加與對(duì)照 小鼠相似。兩個(gè)JH14組(2007和2009)的雄性小鼠均顯示超過對(duì)照組雄性小鼠的體重增 加。圖3的全部發(fā)現(xiàn)說明JH14、JH17和JH18佐劑可安全用于小鼠，高度一致并且能夠保存， 外源施用的促生長素抑制素通常引起靶小鼠的重量增加，提供證據(jù)證明促生長素抑制素參 與體重增加。所有效果發(fā)生在IP免疫數(shù)天內(nèi)。這歸因于直接的巨噬細(xì)胞加工和加速的抗 原和呈遞B淋巴細(xì)胞，取決于施用途徑、嵌合多肽的性質(zhì)和佐劑作用。JH14，17和18預(yù)混合物(Preblends)描述于下文和美國申請(qǐng)系列號(hào)PCT/ US08/68195 題為"Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT) -Defective Somatostatin Fusion Protein and Uses Thereof”。最終制劑具有Img蛋白抗原每Iml劑量。為此制劑
如下所示
JHl 7
重折疊的蛋白12ml (5.86mg/ml)
Dulbecco' s PBS 24.5ml
JHl7預(yù)混合物13. 4ml
硫柳汞0. 5ml
37% 甲醛 0. Iml
JH18
重折疊的蛋白12ml (5.86mg/ml)
Dulbecco' s PBS 24.5ml
JH18預(yù)混合物13. 4ml
硫柳汞0. 5ml
37% 甲醛 0. Iml
JH14
重折疊的蛋白12ml (5.86mg/ml)
Dulbecco' s PBS 27.8ml
JH14預(yù)混合物IOml
硫柳汞0. 5ml
37% 甲醛 0. Iml
應(yīng)注意上面的制劑包括硫柳汞和甲醛以限制疫苗的污染。在使用多劑量重復(fù)使用
瓶子分配疫苗時(shí)才使用這些材料，通常人和動(dòng)物治療方案將包裝在一次性使用小瓶中，從 而消除對(duì)這些防腐劑的需要。還應(yīng)注意更高水平的抗原用于2007JH14批次以彌補(bǔ)蛋白降解。實(shí)施例8 小鼠肥胖癥的治療使用來自Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)的小鼠進(jìn)行小鼠肥胖癥研 究。許多來自C57BL/6J品系的近交小鼠獲自Jackson Laboratories，所述小鼠是雄性， 顯示誘導(dǎo)的嚴(yán)重肥胖癥，具有多基因遺傳，并顯示成熟發(fā)作的肥胖癥。在先前的檢測(cè)中， Jackson Laboratories已經(jīng)確定這一特異小鼠品系當(dāng)喂食高脂飲食時(shí)患有實(shí)質(zhì)上非常類 似于在人群中報(bào)道的代謝綜合征表型。例如，喂食高脂飲食的C57BL/6J小鼠顯示內(nèi)臟肥胖，胰島素抗性，高胰島素血癥，高瘦素血癥，瘦素抗性和高血壓。進(jìn)行研究以檢測(cè)本文疫苗實(shí)施方案治療肥胖癥的有效性，即包括限制一些小鼠的 體重增加到引起C57BL/6J小鼠的體重減輕。給6周齡小鼠喂食60% kCal%脂肪飲食共6 周。然后將12周齡小鼠分到四組之一組1包括用包含JH14的疫苗治療的小鼠；組2包 括用包含JH17的疫苗治療的小鼠；組3包括用包含JH18的疫苗治療的小鼠，和組4包括用 PBS而不是任意類型的抗促生長素抑制素型抗原治療的對(duì)照小鼠。通過IP途徑使用0. 5ml 指定疫苗或PBS接種每組中的小鼠。22天后，使用0. Iml疫苗通過第二次IP劑量再次治療 小鼠。在整個(gè)研究期間(6周)，每只小鼠每周稱重兩次并監(jiān)測(cè)食物攝入，即確保重量變 化不是因?yàn)槭澄飻z入的減少或增加引起(參見圖4，顯示4組中每組的累積食物攝入)。 當(dāng)研究結(jié)束時(shí)對(duì)每只小鼠進(jìn)行最終放血，確定IGF-I水平(利用Diagnostic Systems Laboratories Inc. Active Mouse/Rat IGF-1ELISA (DSL-10-29200)測(cè)定 IGF-1 血菜水平)。如圖5和6以及表1所示，用JH14，17和18治療的小鼠在最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量百 分比中都顯示非常顯著的差異(P < 0. 0001)(通過參數(shù)或非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析)。前7天內(nèi)在 每個(gè)接種組中觀察到顯著的體重減輕，而對(duì)照組在相同時(shí)段內(nèi)顯示輕微體重增加。第22天 給JH14、JH17和JH18組施用第二劑量的疫苗(第1天提供劑量的l/5th)后也觀察到輕微 的體重減輕。來自小鼠肥胖癥研究的數(shù)據(jù)提供以下結(jié)論(1)盡管就IGF-lng/ml而言，JH18和 對(duì)照之間不存在統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，但通過參數(shù)或非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析在最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量 百分比中這些組之間存在非常顯著的差異(P < 0.0001) ； (2)在最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量百分 比中，通過兩種統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)JH17相對(duì)對(duì)照產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的差異；( JH18 (其具有135. Sng/ ml的平均IGF-I水平，高于JH17)，在基準(zhǔn)重量百分比(僅通過無參數(shù)檢驗(yàn))中顯示對(duì)JH17 的統(tǒng)計(jì)上顯著的差異；(4)在JH17和JH18佐劑中的本發(fā)明嵌合-促生長素抑制素抗原誘 