利用脂質(zhì)體肉毒桿菌毒素對膀胱功能障礙的治療的制作方法

專利名稱：利用脂質(zhì)體肉毒桿菌毒素對膀胱功能障礙的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及膀胱功能障礙、特別是頑固性膀胱過動(dòng)癥的治療的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
尿失禁或膀胱功能障礙是對膀胱控制的降低。癥狀可以從輕度的漏尿到不能控制 的尿濕。上述癥狀可發(fā)生在任何人身上，但是隨著年齡的增長變得愈發(fā)常見。大部分膀胱 控制問題在肌肉過弱或過于活躍時(shí)發(fā)生。如果保持膀胱閉合的肌肉過于弱，在打噴嚏、大笑 或提舉重物時(shí)可能會(huì)漏尿。這是壓力性尿失禁。如果膀胱肌肉過于活躍，則在膀胱中有極 少量尿液時(shí)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的如廁欲望。這是急迫性尿失禁或膀胱過動(dòng)癥。尿失禁還有其它原 因，例如前列腺問題和神經(jīng)損傷。治療方法取決于問題的種類。該治療方法可包括單純的鍛煉，醫(yī)生開具的藥物、特 定裝置或方法，或手術(shù)。多年來，膀胱內(nèi)療法一直是主要的治療方法(Parkin等，Urology 49， 105-7(1997))。膀胱內(nèi)藥物治療在膀胱內(nèi)提供了高的局部藥物濃度，降低了全身性副作用 的風(fēng)險(xiǎn)，并消除了 口服施用藥劑時(shí)尿排泄水平低的問題。經(jīng)測試，患者對30分鐘的標(biāo)準(zhǔn)滴 注時(shí)間有優(yōu)異的耐受性。臨床上，二甲基亞砜(DMSO) (Rimso-50)是唯一獲FDA批準(zhǔn)的膀胱 疼痛綜合征/間質(zhì)性膀胱炎(PBS/IC)用膀胱內(nèi)治療，據(jù)信DMSO具有抗炎性能和肥大細(xì)胞 穩(wěn)定作用(Sun和Chai，BJU Int 90，381-5 (2002))。然而，DMSO的成功率通常不高。膀胱 上皮主要依賴于表面糖胺聚糖(GAG)層的存在和細(xì)胞間接觸的結(jié)構(gòu)完整性(也就是緊密 連接)，以保持對有毒尿廢物的不可滲透性(Parsons等，Science208,605-7 (1980))。在該 屏障受到損壞時(shí)，泄漏進(jìn)入下膀胱層的尿液成分引起了膀胱內(nèi)的刺激性變化，并導(dǎo)致對感 覺神經(jīng)纖維的刺激以及疼痛、尿急和尿頻癥狀(Lavelle等，Am J Physiol Renal Physiol 283, F242-53(2002))。尿路上皮和GAG還提供了有效進(jìn)行膀胱內(nèi)藥物遞送用的重要屏障。更為重要的是，膀胱過動(dòng)癥(OAB)困擾了美國17%的男女(年齡越大發(fā)病率越 高)，并且據(jù)估計(jì)產(chǎn)生了 164億美元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。許多專家認(rèn)為25%的OAB患者會(huì)尋求醫(yī) 學(xué)治療。保守估計(jì)，口服藥物治療對那些尋求治療的4百萬OAB患者中的25%無效，這部分 患者將尋求用于頑固性O(shè)AB的療法。在最近幾年中，出現(xiàn)了幾種OAB用新型抗毒蕈堿藥物和改良劑型。2008年有6種 獲FDA批準(zhǔn)的OAB抗毒蕈堿藥劑，其全球銷售為每年20億美元。但是，由于功效有限且具 有諸如口干、便秘和認(rèn)知功能障礙等副作用，有不到20%的患者繼續(xù)使用抗毒蕈堿治療。 常用作抗毒蕈堿性頑固性患者用二線治療的兩種方法是獲FDA批準(zhǔn)的骶神經(jīng)刺激(SNS) (Interstim, Medtronics Inc.)和BoNT的逼尿肌內(nèi)注射，所述注射法處于用于頑固性O(shè)AB 的FDAII期試驗(yàn)中(Botox，Allergan Inc.，)?，F(xiàn)今正在進(jìn)行施用肉毒桿菌毒素的若干臨 床試驗(yàn)。已經(jīng)表明肉毒桿菌毒素有助于治療頑固性膀胱過動(dòng)癥(OAB)，但是其需要進(jìn)行膀胱 鏡檢查過程，以將該毒素直接注射到膀胱壁中。因?yàn)樵摱舅乇蛔⑸涞桨螂妆颇蚣≈?，并可減 弱膀胱的收縮力，高達(dá)43%的患者可能患上尿潴留。
制藥工業(yè)也顯示出對開發(fā)與間質(zhì)性膀胱炎有關(guān)的尿急和尿頻的治療有極大的興 趣。最近，這些療法已包括卡介苗(BCG)、類辣椒辣素(resiniferatoxin) (RTX)、透明質(zhì)酸 (Cystistat)、透明質(zhì)酸鈉(SI-7201)，以及骶神經(jīng)刺激裝置。需要能夠簡單地滴注肉毒桿菌毒素(BoNT)而無需針頭注射。此外，需要在低濃度 下將BoNT遞送至膀胱上皮內(nèi)襯和感覺神經(jīng)末端，這可有助于改善下尿路癥狀，而不引起潴 留和/或膀胱肌無力。其它泌尿疾病如尿路感染和膀胱癌中也存在對局部膀胱內(nèi)藥物遞送和藥物在膀 胱內(nèi)較長時(shí)間接觸的需求。用于膀胱功能障礙的持續(xù)性藥物遞送系統(tǒng)不能商購獲得。其它方法嘗試將帶有藥 物的球囊容器或基體材料置入膀胱中以進(jìn)行持續(xù)性藥物釋放，但是這些機(jī)械性方法引起了 刺激、疼痛，并由于其大小和形狀可引起膀胱頸出口堵塞導(dǎo)致的梗阻。使用膀胱內(nèi)BoNT滴注的有限次臨床經(jīng)驗(yàn)至今為止是不成功的。膀胱內(nèi)BoNT滴注 缺乏功效的可能原因包括受尿液中蛋白酶類的降解、在尿液中的稀釋或從滴注至膀胱內(nèi)腔 的BoNT溶液進(jìn)入尿路上皮的攝取不良。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供通過滴注到膀胱中而遞送藥物的方法和組合 物，從而治療OAB和膀胱的其它紊亂。

