包含血管生成素的可口服給藥劑型及其用途的制作方法

專利名稱：包含血管生成素的可口服給藥劑型及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及口服制劑，特別是治療劑特別是蛋白質(zhì)的口服制劑，及其在治療方法 中的用途。
背景技術：
治療劑的口服給藥是理想的，因為其一般與患者對治療方案的最佳順應性聯(lián)系在 一起，并允許給藥安排的更大靈活性，同時避免了與注射給藥法有關的危險、不便和費用。 然而，采用口服途徑的能力受限于治療劑在口腔和消化道中禁受住酸和酶降解作用的能力 以及穿過上皮細胞層進入體循環(huán)的能力。具體地，這對于蛋白質(zhì)治療是一個問題，已知蛋白質(zhì)在消化道中要經(jīng)歷蛋白酶分 解并且難以進入體循環(huán)。幾乎所有的藥用蛋白質(zhì)都不能經(jīng)口服到達可用的程度。具體地， 已知激素如胰島素、生長激素、促卵泡激素或降鈣素，以及細胞素如干擾素或白細胞介素， 在不使用特殊制劑的情況下的口服利用率遠低于2%。在這樣的水平下，利用率的時間差異和個體間差異通常很高，致使口服給藥法不 實用、不經(jīng)濟或危險。蛋白質(zhì)藥物在藥物治療中的重要性正在不斷增加。然而，它們的應用受限于大多 數(shù)蛋白質(zhì)必須通過注射給藥的這一事實。雖然已經(jīng)建議使用系統(tǒng)給藥的其他途徑，如肺、鼻 或經(jīng)皮途徑，然而迄今只對有限的試劑開發(fā)了這些途徑并且受限于耐受性和單次劑量可遞 送的化合物量。為改善藥物的生物利用率已經(jīng)進行了多種嘗試。這些包括摻入滲透促進劑如水楊 酸鹽、脂質(zhì)-膽汁鹽混合劑、膠團、甘油酯和?；鈮A，但是發(fā)現(xiàn)這些在大多數(shù)情況下會造 成毒性問題。對于蛋白質(zhì)治療，改善口服利用率的嘗試包括將蛋白質(zhì)或肽與蛋白酶抑制劑(如 抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制劑和抑氨肽酶素)混合，以限制所給予的治療劑的降解。不幸的 是這些蛋白酶抑制劑是非選擇性的，內(nèi)源性蛋白酶也被它們抑制而產(chǎn)生不良作用。提供蛋 白質(zhì)口服制劑的其他嘗試單獨地利用保護涂層如腸溶衣，或者利用保護涂層如腸溶衣和通 過使所述蛋白質(zhì)或肽偶聯(lián)于兩性低聚物或多聚物而對所述肽進行的化學修飾，所述兩性低 聚物或多聚物包含例如親水的聚乙二醇基團和親脂的烷基基團。這些技術只取得了非常有 限的成功。另一種方法是添加放松胃腸道中緊密連接的賦形劑，但是這種方法造成耐受性 問題，因為所損壞的屏障可允許附近的所有分子進入，包括細菌。藻酸鈣包衣的脂質(zhì)體制劑 也可以用于肽類的結(jié)腸轉(zhuǎn)運。然而，到目前為止這種方法只具有有限的應用。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的一個目標是提供一種可以發(fā)揮生物效應的口服蛋 白制品。在本說明書中引用的所有的參考文獻，包括任何的專利和專利申請，均以引證的 方式納入本文?？梢郧宄乩斫猓m然本文中提及了若干現(xiàn)有技術的出版物，但是這種引用 并不構(gòu)成認可任何所述文獻的構(gòu)成本領域公知常識的一部分。

發(fā)明內(nèi)容
第一個方面提供了一種任何受益于血管生成素給藥的疾病的治療方法，其中血管 生成素經(jīng)口服給藥。特別考慮的是，血管生成素將經(jīng)口服給藥，而不需要載體或賦形劑，也不需要將所 述蛋白封裝或進行用于改善所述蛋白口服利用率的任何其他方法的處理。血管生成素是一種14kDa非糖基化的多肽，其由多種類型的生長細胞(包括血管 內(nèi)皮細胞、主動脈平滑肌細胞、成纖維細胞)和某些腫瘤(如結(jié)腸癌、卵巢癌和乳腺癌)產(chǎn) 生。血管生成素已從許多來源中分離，包括正常人血漿、牛血漿、牛乳，以及小鼠、兔和豬的 血清；也可以通過重組方法獲得，如人或牛的重組血管生成素。血管生成素涉及許多疾病和紊亂。所有可受益于血管生成素的口服給藥的治療 (包括現(xiàn)有技術提出的血管生成素的給藥)均納入本發(fā)明的范圍。盡管現(xiàn)有技術建議血管生成素的口服遞送作為給藥途徑細目清單中的一個，然而 以前并沒有證明血管生成素是口服生物有效的。因此閱讀關于血管生成素口服給藥的現(xiàn)有 技術建議的技術人員會認為載體、賦形劑、封裝或其他穩(wěn)定技術對于使血管生成素在消化 道中保持完整并且仍有能力穿過消化道壁進入血流是必需的。血管生成素不需要這些操作 就可以口服生物利用的發(fā)現(xiàn)是特別意料不到和令人吃驚的。特別地，血管生成素可作為食物或食品補充劑、作為營養(yǎng)品或作為藥物而經(jīng)口服 給藥。血管生成素可為人或牛的重組血管生成素或者提取自任何合適的來源如乳或血漿。特別考慮的是包含富集血管生成素的乳級分的營養(yǎng)組合物的口服給藥。這種級分 可使用實施例1所描述的方法或其他合適的方法制備。另一個方面提供了血管生成素的口服劑型。所述血管生成素口服劑型也可包含卵 泡抑素，或者所述血管生成素的口服劑型可以以一種包括卵泡抑素劑型的試劑盒的形式提 供。血管生成素的口服劑型可采用片劑、水性或油性懸浮劑、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒劑、乳 劑、膠囊、糖漿劑或酏劑的形式。


