基于異基因癌細胞的免疫治療的制作方法

專利名稱：基于異基因癌細胞的免疫治療的制作方法
基于異基因癌細胞的免疫治療相關申請的交叉引用 本申請要求2008年3月3日提交的申請第61/033,425號的權益，該申請以引用 方式并入。聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)美國政府在本發(fā)明中享有某些權利，如來自Department of Health andHuman Services (衛(wèi)生與公眾服務部)的NIH合同CA039201中所規(guī)定的。
背景技術：
本發(fā)明涉及改進基于癌細胞的免疫治療(例如，免疫接種或疫苗接種)，包括將 分泌修飾的熱休克蛋白的異基因癌細胞施用給人類受治療者?；诎┘毎拿庖咧委熓?通過給受治療者頻繁施用異基因癌細胞、在第一次或至少一次異基因癌細胞的施用之前 和/或期間消除受治療者中的B細胞、或兩者而改進的。WO 99/42121公開了一種基于細胞的疫苗，其中由轉染的表達構建體編碼的修 飾的熱休克蛋白被分泌。所述疫苗對治療或預防癌癥或感染性疾病可是有效的。重組癌 細胞的一次注射和間隔兩周的重組癌細胞的兩次注射被描述。自體的癌細胞是優(yōu)選的。 相反，本發(fā)明使用異基因癌細胞。WO 2005/030136公開了通過施用被基因修飾以表達CD80和HLA的肺癌細胞而 抑制腫瘤。該種癌細胞不分泌修飾的熱休克蛋白。通常通過腫瘤的外科切除、放射或藥物殺死癌細胞、或其組合來治療癌癥。免 疫系統(tǒng)能夠抑制癌細胞的增殖和擴散。然而，癌細胞可以通過無免疫原性(例如非小細 胞肺癌)來逃避免疫監(jiān)視，無免疫原性阻斷產生有效反應的免疫反應的啟動，或通過有 免疫原性但阻斷免疫反應的效應期來逃避免疫監(jiān)視(例如黑素瘤)?？蛇x擇地，啟動的阻 斷可歸因于腫瘤分泌免疫抑制介質或耐受趨化因子和/或調節(jié)性細胞的刺激、致耐受性 抗原呈遞細胞的刺激、或骨髓阻抑細胞(myelosuppressorcell)的刺激。通過施用異基因癌 細胞的主動免疫治療能夠避開阻斷，并啟動先天性免疫反應和/或獲得性免疫反應。腫 瘤特異性的CD8+T-細胞反應的誘導及加強是特別期望的，如通過癌細胞的細胞溶解或由 癌細胞刺激的干擾素Y的分泌所評價的。Raez等(J.Clin.Oncol.22 2800-2807，2004)描述了在具有晚期轉移疾病的患者
中用于非小細胞肺癌的基于異基因癌細胞的疫苗的I期試驗。腺癌細胞系AD100被轉染 以表達CD80和HLA-Al或HLA-A2。每兩周一次用5 X IO7個細胞皮內免疫患者。三 次免疫接種代表一個療程。除非患者對起始免疫接種沒有反應，否則將施用多達三個療 程，共計九次免疫接種。使用這種基于細胞的疫苗獲得的期望結果可能通過增加免疫接 種的頻率及在至少一次免疫接種之前和/或期間消除B細胞而改進。因此，本發(fā)明的一個目的是提供改進的免疫治療(例如，免疫接種或疫苗接 種)，其包括給人類受治療者施用分泌修飾的熱休克蛋白的異基因癌細胞(通過頻繁施 用)、在起始或至少一次施用之前和/或期間消除B細胞、或兩者。其他優(yōu)勢和改進將 在下文描述或將是由本文的公開內容而明顯的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于免疫接種和疫苗接種的基于異基因癌細胞的免疫治療的改 進。“治療”可以是治療性的、預防性的、或僅僅治標性的。通過施用分泌修飾的熱休克蛋白(例如，gp96)的異基因癌細胞治療人類受治療 者。在本文，“異基因”意思是施用的細胞與治療的受治療者相差一個或多個主要組織 相容性復合物(MHC)分子。熱休克蛋白可通過去除含有內質網滯留信號的結構域而被 修飾。