發(fā)明內(nèi)容
脂質(zhì)體用于膀胱內(nèi)藥物遞送，特別是BoNT的遞送，以通過降低膀胱刺激和尿頻而 幫助改善下尿路癥狀。與注射相比，該系統(tǒng)使用了較低且更為安全的劑量的BoNT，降低了尿 潴留的風(fēng)險(xiǎn)。以30ml 60ml的常用體積，將作為液體制劑的脂質(zhì)體-BoNT簡單滴注到膀胱中， 達(dá)到的功效與現(xiàn)今用膀胱鏡針頭注射BoNT達(dá)到的功效相似。所述劑量可以低于注射所用 劑量，從而尿潴留的風(fēng)險(xiǎn)極小。脂質(zhì)體-BoNT可保護(hù)BoNT免于遭受膀胱和尿液的分解。實(shí)施例將證明所述制劑的功效。
具體實(shí)施例方式I.脂質(zhì)體-藥物制劑脂質(zhì)體封裝應(yīng)可解決滴注后吸收不良的問題。BoNT的脂質(zhì)體封裝可防止BoNT在 尿液中降解，并使得從粘附在膀胱表面的脂質(zhì)體穿過尿路上皮進(jìn)行無障礙吸收。由于BoNT 包埋在脂質(zhì)體內(nèi)，BoNT不易受到尿液的稀釋，而且脂質(zhì)體表面的BoNT的局部濃度可以足夠 高，以加快從粘附于膀胱內(nèi)腔表面的脂質(zhì)體中濾出的BoNT的進(jìn)入。A脂質(zhì)體脂質(zhì)體(LP)為球形囊泡，并由以水性隔區(qū)隔開的同心磷脂雙層組成。LP具有 粘附于細(xì)胞表面并在細(xì)胞表面生成分子膜的特性。脂質(zhì)體是由同心磷脂雙層組成的脂 囊泡，所述磷脂雙層封閉了水性內(nèi)腔(Gregoriadis等，Int J Pharm 300，125-30 2005 ； Gregoriadis 和 Ryman，Biochem J 124，58P (1971))。脂囊泡包含一個(gè)或幾個(gè)由一個(gè)(單層) 或多個(gè)(多層)磷脂雙層描繪的水性隔區(qū)(Sapra等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。 臨床中脂質(zhì)體的成功歸因于其制劑中所使用的脂質(zhì)的無毒性質(zhì)。脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層和水性內(nèi)核都可用作治療目的。脂質(zhì)體作為較低劑量下提高功效用的毒素載體已得到充分研 % (Alam^, MoI Cell Biochem 1 12,97-1071992 ；Chaim-Matyas φ, Biotechnol Appl Biochem 17(Ptl)，31-61993 ;de Paiva 和 Dolly, FEBS Lett 277,171-4(1990) ；Freitas 禾口 Frezard，Toxicon 35，91—100 (1997) ；Mandal 禾口 Lee，Biochim BiophysActa 1563， 7-17(2002))。脂質(zhì)體具有在細(xì)胞和組織表面形成分子膜的能力，現(xiàn)今已對脂質(zhì)體作為可能的 治療劑來促進(jìn)傷口愈合并作為眼淚替代物促進(jìn)治愈干眼病進(jìn)行了測試。臨床研究已經(jīng) 證實(shí)了脂質(zhì)體作為局部愈合劑的功效(Dausch等，Klin Monatsbl Augenheilkd 223， 974-83(2006) ；Lee 等，Klin Monatsbl Augenheilkd 221，825-36 (2004))。脂質(zhì)體也用于 眼科中，以改善角膜炎、角膜移植排斥反應(yīng)、葡萄膜炎、眼內(nèi)炎和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變 (Ebrahim 等，2005 ；Li 等，2007)。脂質(zhì)體作為多種化學(xué)治療劑用藥物載體得到了廣泛的研究(該主題約有25，000 篇已公布的科學(xué)文章)(Gregoriadis，N Engl J Med 295,765-70(1976) ；Gregoriadis 等， Int J Pharm 300，125-30 (2005))。諸如多柔比星等水溶性抗癌物可在由磷脂雙層界定的 脂質(zhì)體水性隔區(qū)內(nèi)得到保護(hù)，而諸如兩性霉素和辣椒素等脂溶性物質(zhì)可整合到磷脂雙層中 (Aboul-Fadl, Curr Med Chem 12，2193-214 (2005) ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004))。 使用脂質(zhì)體可顯著地提高環(huán)孢霉素的局部和玻璃體遞送(Lallemand等，Eur JPharm Biopharm 56，307-182003)?；瘜W(xué)治療劑的遞送使藥物動(dòng)力學(xué)得以提高，并使毒性得以降低 (Gregoriadis, Trends Biotechnol 13, 527-37 (1995) ；Gregoriadis禾口 Allison, FEBS Lett 45,71-41974 ;Sapra 等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。