圖1示出了在攝取低劑量的血管生成素血管生成素)、中等劑量的血管生成 素(75mg血管生成素)和高劑量的血管生成素(150mg血管生成素)之后2小時和3小時 采集的血漿樣本的一維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中低劑量分別示于泳道1和2，中等劑 量分別示于泳道3和4，高劑量分別示于泳道5和6。在2小時和3小時的時間點上，血液 中血管生成素的水平均顯示出從低劑量到高劑量的明顯增加。圖2示出了在自由喂養(yǎng)條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼喂的血管生成素增加了 小鼠四頭肌的重量，所述小鼠飼喂1個月并且被允許在標準嚙齒動物轉(zhuǎn)輪上自由鍛煉。圖3示出了在自由喂養(yǎng)條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼喂的血管生成素增加導 致了小鼠肌肉纖維類型橫斷面積變化，所述小鼠飼喂1個月并且被允許在標準嚙齒動物轉(zhuǎn) 輪上自由鍛煉。對照動物的組平均值以白色條帶表示，血管生成素處理動物的的組平均值 以黑色條帶表示。給出標準偏差。圖4示出了在自由喂養(yǎng)條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼喂的血管生成素減小了MDX小鼠四頭肌中肌肉壞死的面積，所述小鼠被允許在標準嚙齒動物轉(zhuǎn)輪上自由鍛煉。
具體實施例方式一個方面涉及疾病的治療。本文使用的詞語“治療”和“療法”是指減輕癥狀的嚴 重性和/或頻率、消除癥狀和/或潛在病因、防止癥狀的發(fā)生(預防)和/或防止其潛在病 因，以及改善或矯正損傷。因此，例如本發(fā)明“治療”疾病的方法既包括在易感染個體中預 防疾病也包括有臨床癥狀的個體中治療疾病。本文使用的“治療”涵蓋對脊椎動物、哺乳動物特別是人的病癥的任何治療或預 防，并包括抑制病癥，如中止其發(fā)展；或緩解或改善所述病癥的影響，即使所述病癥的影 響減弱。本文使用的“預防”或“預防性的”或“預防的”療法包括在易患所述病癥但尚未被 診斷為患病的受試者中防止所述病癥發(fā)生或改善所述病癥的繼續(xù)發(fā)展。閱讀指出血管生成素可以口服給藥的專利說明書的本領域技術人員會理解將采 用某些用于改善血管生成素生物利用率的一些方法。已被建議給予血管生成素的已知紊亂或疾病包括那些需要血管發(fā)生的疾病。血管 生成素的口服治療因而被提出用于促進哺乳動物中血管網(wǎng)絡的發(fā)育(例如在心臟病發(fā)作 后的側(cè)枝循環(huán)中)，或促進例如關節(jié)或其他部位中的創(chuàng)傷愈合。血管生成素已經(jīng)被證明具有 許多其他活性，包括神經(jīng)保護作用(Subramanian et al.，(2007)Human MolecularGenetics vol. 17，no. 1ρ130-149)，并且已經(jīng)被提出可用于治療神經(jīng)變性疾病，例如ALS或運動神經(jīng) 元疾病(參見W02006/0M277)。血管生成素還被提出用于抑制初級活化T細胞和慢性感 染細胞中RNA病毒的復制，并且被提出用于治療由逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、囊病毒 科(Cystoviridae)、雙 RNA 病毒科(Birnaviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、日冕形 病毒禾斗(Coronaviridae)、黃病毒禾斗(Flaviviridae,)、披蓋病毒禾斗(Togaviridae)、“動脈 炎病毒屬”(Arterivirus)、星狀病毒科(Astroviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、 微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)、纖絲病毒禾斗(Filoviridae)、苜1J粘病毒禾斗(Paramyxoviridae)、彈狀 病毒科(Rhabdoviridae)、沙狀病毒科(Arenaviridae)和本雅病毒科(Bunyaviridae)引起 的RNA感染，并且被建議用于治療人免疫缺陷病毒(參見W02004/106491)。本發(fā)明人的共同未決的申請?zhí)岢鍪褂醚苌伤刂委熒婕奥雅菀炙氐募膊?，即?療個體中與肌肉生成抑制素相關疾病的方法，治療其中卵泡抑素和血管生成素之間的相互 作用可用于改善組織功能的疾病的方法，促進個體中肌肉生長的方法，改善個體中肌肉從 創(chuàng)傷或使用中恢復的方法，改善個體中肌肉力量的方法，改善個體中運動耐力的方法，增加 個體中肌肉比例的方法，減少個體中脂肪的方法和降低個體中脂肪與肌肉比例的方法。所 有這些方法都可以利用依照第一方面口服給藥的血管生成素。口服給藥的血管生成素的其他應用包括增加肌肉質(zhì)量、增加骨密度、減少肌肉萎 縮、或用于治療或預防如下病癥的方法其中肌肉生成抑制素的存在造成或促成不良的病 理效應或者肌肉生成抑制素水平的降低在哺乳動物優(yōu)選人中具有治療益處。此外，血管生 成素還可用于治療如下病癥其中肌肉生成抑制素未失調(diào)，但通過加入外源的血管生成素 可獲得改善的卵泡抑素介導的細胞刺激。