任選地，所述結構域可用人或者小鼠免疫球蛋白IgGl或IgG2的一個或多個重鏈 恒定區(qū)(例如，F(xiàn)c結構域)替代。修飾的熱休克蛋白由表達載體轉染的或病毒載體感染 的癌細胞中的核酸表達。載體可基于來自牛乳頭狀瘤病毒(BPV)的一個或多個調節(jié)信號 (例如，轉錄起始和轉錄終止、剪接供體和剪接受體(slice donorand acceptor)、多腺苷酸 化、復制起始)。載體優(yōu)選地不含有BPV的E5、E6和E7基因。因此，所述癌細胞能 夠由于用于產生它們的技術被認為是“重組的”。抗原(例如，衍生于異基因癌細胞或同基因癌細胞的新抗原或腫瘤抗原的表位) 可在受治療者中誘導先天性或獲得性免疫反應。尤其，CD8+T-細胞反應的誘導和增強是 期望的。CD8+細胞可特異性殺死癌細胞或分泌干擾素Y。 任選地，可通過表達不被受治療者表達的至少一種MHC分子而使得癌細胞異基 因，所述至少一種MHC分子來自由表達載體轉染的或由病毒載體感染的癌細胞中的核 酸。修飾的熱休克蛋白和HLA分子可至少部分地由相同載體或者不同載體編碼。人類受治療者可用異基因癌細胞免疫若干次。基于細胞的免疫原性組合物的兩 次相鄰施用之間的間隔少于兩周。另一個改進可以是基于細胞的免疫原性組合物的至少 一次施用之前和/或期間受治療者中的B細胞的消除。本發(fā)明的進一步的目的和優(yōu)勢方面將從對具體的實施方案和權利要求書、及其 概括的以下描述而對本領域技術人員是顯然的。發(fā)明具體實施方案的描述將包含分泌修飾的熱休克蛋白(例如，缺乏內質網天然滯留序列的熱休克蛋白) 至細胞中的異基因癌細胞的免疫原性組合物施用給受治療者，所述修飾的熱休克蛋白至 少部分地由轉染的表達載體或感染的病毒載體編碼。作為新生的多肽鏈，修飾的熱休克 蛋白可具有它自己的或另一個蛋白的信號序列以靶向分泌途徑。并且相反的N-端信號序 列可以是包含一個或多個人免疫球蛋白重鏈(例如，IgGl或IgG2)恒定區(qū)的肽標簽。任 選地，癌細胞表達異基因的主要組織相容性復合物(MHC)分子(例如，至少部分地由相 同的或不同的載體編碼)。癌細胞可表達或可不表達CD80(例如，至少部分地由相同的 或不同的載體編碼)。修飾的熱休克蛋白、HLA-A及CD80在各種癌細胞系中的表達的 更多細節(jié)在以引用方式并入本文的W099/42121和WO 2005/030136中提供。受治療者可按每劑IXlO7至IOXlO7異基因癌細胞的范圍施用?？蓪?至 IOXlO8的細胞總數(shù)施用給受治療者。在任何兩次相鄰的施用之間，異基因癌細胞可每 日至少兩次、每日一次、每兩天一次、每周兩次、每周一次、每兩周一次或每月一次施 用。至少總計9、18或27劑的異基因癌細胞可被施用。劑量可按少于兩周、少于一周或 者更少、至少每周兩次、至少每兩天一次、至少每天一次、或者至少每天兩次的間隔施 用。治療可持續(xù)至少六周、十周、15周、18周、22周或26周(例如，一至六個月)。這種治療期間，細胞可按少于兩周、一周或者更少、至少每周兩次、至少每兩天一次、 至少每天一次、或者至少每天兩次的間隔施用。細胞可被通過至少皮內、靜脈內、腹膜 內、或皮下途徑注射。每劑量可被分成用于包含單次施用的分開注射的等份。治療可通 過頻繁疫苗接種、B細胞的消除、或兩者而被改進?？乖?例如，衍生于異基因癌細胞的或同基因癌細胞的新抗原或腫瘤抗原的表 位)可誘導受治療者中的特異性免疫反應。例如，免疫原性復合物中與分泌的熱休克蛋 白結合的抗原可從共表達分泌的gp96和抗原二者的異基因癌細胞、或從僅表達抗原的受 治療者的同基因癌細胞獲得。后者推測上將需要修飾的熱休克蛋白被不同于合成gp96的 癌細胞的癌細胞攝入，并且在合成抗原的癌細胞中形成復合物。免疫接種可不需要受治 療者具有功能性CD4+T細胞或淋巴結。因此，gp96所有修飾(包括ER滯留信號的去 除)之后，修飾的gp96必須仍然在免疫原性復合物中結合表位。