已有多于 10 種脂質(zhì)體和脂類 制劑獲監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，并且許多種脂質(zhì)體藥物正處于臨床前開發(fā)或臨床試驗(yàn)中(Barnes， Expert Opin Pharmacother 7,607-15(2006) ；Minko 等，Anticancer AgentsMed Chem 6, 537-52(2006))。Fraser等在Urology，2003 ；61 :656_663中證明，脂質(zhì)體的膀胱內(nèi)滴注提 高了有功能障礙的尿路上皮的屏障性能，并在有膀胱過動(dòng)癥的大鼠模型中部分逆轉(zhuǎn)了高排 尿頻率，所述大鼠的膀胱過動(dòng)癥是通過用硫酸魚精蛋白破壞尿路上皮并隨后用KCl刺激膀 胱而誘導(dǎo)。Tyagi等在J Urol, 2004 ；171 ；483-489中報(bào)道，脂質(zhì)體是辣椒素的膀胱內(nèi)施用 的優(yōu)質(zhì)載體，與30%乙醇相比，有較少的載體誘導(dǎo)性炎癥。從在數(shù)以千計(jì)患者的臨床中使用 脂質(zhì)體的大量臨床經(jīng)驗(yàn)中，已經(jīng)充分了解了關(guān)于脂質(zhì)體的急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒 性優(yōu)選的安全性數(shù)據(jù)。目標(biāo)臨床途徑用脂質(zhì)體的安全使用也得到了其在患者中作為抗癌藥 載體的廣泛應(yīng)用的支持。B用于滴注的肉毒桿菌毒素(BoNT)和其它藥物由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生的肉毒桿菌神經(jīng)毒素被認(rèn)為是已知的 對人最強(qiáng)的生物毒素(Smith & Chancellor, J Urol, 171 =2128(2004) BoNT 已經(jīng)有效用 于與肌肉過度收縮有關(guān)的不同疾病。在7種免疫學(xué)上不同的神經(jīng)毒素(A型 G型)中， BoNT-A是臨床上最為常用的肉毒桿菌毒素。在最近幾年中，BoNT-A和BoNT-B已經(jīng)成功地 通過在多個(gè)位置進(jìn)行逼尿肌內(nèi)BoNT-A注射而用于治療患有神經(jīng)原性膀胱過動(dòng)癥的脊髓損 傷患者(Schurch 等，2000)。腎上腺皮質(zhì)激素(ACh)和去甲腎上腺素釋放抑制的作用已知BoNT通過抑制 ACh在神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處的釋放和自主神經(jīng)傳遞而發(fā)揮作用。在肌肉內(nèi)注射BoNT后，在骨骼肌和平滑肌中可產(chǎn)生暫時(shí)的化學(xué)去神經(jīng)作用和肌肉松弛(Chuang和Chancellor，J Urol. 176(6Ptl) :2375-82 (2006))。Smith 等(J Urol, 169 :1896(2003))發(fā)現(xiàn)，將 BoNT 注 射到大鼠近端尿道括約肌中使標(biāo)記的去甲腎上腺素在高電場刺激而不在低電場刺激下發(fā) 生顯著的下降，這表明BoNT抑制了自主神經(jīng)末端處的去甲腎上腺素釋放。感覺機(jī)制抑制的作用越來越多的證據(jù)支持BoNT還抑制膀胱內(nèi)的傳入神經(jīng) 傳遞的觀點(diǎn)(Chuang 等，J Urol 172,1529-32(2004) ；Khera 等，Neurochem Int,45 987(2004))。已經(jīng)表明，BoNT抑制神經(jīng)肽、谷氨酸鹽和三磷酸腺苷的釋放，這些物質(zhì)是疼痛 感的介體(Cui等，Pain, 107 :125(2004)) 0在乙酸誘導(dǎo)的膀胱過動(dòng)模型中觀察到了相似的 作用。在人類逼尿肌過動(dòng)中發(fā)現(xiàn)，與逼尿肌內(nèi)注射BoNT后的尿急程度降低有關(guān)的感覺受體 P2X3和瞬時(shí)受體電位香草酸(Vanilloid)I型受體(TRPVl)在尿路上皮下的神經(jīng)纖維中水 平的降低(Apostolidis 等，J Urol, 174 :9772005)。BoNT的靶蛋白是處于脂質(zhì)環(huán)境中的整合膜蛋白。脂質(zhì)體可以通過使與尿路上皮的 粘附更強(qiáng)而提高諸如BoNT等金屬蛋白酶的活性。膀胱鏡引導(dǎo)的注射是目前在臨床中對膀 胱施用BoNT的標(biāo)準(zhǔn)做法。近年來，有研究評估了在膀胱刺激的動(dòng)物模型中進(jìn)行BoNT的膀 胱內(nèi)滴注的可能(Khera等，toology 66，208-12 (2005))。文獻(xiàn)中先前的報(bào)道表明，對VAMP 有特異性的BoNT的金屬蛋白酶活性因脂質(zhì)膜的存在而顯著提高。這種作用提供了對以下 事實(shí)的解釋這些神經(jīng)毒素對插入至脂質(zhì)囊泡中和神經(jīng)元中的VAMP比對分離的VAMP分子 具有更強(qiáng)的活性。這種脂質(zhì)增高作用是由脂質(zhì)帶來的。該研究對將脂質(zhì)體用作BoNT滴注 用遞送載體的合理性有很強(qiáng)的支持?？傻巫⒌桨螂字械钠渌幬镆部墒褂弥|(zhì)體遞送系統(tǒng)進(jìn)行遞送，特別是具有可由 局部遞送避免的全身副作用的那些藥物。