血管生成素可以用于降低病理病癥的嚴重性，所述病癥至少部分地由受試者的肌 肉或脂肪組織的異常量的發(fā)育或代謝活性所表征。血管生成素可被給藥以預防、改善或降 低消耗性疾病的嚴重性，所述消耗性疾病例如惡病質(zhì)、厭食癥、AIDS消耗綜合征、肌肉萎縮 癥、神經(jīng)肌肉病、運動神經(jīng)元疾病、神經(jīng)肌肉接點的疾病和炎性肌病。詞語“肌肉生成抑制素相關疾病”指肌肉、骨骼或葡萄糖平衡的疾病，并包括與異 常的肌肉生成抑制素相關的疾病。肌肉是一種主要作為能量來源發(fā)揮作用的身體組織。在體內(nèi)有三種類型的肌肉 a)骨骼肌——負責產(chǎn)生可以傳遞至骨骼以實現(xiàn)運動、維持姿勢和呼吸的力的橫紋??；b)心 肌——心臟肌肉；和c)平滑肌——在動脈壁和腸壁中的肌肉。第一方面的方法特別適用于 骨骼肌但也可對心肌和/或平滑肌具有一些效果。本文所稱骨骼肌還包括骨骼、肌肉和腱 之間的相互作用并包括肌肉纖維和關節(jié)。盡管之前已指出血管生成素由于其血管生成活性和向肌肉提供更多血流的能力 而對心肌有作用，然而這種作用被限制于可氧化的肌肉(I型和IIa型)。在第一方面中所 見的卵泡抑素介導的血管生成素對肌肉的作用不同于那些可通過所有受影響肌肉纖維而 證明的與血管發(fā)生有關的作用。所提出的血管生成素對健康個體的應用可用于專業(yè)運動員和業(yè)余運動員、健身 者、渴望減重以及增加體格和體力的勞動者。由于血管生成素在不同物種之間的序列和功能上是高度保守的，因此第一方面的 方法也適用于非人哺乳動物或鳥類[例如家畜(如犬和貓)、運動動物(如馬)、食物來源 動物(如牛、豬和羊)、鳥類(如雞、火鳥、其他獵禽或家禽)]，其中肌肉生成抑制素的存在 造成或促成不良的病理效應或者肌肉生成抑制素水平的降低具有治療益處。在第一方面方法的一個優(yōu)選實施方案中，血管生成素以一種血管生成素富集的乳 或血漿提取物的形式口服給藥。特別地，所述口服給藥的血管生成素是從牛乳或其級分制得的，例如使用實施例1 所描述的方法。這樣的級分已被發(fā)現(xiàn)可以提供能夠起到系統(tǒng)性作用而不在消化道中大量降 解的血管生成素。這樣的級分能夠經(jīng)口服提供而不需采用載體或其他方法來提高血管生成 素的生物利用率。所述口服給藥的血管生成素可為或包含重組血管生成素，特別是人源的重組血管 生成素。本文提到的“口服遞送”或“口服給藥”意圖包括任何向GI道的給藥或遞送，并包 括直接地向口咽腔給藥和經(jīng)口給藥，其中所述肽和多肽的實際吸收發(fā)生在胃腸道中，包括 胃、小腸或大腸。本文使用的口服給藥包括舌下給藥(通過施用于接受者的舌下來給藥，代 表一種經(jīng)口咽腔給藥的形式)和頰給藥(一種在接受者的牙齒和面頰之間的劑型給藥)?？诜f送和口服給藥在本文可互換地使用。如果血管生成素以功能性形式存在于被給予血管生成素的個體的血流中，那么血 管生成素就被描述為“生物有效的”?！肮δ苄孕问健笔侵改軌蚓哂携熜У难苌伤?。盡管已提出了口服給藥的血管生成素可能與內(nèi)源的卵泡抑素一起發(fā)揮作用，然而 本發(fā)明人證明了口服給予血管生成素和卵泡抑素(同時地或慣序地)的效果大于與單獨給 予卵泡抑素或單獨給予血管生成素的加和效果。
因此考慮口服給予血管生成素和卵泡抑素。血管生成素和卵泡抑素可同時在同一 或不同藥劑中經(jīng)口服提供，或者卵泡抑素可經(jīng)另外的途徑提供，例如腸胃外地或經(jīng)透皮貼 劑提供。血管生成素可以藥物、獸藥或營養(yǎng)組合物的形式或作為食物特別是功能性食物提{共。藥物組合物是一種適合對人類給藥的組合物。獸藥組合物是一種適合對動物給藥 的組合物。一般這些組合物會包含純化的血管生成素或者起碼所述組合物的所有組分都可 驗證。第一方面的方法中使用的口服給藥的藥物或獸藥組合物可包含一種或多種可藥 用的載體并任選地包含其他治療劑。每種載體、稀釋劑、佐劑和/或賦形劑都必須是“可藥 用的”?！翱伤幱玫妮d體”是指一種沒有生物學或其他不良作用的材料，即該材料可與所選 擇的活性藥物一起給予一個個體，而不造成任何不良的生物效應或者以有害的方式與所述 包含其的藥物組合物中的其他組分相互作用。類似地，本文提供的新化合物的“可藥用的” 鹽或酯是沒有生物學或其他不良作用的鹽或酯。本文所使用的“藥物載體”是一種用于向受試者遞送所述試劑的可藥用的溶劑、懸 浮劑或媒介物(vehicle)。所述載體可為液體的或固體的，并且是以計劃好的給藥方式選擇 的。每種載體都必須在沒有生物學或其他不良作用的意義上是“可藥用的”，即所述載體可 以與所述試劑一起給予受試者而不造成任何或大的副作用。卵泡抑素可以經(jīng)口服或腸胃外給藥。在用于卵泡抑素時，本文中使用的詞語“腸胃 外”包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、腔內(nèi)、經(jīng)皮和皮下注射，用于向肺部和 鼻腔給藥的氣霧劑或通過例如滲透泵的輸注給藥。血管生成素可以作為片劑、水性或油性懸浮液、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒劑、乳劑、膠 囊、糖漿劑或酏劑口服給藥。這樣的組合物可包含一種或多種選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑 和防腐劑的試劑以生產(chǎn)出藥學上美觀的和適口的制品。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄 糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯 烷酮、黃原膠、膨潤土、海藻酸或瓊脂。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃油、橘子油或 覆盆子油調(diào)味劑。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯 甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、 氯化鈉或滑石。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。片劑可包含與適合 制備片劑的無毒可藥用賦形劑混合的所述試劑。這些賦形劑可為，例如，(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)粒 化和崩解劑，如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和(4)潤滑劑，如 硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。