任選的修飾包括N端的 添加或缺失、C端的添加、1至3個連續(xù)氨基酸的點突變、或1至10個氨基酸的內部添 加或缺失。受治療者可以是人類受治療者。癌細胞可從人類受治療者獲得。免疫原或疫 苗可被施用于捐獻癌細胞的相同受治療者或不同受治療者。異基因癌細胞可已經從與 接受細胞的受治療者相比具有不同移植抗原的受治療者獲得。任選地，主要組織相容 性復合物分子(例如，一個或多個MHC I類分子比如HLA-Al、HLA-A2、HLA-A3、 HLA-A27)可以通過表達載體轉染或病毒載體感染在癌細胞中被表達。因為修飾或組織 型可分別地通過同源重組被引入癌細胞的內源性基因中，所以載體的核酸需要至少部分 地編碼修飾的熱休克蛋白或異基因MHC分子。B細胞可通過本領域已知技術消除，比如活體外(ex vivo)血漿分離置換法 (apheresis)或施用對B細胞受體特異性的抗體(例如，抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗 BLyS)、交聯(lián)B細胞受體的二聚配體(例如，適體二聚體)，或可使用免疫抑制藥物(例 如，環(huán)磷酰胺或強的松龍)。但是與治療淋巴瘤或自身免疫性疾病的利妥昔單抗的使用不 同，根據(jù)本發(fā)明的與免疫治療聯(lián)合的B細胞的消除將空出免疫系統(tǒng)的其他部分以實現(xiàn)癌 癥的基于細胞的免疫治療。例如，從lOOmg/m2至500mg/m2 (或從200mg/m2至300mg/ m2或從350mg/m2至400mg/m2)劑量的利妥昔單抗可按50mg/小時至400mg/小時的速 率一次或多次(例如，每周一次持續(xù)兩周至二個月)施用給患者?？捎铆h(huán)磷酰胺和強的 松龍補充利妥昔單抗。B細胞可被消除，之后緊接著免疫治療(例如，免疫接種或疫苗 接種)。免疫治療期間可監(jiān)測B細胞的水平，當高于正常(即，未消除的)水平的1%、 5%或10%時重復消除。經歷異常增殖的受治療者的癌細胞可以是贅生物或腫瘤(例如，癌瘤 (carcinoma) >肉瘤、白血病、淋巴瘤)，尤其是肺癌。癌包括起源于胃腸器官系統(tǒng)(例 如，食管、結腸、腸、回腸、直腸、肛門、肝、胰、胃)、泌尿器官系統(tǒng)(例如，膀胱、 腎、前列腺)、肌肉骨骼器官系統(tǒng)、肺器官系統(tǒng)(例如，肺)、或生殖器官系統(tǒng)(例如， 宮頸、卵巢、睪丸)的那些。例如，肺癌可以是非小細胞肺癌(例如，腺癌、鱗狀細胞癌 或大細胞癌)、小細胞肺癌、及類癌瘤。癌細胞可衍生自經歷治療的受治療者或衍生自不 同于所述受治療的另一個體。對于前一種情形，異基因性可通過從轉染的表達載體或感 染的病毒載體表達不相關的主要組織相容性復合物I類分子而被賦予。只要癌細胞被改造為分泌修飾的熱休克蛋白，癌細胞可以是無免疫原性的或具有低免疫原性。癌細胞可來 自癌瘤。示例性的肺癌細胞是AD100腺癌，除衍生該細胞系的患者及共有該患者的MHC 單元型(haplotype)的任何罕見個體外，AD100腺癌對于所有受治療者均是異基因的。 AD100腺癌的衍生在WO 2005/030136中描述。AD100不表達HLA-A1、HLA-A2、或 CD80。胰腺癌可用來自ATCC CRL1420的分泌gp96_Ig的MIA PaCa-2治療；卵巢癌可 用來自ICLC HTL97004的分泌gp96_Ig的OVCAR-3治療。治療效力可通過癥狀的減輕、疾病的延遲進展或疾病的消退、或存活的延長來 評價?；蛘甙┘毎鸆D8+T細胞細胞溶解或被它們刺激的干擾素Y的測定可在體外被測 量。主動性免疫治療的改進可結合手術、放射治療、和/或化學治療而被用于治療癌 癥。加強可通過至少每月一次維持一至二年施用免疫原性復合物而發(fā)生。