可以使用所述脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)遞送的合適的藥物或活性劑包括但不限于，癌癥治 療藥、免疫調(diào)節(jié)藥、鎮(zhèn)痛藥、消炎劑、抗組胺藥、內(nèi)啡肽、前列腺素、大麻類(Canaboid)TRP受 體、肽、蛋白，以及抗體、質(zhì)粒、裸DNA、病毒載體、RNA、siRNA、氨基酸；透明質(zhì)酸；戊聚糖多硫 酸鈉、β "3受體激動(dòng)劑和拮抗劑、Ghrelin受體激動(dòng)劑和拮抗劑以及諸如利多卡因等局部 麻醉劑。示例性癌癥治療藥包括順鉬、卡鉬、絲裂霉素、奧沙利鉬、氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸 氮芥、長春新堿、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春堿、多柔比星、甲氨蝶呤、長春瑞濱、長 春地辛、紫杉醇(taxol)及其衍生物、伊立替康、托泊替康、安吖啶、足葉乙甙、磷酸足葉 乙甙、替尼泊苷、表鬼白毒素、曲妥珠單抗(HERCEPTIN )、西妥昔單抗、和利妥昔單抗 (RITUXAN 或MABTHERA )、貝伐單抗(AVASTIN )和它們的組合。示例性的免疫調(diào)節(jié)藥包括干擾素和卡介苗。所述藥物遞送組合物也可用于遞送合適的藥物，從而治療間質(zhì)性膀胱炎、膀胱疼 痛綜合征、膀胱過動(dòng)癥、膀胱癌、前列腺癌和由細(xì)菌、真菌或病毒引起的尿路感染。II.制造方法脂質(zhì)體的制造脂質(zhì)體的制造方法描述于上述文獻(xiàn)中并且是眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，水性脂質(zhì)體懸浮液通過微流化制成。最終產(chǎn)物可能遭 受一系列的穩(wěn)定性問題，如聚集、融合和磷脂水解(Nounou等，Acta Pol Pharm 62,381-91(2005))。在能夠?qū)崿F(xiàn)脂質(zhì)體產(chǎn)物的臨床益處之前，脂質(zhì)體產(chǎn)物必須具備足夠的化學(xué)和物理 穩(wěn)定性(Torchilin，Adv Drug Deliv Rev 58，1532-55 (2006))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中， 脫水脂質(zhì)體由磷脂在叔丁醇(TBA)/水共溶劑系統(tǒng)中的均質(zhì)分散液形成。對脂質(zhì)體的各向 同性的單相溶液進(jìn)行冷凍干燥，以在無菌小瓶中生成脫水脂質(zhì)體粉末。在從小瓶中除去水 和TBA后，冷凍干燥步驟留下了空心脂質(zhì)囊泡或脫水脂質(zhì)體。加入生理鹽水時(shí)，該凍干產(chǎn)物 自發(fā)形成均質(zhì)脂質(zhì)體制劑(Amselem 等，J Pharm Sci 79，1045-52 (1990) ；Ozturk 等，Adv Exp Med Biol 553，231-42 (2004))。低濃度的脂質(zhì)可理想地用于本方法，因?yàn)橹|(zhì)和TBA 的比例是影響所得脂質(zhì)體制劑的尺寸和多分散性的關(guān)鍵因素。脂質(zhì)體BoNT的制備在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過稍作修改的脫水-復(fù)水法制備脂質(zhì)體 BoNT ( “LPA-08”)。在37°C下用BoNT在注射用水中的溶液(50單位/ml)對先前步驟中制 得的脂質(zhì)體進(jìn)行水化。然后在37°C的溫度下使用水浴對所述混合物進(jìn)行2小時(shí)的溫育以形 成寡層(oligolamellar)水化脂質(zhì)體。分別以0. 5%、1 %、2. 5%和5%濃度(重量/體積， w/v)的甘露醇向最終混合物中加入甘露醇，然后在丙酮-干冰浴中進(jìn)行冷凍。甘露醇在冷 凍干燥過程中作為冷凍保護(hù)劑。冷凍混合物在-40°C和5毫巴下進(jìn)行凍干過夜。用鹽水對 凍干塊進(jìn)行再懸浮至所需的BoNT終濃度。通過在12，OOOXg下使用超速離心機(jī)進(jìn)行離心 30分鐘而從包埋的BoNT中除去游離BoNT。洗滌3次之后，使沉淀再次重懸浮于鹽水中。將烈性細(xì)菌毒素配制到脂質(zhì)體中需要謹(jǐn)慎的對待。BoNT不能暴露于制造脂質(zhì)體中 常用的有機(jī)溶劑。使用薄膜水化法和脂質(zhì)二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)完成實(shí)施例。簡言 之，首先在氮?dú)饧?xì)流下于圓底燒瓶中對DPPC的氯仿溶液進(jìn)行蒸發(fā)。在真空下對脂質(zhì)膜進(jìn)行 干燥過夜。然后用BoNT水溶液對干燥脂質(zhì)進(jìn)行水化。如下文實(shí)施例2所證明，通過仔細(xì)地控制BoNT和脂質(zhì)的比例獲得了最佳結(jié)果。如 本研究所證明，利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以確定最佳比例和脂質(zhì)組分。III.脂質(zhì)體BoNT的遞送脂質(zhì)體-BoNT滴注對患者而言更為舒適，且與原本限于對膀胱鏡BoNT注射熟練且 經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)生中的治療形式不同，脂質(zhì)體-BoNT滴注可使更多的醫(yī)生診所提供這種治療形 式。