這些片劑可不包衣的，也可通過已知技術包衣以延緩在胃腸道中 的崩解和吸收，從而在更長的時間內(nèi)提供持久的作用。例如，可采用延時材料如單硬脂酸甘 油酯或二硬脂酸甘油酯。用于腸胃外給藥的卵泡抑素制品包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。 非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及可注射的有機酯如油酸乙酯。 水性載體包括水，含醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化鈉，包括流體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑 (例如基于林格氏右旋糖的那些)的乳酸化林格氏靜脈內(nèi)媒介等。還可存在防腐劑和其他 添加劑，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、生長因子和惰性氣體等。所述組合物還可包含提供補充、附加或增強治療作用的其他活性化合物。所述藥 物組合物可與給藥說明書一起也被包含在容器、包裝或分配器內(nèi)。其他治療上有用的試劑，如生長因子(如BMPs、TGF_P、FGF、IGF)、細胞因子(如白 細胞介素和⑶Fs)、抗生素和對要治療病癥有益的任何其他治療劑可任選地被包括在內(nèi)或 者與血管生成素或血管生成素激動劑同時或慣序給藥。血管生成素或其激動劑也可以獸藥組合物的形式使用，所述獸藥組合物可例如通 過本領域中常規(guī)的方法制得。特別有利的是將所述獸藥或藥物組合物配制為單位劑型以便于給藥和保證劑量 的一致性。本文使用的單位劑型是指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理上分 開的單元；每個單元均包含經(jīng)計算可產(chǎn)生所需治療效果的預定量的活性化合物和所需的藥 物載體。單位劑型的規(guī)格由以下因素決定并且直接取決于所述因素活性化合物的獨特性 質(zhì)和要達到的具體治療效果，以及本領域中復合這一活性化合物以用于個體治療的固有限 制。包含血管生成素或其激動劑的藥物或獸藥組合物是以治療有效量進行給藥的。本 文所使用的，血管生成素的“有效量”是足以降低肌肉生成抑制素的活性以達到所需生物學 結(jié)果的劑量。所需生物學結(jié)果可能是任何治療益處，包括肌肉質(zhì)量的增加、肌肉力量的增 加、代謝的改善、肥胖程度的降低或葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改善。這樣的改善可通過多種方法測量， 包括測量以下指標的那些方法瘦體重和脂肪體重(如雙重射線掃描分析)、肌肉力量、血 清瘦素、血脂、血糖、糖化血紅蛋白、葡萄糖耐量以及糖尿病繼發(fā)并發(fā)癥的改善?！?，治療有效量可隨著受試者的年齡、健康狀況和性別，以及受試者醫(yī)學病癥的 嚴重程度而變化。劑量可由醫(yī)師確定并視需要調(diào)節(jié)以適應觀察到的治療效果。用于給予血 管生成素或其激動劑的合適劑量可為5mg到lOOmg，15mg到85mg，30mg到70mg，或^ig到 60mg。所述組合物可以一次劑量給藥或間隔給藥，如一天一次、一周一次和一月一次。劑量安排可以根據(jù)血管生成素或其激動劑的半衰期，或患者病癥的嚴重程度而調(diào) 整。一般，所述組合物以一次推注劑量的形式給藥，使得在給藥后最長時間內(nèi)血管生 成素的循環(huán)水平最大化。在所述推注劑量后還可使用連續(xù)輸注。還考慮的是利用營養(yǎng)組合物提供血管生成素的方法。并且提供了用于所述方法中 的營養(yǎng)組合物。本文使用的詞語“營養(yǎng)制品”是指從食物中——在本申請中從乳制品中——分離 或純化的可食用的產(chǎn)品，該產(chǎn)品被證明當口服給藥時具有生理益處或者對急性或慢性疾病 或損傷提供保護或減輕作用。因此所述營養(yǎng)制品可單獨或者與可食用的食物或飲料一起以 膳食制品或補充劑的形式存在。功能性食品是一種食品，其中已加入組合物使得該食品在口服給藥時具有生理學 益處或者對急性或慢性疾病或損傷提供保護或減輕作用。所述營養(yǎng)組合物或功能性食物可為可溶性粉末、液體或即飲制劑的形式?；蛘撸鰻I養(yǎng)組合物可作為食物以固體形式存在；例如以即食棒或早餐谷類食品的形式。還可存 在多種香料、纖維、增甜劑和其他添加劑。所述營養(yǎng)制品優(yōu)選地具有可接受的感官性質(zhì)(如可接受的嗅覺、味覺和適口性)， 并還可包含選自維生素A、Bi、B2、B3、B5、B6、B12、生物素、C、D、E、H以及鈣、鎂、鉀、鋅和鐵 中至少一種的維生素和/或礦物質(zhì)。所述營養(yǎng)組合物可以常規(guī)方式生產(chǎn)；例如，所述組合物可通過將蛋白質(zhì)和其他添 加劑混合在一起制得。如果使用的話，所述混合物中也可包括乳化劑。其他維生素和礦物 質(zhì)也可在此時加入，但經(jīng)常會晚一點加入以避免熱降解。如果需要生產(chǎn)粉末狀營養(yǎng)組合物，則可將蛋白質(zhì)與其他組分以粉末形式混合。所 述粉末應當具有低于約5重量％的水分含量。然后可混入水——優(yōu)選已進行反滲透處理的 水——形成液體混合物。如果所述營養(yǎng)組合物以即用液體形式提供，那么可將其加熱以減少細菌負荷。如 果需要生產(chǎn)液體營養(yǎng)組合物，那么優(yōu)選將所述液體混合物無菌地灌裝到合適的容器中。所 述容器的無菌灌裝可使用本領域中通常用的技術進行。進行這種無菌灌裝的合適設備是市售的。