導(dǎo)最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量百分比的統(tǒng)計(jì)上顯著的差異；( 就最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量百分比而 言，當(dāng)通過非參數(shù)分析與JH17相比時(shí)，JH18是統(tǒng)計(jì)上顯著的；(6) IGF-I水平與研究結(jié)束時(shí) 相對(duì)對(duì)照和JH17接種的更大的體重減輕有關(guān)(參見表幻；(7)因?yàn)樗薪臃N具有相同劑量 的本發(fā)明嵌合-促生長素抑制素抗原，在研究期間觀察到佐劑作用；(8)喂食60%kCal脂 肪飲食的近交C57BL/6J雄性小鼠顯示IP接種后第一周內(nèi)顯著的體重減輕；和(9)甚至當(dāng) 小鼠在整個(gè)研究期間進(jìn)食60kcal%脂肪飲食時(shí)，本文顯示的體重減輕也保持不變。表1 最終體重對(duì)基準(zhǔn)重量
權(quán)利要求
1.一種治療患者生長激素缺陷的方法，所述方法包括給患者施用免疫原性量的疫 苗，所述疫苗包括基于促生長素抑制素的抗原和佐劑，其中施用的疫苗在患有生長激素缺 陷的患者中引起生長激素水平的增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疫苗包括與基本上滅活的CAT酶功能性相連的促生長 素抑制素-14的嵌合多肽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述佐劑包括有效量的Carbopol974P。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述佐劑還包括角鯊烯和非動(dòng)物來源的Tween80。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是患有生長缺陷的成人。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是患有生長缺陷的兒童。
7.權(quán)利要求1的方法，其中正在進(jìn)行生長激素缺陷治療的患者患有粘膜病。
8.權(quán)利要求1的方法，其中正在進(jìn)行生長激素缺陷治療的患者患有心臟病。
9.權(quán)利要求1的方法，其中正在進(jìn)行生長激素缺陷治療的患者是肥胖的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是肥胖的狗。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是肥胖的貓。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是需要軟骨修復(fù)的馬。
13.一種治療患者胰島素樣生長因子1缺陷的方法，所述方法包括給患者施用免疫原 性量的疫苗，所述疫苗包括基于促生長素抑制素的抗原和佐劑，其中施用的疫苗在患有胰 島素樣生長因子1缺陷的患者中引起胰島素樣生長因子1水平的增加。
14.權(quán)利要求13的方法，其中正在進(jìn)行胰島素樣生長因子1缺陷治療的患者患有1型 或2型糖尿病。
15.權(quán)利要求13的方法，其中正在進(jìn)行胰島素樣生長因子1缺陷治療的患者患有應(yīng)激障礙。
16.權(quán)利要求13的方法，其中正在進(jìn)行胰島素樣生長因子1缺陷治療的患者患有心臟病。
17.一種用于治療脊椎動(dòng)物的疫苗的佐劑，所述佐劑包括 Carbopol 974P 基質(zhì)；角鯊烯基質(zhì)；和 阿拉伯半乳聚糖溶液；其中所述佐劑作為治療脊椎動(dòng)物的人生長激素或胰島素樣生長因子1缺陷的基于促 生長素抑制素的抗原的載體。
18.權(quán)利要求17的佐劑，其中所述角鯊烯基質(zhì)是角鯊烯、非動(dòng)物來源的Tween80和 Span 85的組合。
19.權(quán)利要求17的佐劑，其中基于促生長素抑制素的抗原是與基本上滅活的CAT酶相 連的促生長素抑制素-14。
20.權(quán)利要求17的佐劑，其中所述滅活的CAT酶中的一或多個(gè)野生型組氨酸殘基被丙 氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸置換。
21.一種用于治療患有生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷的患者的疫苗，所述疫 苗包括免疫原性量的基于促生長素抑制素的抗原；和包括至少Carbopol 974P，角鯊烯和阿拉伯半乳聚糖的佐劑。
22.權(quán)利要求21的疫苗，其中基于促生長素抑制素的抗原是與滅活的CAT酶相連的促 生長素抑制素-14。
23.權(quán)利要求22的疫苗，其中所述滅活的CAT酶中的一或多個(gè)野生型組氨酸殘基被丙 氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸置換。
24.一種治療患者肥胖癥的方法，包括給肥胖患者施用免疫原性量的疫苗，其中所述疫苗包括基于促生長素抑制素的抗原和 佐劑；以及監(jiān)測(cè)患者的治療進(jìn)展。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述患者是人，狗，貓和馬。
全文摘要
本發(fā)明提供在需要的患者中治療生長激素和/或胰島素樣生長因子1缺陷的組合物和方法。組合物和方法包括新的疫苗，其提供促生長素抑制素的免疫原性并引起內(nèi)源性產(chǎn)生的生長激素和/或胰島素樣生長因子1的釋放增加。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102119033SQ200980131325
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者A·R·門德爾松, J·拉里克, K·N·哈費(fèi)爾 申請(qǐng)人:布拉施生物技術(shù)有限責(zé)任公司