BoNT是大分子且不會(huì)穿過細(xì)胞層到達(dá)肌肉和神經(jīng)末端。不使用脂質(zhì)體進(jìn)行的BoNT滴 注需要會(huì)損傷膀胱內(nèi)襯的腐蝕劑，如魚精蛋白。這種方法沒有獲得FDA的批準(zhǔn)并可引起膀 胱疼痛和損傷。BoNT的滴注可降低患頑固性膀胱過動(dòng)癥的患者的治療成本。不同實(shí)驗(yàn)室 報(bào)道的多種研究對在膀胱刺激的動(dòng)物模型中進(jìn)行BoNT的膀胱內(nèi)滴注的可能性進(jìn)行了評估 (Chuang等，2004 ；Khera等，2005)。但是，關(guān)于BoNT的膀胱內(nèi)滴注的有限臨床經(jīng)驗(yàn)是不成 功的。脂質(zhì)體封裝解決了滴注后吸收不良的問題。因?yàn)锽oNT包埋在脂質(zhì)體的內(nèi)部，則不易 受到尿液的稀釋，且脂質(zhì)體表面處BoNT的局部濃度足夠高，從而加快從粘附于膀胱表面的 脂質(zhì)體中濾出的BoNT的被動(dòng)擴(kuò)散。脂質(zhì)體的脂質(zhì)屏障也可在脂質(zhì)體被膀胱吸收之前防止 尿中蛋白酶和蛋白水解酶的接近從而防止對BoNT進(jìn)行切割。滴注方法是已知的。例如，參見Lawrencia 等，Gene Ther 8，760-8 (2001) ；Nogawa 等，J Clin Invest 115，978-85 (2005) ；Ng 等，Methods Enzymol 391,304-132005 ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004) ；Trevisani等，J Pharmacol Exp Ther 309，1167-73(2004)；Trevisani 等，Nat Neurosci 5，546-51 (2002)) ； (Segal 等，1975). (Dyson 等，2005). (Batista 等，2005 ；Dyson 等，2005)。如下文實(shí)施例1所證明，脂質(zhì)體-BoNT的體積在遞送功效中是至關(guān)重要的?？衫?常規(guī)實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化遞送體積。所公開的脂質(zhì)體也可用于將治療劑滴注至其它位置，例如泌尿道，包括尿道、膀 胱、輸尿管和腎內(nèi)收集系統(tǒng)；婦科位置，如陰道、子宮、輸卵管；胃腸位置，包括口腔、食道、 胃、小腸、結(jié)腸、直腸、肛門；以及外耳或內(nèi)耳；皮膚和鼻子。通過參照以下非限制性實(shí)施例，可進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例1 膀胱膨脹對滴注后脂質(zhì)體BoNT吸收的影響材料和方法通過以遞增的體積滴注同樣劑量的脂質(zhì)體BoNT來確定膀胱膨脹對滴注后脂質(zhì)體 BoNT吸收的影響。用不同體積滴注液(0. 5ml,0. 55ml,0. 6ml)中相同組成的脂質(zhì)和BoNT(每 一單位的BoNT為0. 5mg脂質(zhì))制成的脂質(zhì)體滴注大鼠。將脂質(zhì)體滴注至氟烷麻醉下的大 鼠膀胱中，停留時(shí)間為30分鐘；然后允許動(dòng)物在給予食物和水并裝于籠中的條件下進(jìn)行恢 復(fù)。M小時(shí)后在尿烷麻醉下(劑量1. Og/kg體重)，通過以0. 04ml/分鐘的速率灌輸鹽水 而對經(jīng)處理的大鼠進(jìn)行經(jīng)尿道開放性膀胱測壓(transurethral opencystometry)。在獲得 1小時(shí)的正常基準(zhǔn)后，灌輸乙酸的鹽水溶液(0.25%)以誘導(dǎo)膀胱刺激。在用不同體積的滴 注液進(jìn)行BoNT治療7天后，通過在尿烷麻醉下進(jìn)行連續(xù)的經(jīng)尿道膀胱測壓來評估膀胱膨脹 作用。MM用0. 5ml標(biāo)準(zhǔn)體積滴注的大鼠顯示了通過以0. 08ml/分鐘的速率持續(xù)灌輸鹽水而 誘導(dǎo)的反射性排尿時(shí)的正常CMG。但是，用高出10% 20%體積的滴注液(0. 55ml或0. 6ml 體積的滴注液)中同樣劑量的脂質(zhì)體BoNT灌輸?shù)拇笫箫@示了鹽水膀胱測壓下的充溢性尿 失禁(overflow continence)。小體積滴注限制了 BoNT只對尿路上皮作用，而滴注體積10% 20%的增加卻顯 著地降低了吸收屏障，并允許BoNT在滴注后到達(dá)逼尿肌。以大體積的脂質(zhì)體BoNT滴注的 大鼠在清醒狀態(tài)下顯示出尿潴留，而在麻醉狀態(tài)下顯示出充溢性尿失禁，從而表明了對反 射性排尿的強(qiáng)烈抑制。有趣的是注意到，麻醉狀態(tài)下的充溢性尿失禁反映了藥物對排尿反 射的傳入支(afferent arm)作用的理想特征。麻醉狀態(tài)下的充溢性尿失禁轉(zhuǎn)化成清醒狀 態(tài)下傳入輸入的降低。BoNT是分子量為150kD的大分子，因此作為吸收機(jī)制在很大程度上可排除擴(kuò)散。 胞吞作用是膀胱吸收中更為可能的機(jī)制。先前的研究顯示，尿路上皮的傘細(xì)胞中的內(nèi)吞隨 如靜水壓等外部刺激而增加。膀胱填充過程中胞吞和胞吐的速率使得凈效應(yīng)為添加隔膜并 增加尿路上皮的表面積，從而適應(yīng)膀胱的伸展。因此，在膀胱伸展后有可能存在更多的胞吞 活動(dòng)，從而引起膀胱對BoNT更高的攝取。實(shí)施例2 脂質(zhì)與BoNT的比例的影響為了優(yōu)化BoNT的功效，脂質(zhì)和毒素應(yīng)處于最佳的比例。