優(yōu)選地，所述營養(yǎng)組合物還包含一種或多種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。營養(yǎng) 組合物可包含緩沖液如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、 蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA ；佐劑 和防腐劑。所述營養(yǎng)制品可為嬰兒配方，特別是用于給予嬰兒的人源化乳配方。這樣的嬰兒 配方可用于治療發(fā)育停滯或早產(chǎn)或低出生體重的嬰兒。還可將其給予嬰兒或兒童以改善認 知功能。在第一方面的方法中使用的血管生成素可來自任何來源。它在來源上可為天然 的、合成的或重組的。重組的血管生成素可基于任何物種的血管生成素序列，包括人、奶牛、 綿羊、小鼠等。重組人血管生成素可購自R&D Systems.已知血管生成素存在于正常人血漿、牛血漿、牛乳、牛血漿以及鼠、兔和豬血清中。 至少人血管生成素的DNA和蛋白序列是可得到的，并且重組人血管生成素可以從Abnova Corporation (臺灣)購得以用于小規(guī)模的應用。在一個實施方案中，血管生成素從作為在商業(yè)規(guī)模上容易獲得的血管生成素來源 的家畜動物的血漿或乳中制得。乳可從任何泌乳動物得到，例如反芻類動物如奶牛、綿羊、水牛、山羊和鹿，非反芻 動物包括靈長類如人，以及單胃類動物如豬。在一個優(yōu)選的實施方案中，血管生成素是從牛 乳中提取的。生產(chǎn)血管生成素的動物可為被設計在其乳中過表達人或牛的血管生成素的轉(zhuǎn) 基因動物。本申請的發(fā)明人已證明在牛乳中，血管生成素在哺乳期的首個1到14天內(nèi)以最高 或最濃的量(最高達12mg/升)存在。之后，所述濃度降至約1到aiig/升的基礎水平。因 此，優(yōu)選在哺乳期首個14天內(nèi)得到的牛乳作為在第一到十一方面的方法中使用的血管生 成素來源。盡管哺乳期較晚期的牛乳中剩余血管生成素水平較低，然而它仍可在第一方面 的方法中用作來源。
第一方面的方法使用的血管生成素可能是分離的或純化的。分離的或純化的血管 生成素基本上不含至少一種與其天然伴隨的試劑或化合物。例如，分離的蛋白質(zhì)基本上不 含來自于獲得該蛋白的細胞或組織源的至少某些細胞物質(zhì)或污染蛋白。詞語“基本不含細 胞物質(zhì)”是指制品中血管生成素具有至少50%到59% (w/w)的純度，至少60%到69% (w/ w)的純度，至少70%到79% (w/w)的純度，至少80%到89% (w/w)的純度，至少90%到 95% (w/w)的純度，或者至少 96%、97%、98%、99%或 100% (w/w)的純度。在細菌中制備的重組血管生成素可用作血管生成素的來源，并且可以蛋白聚集體 的形式提供。由于牛乳是已存在于食物鏈中成百上千年的一種天然產(chǎn)物，因此用作營養(yǎng)制品的 血管生成素不必完全純凈。然而，為了減少要給予的組合物的量，血管生成素相對于其在乳 中的濃度被顯著濃縮是優(yōu)選的。優(yōu)選地，血管生成素以其在乳中濃度的至少10倍，更優(yōu)選 其在乳中濃度的20、30、40或50倍的濃度被給予。當作為食物提供時，血管生成素可以采用食物補充劑、營養(yǎng)制劑或嬰兒配方的形 式。本領域技術人員會理解自然界中存在牛血管生成素的變體并可被制備。本領域技術人員會理解所用的血管生成素可使用本領域可用的方法進行修飾以 改善貯藏穩(wěn)定性、生物活性、循環(huán)半衰期或用于其他目的。例如可能需要引用修飾以改善貯 藏穩(wěn)定性。然而，由于血管生成素特別耐降解，因此這樣的修飾不是必需的。第一方面涉及血管生成素的激動劑。激動劑是一種能直接或間接地通過由血管生 成素激活的受體起作用的化合物。優(yōu)選地，血管生成素激動劑通過所述血管生成素受體起 作用，并且優(yōu)選地結(jié)合所述受體。本領域技術人員會理解如何設計血管生成素的激動劑。合 適的激動劑包括血管生成素激動劑抗體和模擬化合物。血管生成素、其激動劑和變體都可用于制造用于在第一方面的方法中口服給藥的 藥劑，特別是以血管生成素富集的乳或血漿提取物的形式或以重組血管生成素的形式。具體地，所述口服給藥的血管生成素是從牛乳或其級分制得的，例如使用實施例1 所描述的方法。所述級分已被發(fā)現(xiàn)可以提供能夠系統(tǒng)性作用而不在消化道中大量降解的血 管生成素。所述級分能夠經(jīng)口服提供而不采用載體或其他方法來提高血管生成素的生物利 用率。預期血管生成素與內(nèi)源卵泡抑素相互作用(如果使用重組血管生成素)或者所述 血管生成素富集的提取物也可包含卵泡抑素。本文中已證明血管生成素加上卵泡抑素的 給藥(同時或以任何順序慣序地)具有大于加和的效果，因此每種治療方法都考慮給予卵 泡抑素和血管生成素。在個體缺乏卵泡抑素的情況下，卵泡抑素和血管生成素的共同給藥 (同時或慣序地)特別重要。由于卵泡抑素水平隨著年齡增長而降低，因此在治療老年人時 特別考慮卵泡抑素和血管生成素的共同給藥。在共同給藥方案中，血管生成素可口服給藥而卵泡抑素可口服或以其他方式給 藥?？赡艽嬖诓幌虢o予血管生成素的情況。由于發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)血管生成素在乳中可口 服利用，因此他們也提供了血管生成素濃度降低的乳以用于這樣的情況。在一個實施方案中，所述血管生成素濃度降低的乳的血管生成素比全脂或脫脂牛乳少40%、50%、60%、70%、80%、90%或基本上不含血管生成素。使乳的血管生成素降低的方法對本領域技術人員來說是顯而易見的。例如通過陽 離子交換柱或包含抗血管生成素的抗體的免疫親和柱的乳流的血管生成素與施加于所述 柱的乳樣本相比會降低。電透析法也被預期用于提供除去血管生成素(并且除去乳鐵蛋白 和乳酸過氧化物酶)的牛乳。