免疫原性組合物包括異基因癌細胞和藥學可接受的載體和/或媒介物(vehicle)。 例如，載體可以是藻酸鹽或PLGA珠或病毒顆粒，并且媒介物可以是注射用水或緩沖鹽 水溶液。配制組合物之前，載體或媒介物可被證實無病原體和致熱原。細胞可被輻照 并懸浮于含0.5 %人血清白蛋白的緩沖鹽水中。組合物優(yōu)選地適合用于通過注射或儲存 (depot)用于全身或局部施用。優(yōu)選地，施用前對組合物進行無細菌和病毒污染檢測。為 避免可能的污染源，在無血清、已知成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)異基因癌細胞將是優(yōu)選的。細胞 可在補加20%二甲基亞砜作為冷藏保存劑的相同培養(yǎng)基中保存。
實施例抗腫瘤疫苗接種當施用于首次接受試驗的(naive)、無腫瘤小鼠時是非常有效 的，導致隨后攻擊時阻止腫瘤生長。阻止一般是長效和腫瘤特異性的，顯示獲得性免疫 反應的參與。當疫苗被用于已經建立腫瘤的治療性治療時，這種情況發(fā)生根本改變。能 夠有效地建立保護性免疫的相同劑量的疫苗一般不能提供治療性益處。這種治療性疫苗 接種效力的缺乏的原因被認為源于腫瘤誘導的抑制性細胞的誘導、調節(jié)性細胞的生成、T 細胞無反應或耐受性的誘導、或其組合。無論腫瘤誘導的免疫抑制的精確機制如何，用 于癌癥治療的疫苗治療的成功將依賴于克服或中和這些腫瘤誘導的抑制效應?；趤碜燥@示熱休克蛋白gp96相關的肽被樹突狀細胞交叉提呈給CD8+細胞的 Srivastava和Rammensee實驗室的開創(chuàng)性工作，我們已經研制適合用于抗腫瘤治療的疫苗 接種系統(tǒng)。轉染gp96-IgGl-Fc融合蛋白至腫瘤細胞中導致與陪伴的腫瘤肽形成復合物的 gp96-Ig的分泌。分泌gp96-Ig的腫瘤的腸胃外施用觸發(fā)強健的抗原特異性CD8+CTL擴 增以及先天性免疫系統(tǒng)的激活。腫瘤分泌的gp96導致DC和NK細胞募集于gp96分泌 位點并通過結合至CD91和TLR2及TLR4介導DC的激活。gp96及其陪伴的肽的胞吞攝 入觸發(fā)肽經由MHC I類的交叉提呈及不依賴CD4+細胞的強大的、同源CD8的激活。在 這種模型系統(tǒng)中，通過使用獲得性轉移的TCR轉基因的、gfp_標記的CD8+T細胞，可在 疫苗接種的4至5天內精確地定量CD8+CTL的擴增。使用這套檢測系統(tǒng)，我們現(xiàn)在顯示 在我們的模型系統(tǒng)中腫瘤誘導的免疫抑制是抗原非特異性的，并能夠通過頻繁的免疫接 種或B細胞的缺失而被克服。受治療者、細胞系及抗體 C57BL/6J (B6)小鼠購自 The Jackson Laboratory 或 Charles RiverLaboratories。具
6有 B6 背景的 Ig- μ -鏈缺失小鼠(DCBM)購自 The JacksonLaboratory。gi^(綠色熒光蛋白)小鼠從其生產商獲得。轉基因C57BL/6JOT-I小鼠(獲得 自Dr.M.Bevan)表達對于H_2Kb-限制性雞卵白蛋白-衍生肽257-264 (SIINFEKL)特異性 的TCR(V α 2V β 5.1.2)。根據(jù)機構指導原則在Miami大學動物設施中將gfp小鼠與OT-I 小鼠雜交產生gi^-OT-I小鼠。篩查后代小鼠的ova-TCR基因的表達并通過熒光篩查gi^ 的表達。所有小鼠在6-12周齡被使用。用含gp96-Ig的載體pCMG-His轉染EG7細胞系(獲得自M.Bevan)。僅用載 體轉染對照細胞。Lewis肺癌(LLC)細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collection)，并用在pAC-neo-ova中的卵白蛋白或用卵白蛋白載體和含gp96_Ig的 pCMG-His 二者轉染。