材料和方法用不同比例的脂質(zhì)制備脂質(zhì)體BoNT，其中保持BoNT的比例不變。例如，以25IU的BoNT開始，在氟烷麻醉下以不同體積中的相同組成的脂質(zhì)和BoNT(每一單位的BoNT為 0. 5mg脂質(zhì))制成的脂質(zhì)體對大鼠進(jìn)行滴注。BoNT的膀胱內(nèi)劑量保持恒定且脂質(zhì)濃度不同， 以確定最佳化的毒素脂質(zhì)比。將脂質(zhì)體BoNT的功效與鹽水溶液中的游離BoNT進(jìn)行比較。 滴注7天后，在氟烷麻醉過的大鼠中對減弱乙酸誘導(dǎo)的膀胱刺激的能力進(jìn)行測試。根據(jù)已 出版的研究(Chuang等，2004)將滴注和功效評價(jià)之間的間隔期選擇為7天。MM毒素與脂質(zhì)的最佳比例1 0.5對在膀胱內(nèi)滴注后提高BoNT的功效是有效的。較 高脂質(zhì)比下功效降低可能是由于BoNT從多層脂質(zhì)體中的釋放很慢，從而使BoNT進(jìn)入膀胱 的攝取效率低。實(shí)施例3 大鼠內(nèi)乙酸誘導(dǎo)的膀胱過動(dòng)癥中膀胱內(nèi)BoNT-A脂質(zhì)體遞送的尿動(dòng)力效 應(yīng)和免疫組織化學(xué)效應(yīng)的評估材料和方法脂質(zhì)體(LP)、肉毒桿菌毒素A (BoNT-A)和脂質(zhì)毒素(Lipotoxin) (LP+BoNT-A)的制 備將LP(10mg，類脂)分散于生理鹽水(Iml)中，其中所述分散液為脂質(zhì)體形式。將BoNT-A 溶解于生理鹽水(lml，20u/ml的鹽水溶液，Allergan，Irvine，CA)中。通過改進(jìn)的脫水-復(fù) 水囊泡法(Gregoriadis等，Methods 19，156-621999)制備包埋BoNT-A的LP (稱作脂質(zhì)毒 素)，所述方法中將20單位的BoNT-A載入IOmg的LP分散液(Iml)中。在不同的動(dòng)物組中 保持相同劑量的BoNT-A。膀胱內(nèi)壓測量圖(CMG)所有實(shí)驗(yàn)步驟均在雌性史-道二氏大鼠 (Sprague-Dawleyrat) (220gm 280gm)上進(jìn)行，并在研究開始前得到了機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使 用委員會(huì)(Institutional animal care and use committee)的檢查禾口批準(zhǔn)。通過皮下注 射尿烷(1.2g/kg)來麻醉動(dòng)物。將PE-50管通過尿道插入膀胱中，并使其經(jīng)由三通旋塞連 接至壓力傳感器和注射泵，以用于記錄膀胱內(nèi)壓和將溶液灌輸?shù)桨螂字?。第一天時(shí)，通過用 鹽水(0.08ml/分鐘)填充膀胱以引起重復(fù)排尿而進(jìn)行對照CMG。對反射性膀胱收縮的幅 度、壓力閾值(PT)、壓力基準(zhǔn)(PB)和收縮間隔(ICI)進(jìn)行了記錄。每一動(dòng)物的測量值表示 3至5次膀胱收縮的平均值。第8天時(shí)，在鹽水灌輸過程中確定基準(zhǔn)測量值后，我們將0.3%的乙酸(AA)以 0. 08ml/分鐘灌輸至膀胱中，以強(qiáng)烈地促使膀胱過動(dòng)。灌輸30分鐘后測量3至5次膀胱收縮。藥物的滴注在獲得基準(zhǔn)CMG后第1天，在氟烷麻醉下用繃帶將PE-50管 (Clay-Adams, Parsippany, NJ)圍繞尿道口原位綁定。使膀胱清空尿液，并通過導(dǎo)管填充 LP、BoNT-A或脂質(zhì)毒素1小時(shí)。心臟灌注CMG研究后第8天，對一些動(dòng)物(對每一組而言，N = 6)進(jìn)行深度麻醉， 并經(jīng)由心臟灌注處死，所述心臟灌注首先使用Krebs緩沖液隨后用4%低聚甲醛固定劑。然 后對所述動(dòng)物進(jìn)行解剖以獲得膀胱。組織學(xué)將組織學(xué)用膀胱組織固定于4%低聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中 4小時(shí)，然后在30%蔗糖的PBS溶液中放置過夜。將組織學(xué)用樣品包埋在石蠟中，切割成 IOym厚的片并用H&E染色。由AA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)按以下O 3的分?jǐn)?shù)分級(jí)0 沒有炎性 細(xì)胞浸潤或間質(zhì)性水腫的跡象；1 輕度(少量炎性細(xì)胞浸潤和少量間質(zhì)水腫)；2 中度(中等量炎性細(xì)胞浸潤和中度間質(zhì)水腫)；3:嚴(yán)重(彌散存在大量炎性細(xì)胞浸潤和嚴(yán)重的間質(zhì) 水腫)。用于CGRP和SNAP-25的免疫熒光顯微法作為選擇，對樣品進(jìn)行冷凍并固定在 Tissue-Tek OCT 固定介質(zhì)(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中；在低溫恒溫器上切割 10 μ m厚的縱切片，并固定到SuperFrost載玻片上。通過在丙酮中浸漬15分鐘固定切片， 然后在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中洗滌，并通過在0. 3% H2O2的PBS溶液中溫育切片10分鐘 而封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在PBS中進(jìn)行進(jìn)一步洗滌后，將切片在Image-iT 固定 信號(hào)增強(qiáng)劑(Molecular Probes, Invitrogen)中進(jìn)行溫育1小時(shí)。