實施例中提供了用于制備血管生成素含量降低的乳的合適方 法。在第一方面的說明書和隨后的權(quán)利要求中，除了上下文由于表達語言或必需的含 義而另有規(guī)定以外，單詞“包含”或變形如“包括”或“含有”均以包括性意義使用，即具體說 明存在所稱特征但不排除本發(fā)明的多個實施方案中存在或加入其他特征。除非上下文另外清楚地指出，否則本文所使用的單數(shù)形式“一個”、“一”和“所述” 也包括對應的復數(shù)指代物。當表達一個數(shù)值范圍時，應清楚地理解該范圍包括該范圍的上 限和下限以及在上下限之間的所有數(shù)值。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域 內(nèi)普通技術人員的通常理解相同的含義。盡管任何材料和應清楚地理解，本發(fā)明并非限制于本文描述的具體物質(zhì)和方法，因為這些可改變。 還應理解的是本文所使用的術語只是出于描述特定實施方案的目的，而并非意圖限制本發(fā) 明的范圍，本發(fā)明的范圍只由所附權(quán)利要求來限制。本發(fā)明現(xiàn)在通過參考以下非限制性實施例和附圖的方式進行詳細描述。實施例1 用于從脫脂乳制備血管生成素富集的級分的方法向一個 IOcm深的柱子中填充入 SP Sepharose Big Beads(GEHealthcare)以使柱 子的總柱床體積是四.7升。向該柱中以331cm/h(每小時每升樹脂34升脫脂乳)的線性 流速施加脫脂牛乳流2小時，直至施加的脫脂乳的體積為裝入該柱的樹脂體積的68倍。通過以147cm/h(每小時每升樹脂15升緩沖液)的線性流速加入2. 5倍柱體積 (CV)的水或0. 25CV/分鐘的流速加水10分鐘而除去該柱中剩余的乳使用2. 5CV含有相當于2. 0% (0. 34M)NaCl的鈉離子的緩沖液(pH 6. 5)，通過使 所述陽離子緩沖溶液以75cm/h (每小時每升樹脂7. 5升陽離子緩沖溶液)或0. 125CV/分 鐘的線性流速流過20分鐘，將不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分從柱子上洗脫下來。 棄去最初的每升樹脂0. 5升陽離子緩沖溶液，然后收集接下來的每升樹脂2. 5升陽離子緩 沖溶液(包括與下一種緩沖液施加時間重疊的每升樹脂0. 5升陽離子緩沖溶液，即突破時 間)作為不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分。然后使用2. 5CV含有相當于2. 5% w/v(0. 43M)NaCl的鈉離子的緩沖液(pH 6. 5)， 通過使所述陽離子緩沖溶液以75cm/h(每小時每升樹脂7. 5升陽離子緩沖溶液)或 0. 125CV/分鐘的線性流速流過20分鐘，將血管生成素富集的級分從柱子上洗脫下來。棄去 最初的每升樹脂0. 5升陽離子緩沖溶液，然后收集接下來的每升樹脂2. 5升陽離子緩沖溶 液(包括與下一種緩沖液施加時間重疊的每升樹脂0.5升陽離子緩沖溶液)作為血管生成 素富集的級分。最后，使用2. 5CV含有相當于8. 75 % w/v (1. 5M) NaCl的鈉離子的緩沖液(pH 6. 5)，通過使所述陽離子緩沖溶液以75cm/h (每小時每升樹脂7. 5升陽離子緩沖溶液)或 0. 125CV/分鐘的線性流速流過20分鐘，將乳鐵蛋白級分(也不含血管生成素)從柱子上洗脫下來。棄去最初的每升樹脂0. 5升陽離子緩沖溶液，然后收集每升樹脂2. 5升陽離子緩 沖溶液作為乳鐵蛋白級分。將所收集的血管生成素富集的級分進行超濾(NMWCO 5kDa)以濃縮并降低鹽的含 量。將所獲得的濃縮液冷凍干燥并儲存在室溫下以便后續(xù)使用。通過SDS-PAGE分析血管生成素富集的級分中血管生成素含量，發(fā)現(xiàn)所述級分含 有57% (基于蛋白)的低分子量(HkDa)蛋白，該蛋白被MALDI-T0F/T0F MS(結(jié)果未示出) 證實是血管生成素。本領域技術人員會理解其他來源或通過其他方法純化的血管生成素可用于第一 方面的方法。以上實施例只示出了在以下實驗中使用的血管生成素的實際來源是如何制得 的，絕非以任何方式意圖限制。盡管可認為所述血管生成素富集的級分可包含其他具有作用的生物活性成分，然 而在脫脂乳中可利用的相當量的血管生成素(濃度為2% )與所述血管生成素富集的級分 在實施例中顯示的活性相當(數(shù)據(jù)未表示)。實施例2 人血液中牛血管生成素的檢測為分析牛血管生成素在攝取后穿入血流的能力，兩個人受試者服用相當于25mg、 75mg或150mg的血管生成素的實施例1中描述的血管生成素富集的乳級分。所述血管生 成素劑量是在臨攝取前由IOOml市售增香乳制成的。在攝取前，采集時間為0的血液樣本。 然后在攝取后2和3小時采集血液樣本。血管生成素的存在是通過以下方法證實的依照Laemmli，1970的方法(Nature 227(5259) :680-685)的方法進行的SDS-PAGE，和依照廠商說明書采用SYPRO Ruby的染色 來證實。例如，將一小份所述蛋白質(zhì)餾級分的等分試樣在SDS PAGE緩沖液(通常含2%十二 燒基硫酸鈉、10%甘油、50mM Tris HCL(pH 6. 8)、2mM EDTA、140mMβ -巰基乙醇和0. 01 %溴 酚藍)中通過在95°C加熱5分鐘變性。將變性的樣本上樣到SDS PAGE凝膠(可來自供應 商；例如hvitrogen Novex預制1Tris HCl凝膠)上。將所述凝膠置于SDS PAGE設備中， 并且將電泳緩沖液(Tris堿3.03g/L、甘氨酸14.4g/L和SDS 1. Og/L)置于該設備的底部和 頂部的倉中。電泳在200V下進行1小時。電泳后，將蛋白質(zhì)用固定/脫色溶液(10%甲醇 和7%乙酸)固定在凝膠中，然后用Sypro Ruby(Invitrogen)染色至少1小時。將凝膠在 固定/脫色溶液中脫色至少lhr，然后在凝膠掃描系統(tǒng)上成像。血管生成素的豐度是通過在 對大約15kDa處的可區(qū)分明顯條帶的分析確定。血管生成素的存在還可以通過以下方式證實在SDS PAGE之后，通過用抗牛血 管生成素的抗體進行蛋白質(zhì)印跡的免疫親和性檢測。包含牛血管生成素的生物學樣品可 溶解在含有或不含還原劑(2-巰基乙醇)的Ix NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen) 中。然后將樣本在95°C加熱5-10分鐘，然后進行上述的SDS PAGE電泳。電泳后，將所述 凝膠置于iTowbin緩沖液(25mM Tris，192M甘氨酸，1 % SDS)中10分鐘。Western轉(zhuǎn)移操 作使用市售的轉(zhuǎn)移裝置如iBl0tTM(Invitr0gen)并依據(jù)廠商說明書進行。將iBlot 陽極 底板(Anode Stack(Bottom))從它的包裝中移出并置于iBlot 凝膠轉(zhuǎn)移設備的底部。然 后將預先電泳的凝膠放置在硝酸纖維素膜上(iBlot 膜；Invitrogen)。然后將一張已經(jīng) 浸泡在去離子水中的iBlot 濾紙放置在所述預先電泳的凝膠上面。然后將iBlot 陰極 頂板(Cathode Mack(Top))放置在所述預先浸泡的濾紙上面且銅電極一側(cè)面朝上。然后
12將iBlot —次性海綿(DisposableSponge)放置在所述蓋的內(nèi)側(cè)上以確保與iBlot 轉(zhuǎn)移 板(transferstack)接觸。將25V的電泳施加于所述裝置，持續(xù)7分鐘。在轉(zhuǎn)移的最后， 將所述硝酸纖維素膜置于封閉溶液(含5%脫脂乳粉的TBST)中1小時。然后將所述膜 轉(zhuǎn)移到一抗溶液中。此溶液包含一種抗牛單克隆抗體如克隆編號為1B14D4(Property of the Department ofBiochemistry, Chungbuk National University, Cheongju,Chungbuk, Korea)的單克隆抗體或多克隆抗體在含有5% BSA的TBST(IOmMTris HCl，pH 7. 5，150mM NaCl,0. 05% Tween20)中的合適稀釋液。在4°C下將所述硝酸纖維素膜在一抗溶液中輕輕 搖晃孵育過夜。然后在室溫下將所述硝酸纖維素膜在TBST中輕輕搖晃洗滌4次，每次5分 鐘。然后將所述硝酸纖維素膜置于包含用于檢測一抗的標記抗體的二抗溶液中。對于抗牛 血管生成素的單克隆抗體lB14d4，可使用在包含5%脫脂乳粉的TBST中以1 15，000稀 釋的IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG 二抗(Licor)。在這種情況下，在室溫下將所述硝酸纖維 素膜在二抗溶液中于黑暗中孵育45分鐘。然后在室溫下將所述硝酸纖維素膜在TBST中于 黑暗中輕輕搖晃洗滌4次，每次5分鐘。然后將所述硝酸纖維素膜用TBS(IOmM Tris HCl, pH 7.5,150mM NaCl)洗滌并在兩張濾紙(Whatman)間干燥。然后將所述硝酸纖維素膜用 紅外成像儀(Licor Odyssey)在合適的波長下掃描。血管生成素的具體豐度是通過對大約 15kDa處的明顯條帶的分析確定。如圖1所示，在2小時和3小時的時間點上，血液中的血管生成素水平均顯示從低 劑量到高劑量的明顯增加，表明血管生成素可口服利用。實施例3 體內(nèi)動物實驗為分析正常小鼠體內(nèi)血管生成素的生物利用率，進行了動物實驗。所有工作均由 西澳大學(University of Western Australia)動物倫理委員會批準。小鼠在每個試驗中均以2. 5μ g/g小鼠體重的量飼喂以兩種飲食對照飲食和包 含依據(jù)實施例1制得的牛血管生成素(bAngiogenin)富集級分的飲食。這些研究按照以 下方式進行對于每次實驗、每種飲食和每個小鼠品種均是用成年(8周齡)雄性正常小鼠 (C57)和營養(yǎng)不良(mdx)小鼠進行的，其中η = 8。使正常小鼠經(jīng)歷一個月自由飼喂并自由鍛煉的飲食期；將一個金屬小鼠轉(zhuǎn)輪放置 在籠內(nèi)用于自由鍛煉并且通過與輪連接自行車計程器記錄各個小鼠的跑動距離。也使MDX 小鼠經(jīng)歷相同的一個月的飲食期。在獨立的實驗中，對mdx小鼠給予上述自由鍛煉處理或 不給予上述自由鍛煉滾輪。實驗分析在試驗中，體重、食用食物的量和肌肉力量(握力測試)都是每周測量兩次。在每 個實驗的結(jié)束時，將小鼠通過氟烷麻醉和頸脫位法處死。然后將實驗小鼠用于以下分析以確定任何因?qū)I養(yǎng)不良和正常肌肉的治療而導 致的表型變化。1)身體組成分析對每只剝皮小鼠尸體的一半進行身體組成分析。此外，個體的 腿部肌肉包括四頭肌(quad)、脛骨前肌(TA)和腓腸肌都被切割并稱重，并且腹部的脂肪墊 和心臟也被記錄以確定所述飲食誘導的總表型變化。2)組織學分析采集并制備骨骼肌和心臟樣品用于冷凍和石蠟包埋。組織學分析 對以下肌肉四頭肌、TA和膈進行。對這些肌肉進行蘇木精和曙紅、蘇丹黑和多種免疫組織學染色。測定肌肉的骨骼肌原纖維壞死、肌原纖維肥大和脂肪含量。正常小鼠體內(nèi)試驗的結(jié)果示于圖2和3。清楚地顯示了補充有2.5 μ g/g血管生 成素富集的級分的飲食誘導肌肉與對照組相比增加(圖幻最高達50%。肌肉質(zhì)量的增加 與大多數(shù)肌肉纖維類型的橫斷面積的增加相符合，除了對應于慢收縮氧化纖維的小暗纖維 外(圖幻。這證明了當口服利用時血管生成素的生物可利用性，表明血管生成素穿過腸道 并在組織水平上具有活性。當飼喂給mdx小鼠時，血管生成素在允許小鼠自由鍛煉的情況 下減少了壞死肌肉的比例(圖4)。