對于CGRP免疫染色，然 后用山羊抗CGRP多克隆抗體(Santa Cruz, 1 50稀釋)在+4°C對載玻片進(jìn)行染色48小 時(shí)。第二天然后在PBS中洗滌切片，并用驢抗山羊IgGFITC(Santa Cruz,l 2000稀釋) 溫育1小時(shí)。洗滌切片并固定在SlowFade抗褪色金試劑(Molecular Probes, Invitrogen) 中。對于SNAP-25免疫染色，然后用小鼠抗SNAP-25單克隆抗體(AbD，NC，USA，1 2000稀 釋)在+4°C對載玻片進(jìn)行染色過夜。第二天然后在PBS中洗滌切片，并用山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, 1 2000 稀釋)溫育 1 小時(shí)。為 了檢測 肌肉纖維，用四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TRITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Sigma，l 2000稀釋)對 切片進(jìn)行復(fù)染色，洗滌并固定在SlowFade抗褪色金試劑(Molecular Probes, Invitrogen) 中。用熒光顯微鏡檢查載玻片，以記錄圖像。SNAP-25表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析對一些動(dòng)物(對每一組而言，N = 6)進(jìn)行深度麻 醉且不經(jīng)心臟灌注處死。移出膀胱以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Amersham Biosciences)進(jìn)行SNAP-25 表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。超聲處理和純化之前，使樣品在蛋白提取液(T-PER fierce Biotechnology)中進(jìn)行均質(zhì)處理。用 Bradford 蛋白測定法(Bio-feid Laboratories, Hercules, CA)測量總蛋白的量。使用Laemmli緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳(PAGE)。簡言之，將相當(dāng)于30yg蛋白質(zhì)的一等分試樣提取物加載到8%聚丙烯酰胺 凝膠上，在100V的恒定電壓下進(jìn)行電泳1小時(shí)，并轉(zhuǎn)印至Hybond-P PVDF膜(Amersham Biosciences)。所述膜用封閉劑進(jìn)行封閉，然后于+4°C用小鼠抗SNAP-25單克隆抗體(AbD， NC,USA, 1 500稀釋)和小鼠抗β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Rockland,Gilbertsville,USA, 1 2000稀釋)進(jìn)行免疫印跡過夜。洗滌后，使用辣根過氧化物酶連接的抗兔或抗小鼠免 疫球蛋白G在室溫下使用5%脫脂奶粉的TBS溶液對所述膜和二抗進(jìn)行溫育2小時(shí)。通過 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)使蛋白質(zhì)印跡可視化。還檢測 了 β肌動(dòng)蛋白的量作為內(nèi)標(biāo)。使用Lab Works ImageAcquisition and Analysis軟件完 成定量分析。統(tǒng)計(jì)分析將定量數(shù)據(jù)表示為平均值加減平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用單向方差分析 和Bonferroni事后檢驗(yàn)或者在適用時(shí)使用Kruskal-Wallis和Durm的事后檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，并認(rèn)為P < 0. 05有顯著性。MM針對LP、BoNT-A和脂質(zhì)毒素預(yù)處理的CMG響應(yīng)在第1天膀胱內(nèi)鹽水滴注期間LP組(對照組),BoNT-A組和脂質(zhì)毒素組的CMG參 數(shù)與第8天的上述參數(shù)沒有顯著不同。這些結(jié)果表明第8天時(shí)正常狀況下的膀胱功能沒有 受到LP、BoNT-A和脂質(zhì)毒素的預(yù)處理的影響。第8天時(shí)，開始灌輸后20分鐘 30分鐘，乙酸的刺激作用明顯。在LP和BoNT-A預(yù)處理組中，膀胱內(nèi)滴注AA后的收縮間隔(ICI)分別 明顯地下降了 57. 2%和56.0%。但是，接受了預(yù)先脂質(zhì)毒素處理的大鼠顯示出對AA滴注 的響應(yīng)明顯降低(ICI降了 21. )。這些結(jié)果表明脂質(zhì)毒素預(yù)處理抑制了 AA誘導(dǎo)的膀胱 過動(dòng)癥，在相同劑量的BoNT-A預(yù)處理組中沒有觀察到這種效應(yīng)。對LP、BoNT-A和脂質(zhì)毒素預(yù)處理的組織學(xué)響應(yīng)如對用蘇木精(hamatoxylin)和 曙紅染色的組織切片的組織病理評估所確定的，AA滴注在LP和BoNT-A預(yù)處理組中誘導(dǎo)了 中度炎癥反應(yīng)。但是，AA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在脂質(zhì)毒素預(yù)處理組中得到了明顯的降低(與LP 和BoNT-A預(yù)處理組相比總炎癥分?jǐn)?shù)分別降低了 48. 9%和33. 3% )。這些結(jié)果表明脂質(zhì)毒 素預(yù)處理抑制了 AA誘導(dǎo)的膀胱炎癥。LP.BoNT-A和脂質(zhì)毒素預(yù)處理的CGRP免疫染色脂質(zhì)毒素預(yù)處理組中在膀胱粘膜 層處確認(rèn)了 CGRP免疫染色，而在LP或BoNT-A預(yù)處理組中沒有觀察到這種情況。這些結(jié)果 表明脂質(zhì)毒素預(yù)處理抑制了 CGRP釋放。LP、BoNT-A和脂質(zhì)毒素預(yù)處理的SNAP-25表達(dá)在LP和BoNT-A預(yù)處理動(dòng)物的膀 胱樣品中檢測到SNAP-25陽性神經(jīng)纖維。但是，在脂質(zhì)毒素預(yù)處理動(dòng)物中幾乎不能觀察 到SNAP-25陽性神經(jīng)纖維。蛋白質(zhì)印跡證明，相比于LP和BoNT-A預(yù)處理組，平均SNAP-25 蛋白水平分別有66. 4%的下降和58. 的下降。這些結(jié)果表明了脂質(zhì)毒素預(yù)處理降低了 SNAP-25 表達(dá)。結(jié)論在LP和BoNT-A預(yù)處理大鼠中，在膀胱內(nèi)滴注AA后收縮間隔(ICI)分別降低了 57. 2%和56.0%。但是，接受脂質(zhì)毒素的大鼠顯示出對AA滴注的響應(yīng)有明顯降低(ICI降 低了 21. 1% )。另外，與用LP或BoNT-A預(yù)處理的大鼠相比，脂質(zhì)毒素預(yù)處理的大鼠在炎癥 反應(yīng)、SNAP-25表達(dá)上有明顯的降低，在CGRP免疫反應(yīng)性上增力Π。膀胱內(nèi)脂質(zhì)毒素的施用切 割SNAP-25并抑制了 CGRP從傳入神經(jīng)末端的釋放，而且封閉了 AA誘導(dǎo)的膀胱過動(dòng)癥。這 些結(jié)果支持了 LP可作為遞送BoNT-A的高效載體而無需進(jìn)行注射，和避免了對逼尿肌的影 響。本研究的主要發(fā)現(xiàn)在于膀胱內(nèi)脂質(zhì)毒素預(yù)處理抑制了 AA誘導(dǎo)的膀胱過動(dòng)癥和炎 癥反應(yīng)，而在本動(dòng)物模型中的LP和BoNT-A預(yù)處理組中沒有觀察到這種效果。沒有觀察到 尿潴留。另外，與該模型中的LP和BoNT-A預(yù)處理組相比，脂質(zhì)毒素預(yù)處理組中的SNAP-25 的表達(dá)顯著降低且CGRP顯著增加。膀胱內(nèi)脂質(zhì)毒素滴注為遞送BoNT-A提供更為簡單且有 效的方法，而無需進(jìn)行可能引發(fā)尿潴留的注射。
權(quán)利要求
1.一種用于滴注到膀胱中的脂質(zhì)體制劑，所述制劑包含在藥學(xué)上可接受的載體中的肉毒桿菌毒素。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其中，將所述脂質(zhì)與肉毒桿菌毒素的比例調(diào)節(jié)為使遞送 最優(yōu)化。
3.一種治療膀胱過動(dòng)癥和下尿路癥狀的方法，所述方法包括將在脂質(zhì)體載體中的肉毒 桿菌毒素滴注到膀胱中。
4.如權(quán)利要求1所述的制劑或如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述肉毒桿菌毒素是7 種血清型的一種或多種，而且是雙鏈或單鏈。
5.如權(quán)利要求1所述的制劑或如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述肉毒桿菌毒素的劑 量小于為對膀胱過動(dòng)癥和下尿路癥狀獲得相同效果而通過注射施用的劑量。
6.如權(quán)利要求1所述的制劑或如權(quán)利要求3所述的方法，其中，對進(jìn)行滴注的制劑的體 積進(jìn)行優(yōu)化，以使攝取最優(yōu)化。
7.如權(quán)利要求1所述的制劑，其中，將所述制劑滴注到其它體腔和體表，所述體腔和體 表包括陰道、肛門、直腸、皮膚、咽喉、口腔、鼻腔和氣道。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體用于膀胱內(nèi)藥物遞送，特別是肉毒桿菌毒素(BoNT)的遞送，以通過減少膀胱刺激和尿頻而幫助改善下尿路癥狀。本系統(tǒng)使用了較低且更為安全劑量的BoNT，降低了尿潴留的風(fēng)險(xiǎn)。以30ml～60ml的常用體積將作為液體制劑的脂質(zhì)體-BoNT簡單滴注到膀胱中，達(dá)到的功效與現(xiàn)今用膀胱鏡針頭注射BoNT達(dá)到的功效相似。所述劑量可以低于注射用量，從而使尿潴留風(fēng)險(xiǎn)顯著減少。脂質(zhì)體-BoNT可保護(hù)BoNT免受膀胱和尿液的破壞。脂質(zhì)體-BoNT滴注對患者而言更為舒適，且與原本限于對膀胱鏡BoNT注射熟練且經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)生中的治療形式不同，脂質(zhì)體-BoNT滴注可使更多的醫(yī)生診所提供這種治療形式。
文檔編號(hào)A61P13/10GK102065841SQ200980120455
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者喬納森·H·考夫曼, 邁克爾·B·錢塞勒 申請人:里培拉藥品公司