這證明了血管生成素在攝取后可在mdx小鼠中被生物利 用，并且能夠在mdx小鼠中抑制鍛煉對肌肉衰退的效果。這意味著口服給藥的血管生成素 不管是否口服給藥時均具有治療效果。實施例4 脫脂乳中血管生成素的減少向一個深IOOmm并且容積為30L的柱子中填充入SP Big Bead陽離子交換樹脂 (GE Healthcare)。所述柱子通過用180L(6倍柱體積)的1. OM氯化鈉以1，300L/h的速度 沖洗，隨后用180L(6倍柱體積)的水以1，800L/h的速度沖洗制得(乳和所有溶液的pH均 為6. 5士 1)來制備。將脫脂乳以1，300L/h的速度施加于所述樹脂直至施加2，100L(70倍 柱體積)。在臨上柱前或剛過柱后收集脫脂乳的樣品。在過柱后立即收集的乳是血管生成 素減少的乳。將脫脂乳和血管生成素減少的乳冷凍在不銹鋼托盤中，冷凍干燥(溫度50°C; 時間48h ；真空度ImBar)，并密封于密閉的箔袋(foil pouch)中直到可以進行分析時。血管生成素是經(jīng)低壓陽離子交換色譜法預先濃縮的，然后通過陽離子交換HPLC 測量。將乳粉(20g)通過用磁力攪拌棒攪拌30分鐘而溶于400mL水中。加入鹽酸QM)直 至乳溶液達到pH 4. 6。通過先以Whatman#113濾紙再以Whatman#l濾紙相繼進行過濾來移 除沉淀的酪蛋白，并收集澄清的乳清。通過加入30%氫氧化鈉將乳清調(diào)至pH 6.2 士 0.1。將SP Big Bead陽離子交換樹脂(35g濕重)加入乳清中并攪拌1小時。將乳清和 樹脂分多次倒入一次性IOmL柱中直至所有的樹脂都沉積在柱中。將柱子用蒸餾水沖洗并 隨后用4M氯化鈉洗脫。在^Onm下監(jiān)測從柱子中流出的洗脫液以確保所有的蛋白質(zhì)都被收 集。所收集的洗脫液的體積是45g。通過加入蒸餾水將洗脫液QOO μ L)稀釋至1000 μ L (對 使得可以通過HPLC正確分析富含鹽的溶液是必需的)并取100 μ L進行陽離子交換HPLC 分析。在脫脂乳中存在的血管生成素的面積是8，461mAUX s并且在血管生成素減少的乳中 存在的血管生成素的面積是893mAUXs，這代表所存在的血管生成素的量減少了 89. 44%。
權(quán)利要求
1.一種任何可受益于血管生成素給藥的疾病的治療方法，其中血管生成素經(jīng)口服給藥。
2.權(quán)利要求1的治療方法，其中血管生成素經(jīng)口服給藥，而不需要載體或賦形劑，也不 需要將所述蛋白封裝或進行用于改善該蛋白口服利用率的其他任何方法的處理。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述疾病選自代謝疾病、胰島素依賴型(1型)糖尿 病、非胰島素依賴型O型)糖尿病、高血糖癥、葡萄糖耐量降低、代謝綜合征、X綜合征、創(chuàng) 傷誘發(fā)的胰島素抵抗、脂肪組織障礙、肥胖癥、肌肉和神經(jīng)肌肉障礙、肌營養(yǎng)不良、嚴重或 良性X連鎖肌營養(yǎng)不良、肢帶型肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良、強直性肌營養(yǎng)不良、遠 端型肌營養(yǎng)不良、進行性營養(yǎng)不良眼肌麻痹癥、眼咽型肌營養(yǎng)不良、裘馨杜氏肌營養(yǎng)不良、 和!^kuyama型先天性肌營養(yǎng)不良；肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)；肌肉萎縮；器官萎縮癥；虛 弱；腕管綜合征；充血性阻塞性肺疾??；先天性肌??；先天性肌強直；家族性周期性癱瘓； 陣發(fā)性肌紅蛋白尿癥；重癥肌無力；伊頓-蘭伯特肌無力綜合征；繼發(fā)性肌無力；去神經(jīng)性 萎縮；陣發(fā)性肌萎縮；以及肌肉減少癥、惡病質(zhì)、其他肌肉萎縮綜合征、骨質(zhì)疏松癥，尤其是 在老年人和/或絕經(jīng)期后婦女中；糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥；骨質(zhì)減少；骨關節(jié)炎；骨 質(zhì)疏松性骨折；肌肉組織的創(chuàng)傷性或慢性損傷、由于長期糖皮質(zhì)激素療法造成的骨質(zhì)疏松、 性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥、營養(yǎng)不良、神經(jīng)性厭 食癥、可因促進血管發(fā)生獲益的病癥和創(chuàng)傷愈合。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中血管生成素包括重組血管生成素。
5.權(quán)利要求1到4任一項的方法，其中血管生成素來自牛乳。
6.前述權(quán)利要求任一項的方法，還包括給予卵泡抑素。
7.權(quán)利要求6的方法，其中卵泡抑素為腸胃外給藥。
8.權(quán)利要求6的方法，其中血管生成素和卵泡抑素是共同給藥。
9.以口服劑型存在的血管生成素。
10.以口服劑型存在的血管生成素和卵泡抑素。
11.一種試劑盒，包含以口服劑型存在的血管生成素和卵泡抑素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種疾病的治療方法，其中所述疾病是可受益于血管生成素給藥的任何疾病，其中血管生成素經(jīng)口服給藥。具體地，所述口服血管生成素不需要載體或賦形劑，也不需要將該蛋白封裝或進行用于改善其口服利用率的其他任何方法的處理。
文檔編號A61P17/02GK102099050SQ200980127807
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者A·泰斯特, B·庫克斯, M·麥克多諾, P·霍布曼 申請人:墨累古爾本合作有限公司, 維多利亞農(nóng)業(yè)服務控股公司