所有細胞在含10%胎牛血清(FCS)和慶大霉素(GIBCO)的IMDM 培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)。為維持轉染的細胞，用于篩選的抗生素(G418或L-組氨醇， Sigma, St.Louis，MO)被加入培養(yǎng)物。以下抗體被用于染色抗-CD16/32(2.4G2)、CyChrome-抗-CD3ε ( 145-2C11)、-抗 _CD5(UCHT2)、-抗 _CD8a (53-6.7)、PE-CD19 (4G7)、PE 或 FITC-抗-NK1.1 (PK136)、及 PE 或 FITC-抗 _CDllc(HL3)購自 BDPharMingen。ofgfp-OT-I細胞和CD19+B細胞的純化和獲得性轉移脾細胞和淋巴結(LN)細胞的單細胞懸液獲自gfp-OT-I小鼠并將其混合。通過 氯化銨溶解消除單細胞懸液中的紅血細胞。根據(jù)制造商的說明使用抗-CDSa磁性微珠和 MACS柱(Miltenyi Biotec)通過陽性柱選擇分選Gfp-OT-I細胞。當用流式細胞計數(shù)分析 測定時分離的OT-I細胞的純度大于95%。通過流式細胞術定量Va 2和νβ 5.1.2在純 化的細胞中的表達。對于B細胞的純化，用抗-CD19微珠(Miltenyi Biotec)純化CD19+ 細胞。為了在BCDM小鼠中重建B細胞，在腫瘤細胞移植之前兩天經尾靜脈獲得性轉移 IO7個純化的細胞。體內CD8+CTL擴增的分析為測定CD8+CTL的擴增，用106gfp-OT_I獲得性轉移小鼠，兩天后用1-4X106 個未被輻照的EG7-gp96-Ig細胞的腹膜內(i.p.)注射免疫小鼠。繼免疫之后，從腹膜腔、 腸系膜、主動脈旁淋巴結(dLN)及外周血中按定時的間隔收獲細胞。用氯化銨溶解從樣 品中去除紅血細胞。一百萬個細胞在4°C與在含0.5% BSA(PBA)的PBS中的抗-CD16/32 單抗孵育10分鐘以阻斷FcR結合。之后細胞與指定抗體孵育30分鐘。用CELL Quest 軟件(BD Bioscience)在FACScan(Becton Dickinson)上分析樣品。由被靶向的細胞的百 分數(shù)和每個組織中細胞的總數(shù)來計算每個組織指定的免疫細胞的總數(shù)。腫瘤接種和治療方案將在200 μ 1 PBS中的未被輻照的EG7、LLC或LLC-ova細胞皮下(s.c.)注射入 小鼠的肋腹。LLC-ova細胞接種后五天(第5天)，經尾靜脈注射在0.3ml體積PBS中 的IO6純化的gfp-OT-I。兩天后，按照在圖中所示的時間表通過在0.5ml體積PBS中的 IO6未被輻照的LLC-ova-gp96-Ig或IO6未被輻照的EG7-gp96_Ig細胞的i.p.注射免疫小 鼠。用PBS、EG7或LLC-ova治療對照小鼠。每周二次持續(xù)至少20天測量肋腹腫瘤的 二維尺寸。統(tǒng)計分析
用t檢驗評價顯著性。認為ρ < 0.05的計算值顯示統(tǒng)計學顯著性。建立的腫瘤不依賴TCR特異性而抑制gp96_介導的CD8-CTL擴增轉染熱休克融合蛋白gp96_Ig至腫瘤細胞中導致gp96_Ig及gp96_陪伴的肽的分 泌。gp96-Ig是通過用IgGl的Fc部分替代gp96的內質網滯留信號(KDEL)而產生的修 飾蛋白。用分泌gp96-Ig的腫瘤細胞注射小鼠導致誘導腫瘤特異的免疫和對用相同的、但 未轉染的腫瘤的后續(xù)攻擊的記憶及保護。由分泌的gp96-Ig產生的腫瘤免疫對gp96-陪 伴肽(包括源于腫瘤內生抗原(諸如EL4特異性抗原)的肽)及對替代抗原(諸如轉染入 EL4(EG7)或LLC(LLC-Ova)的卵白蛋白)是特異的。卵白蛋白替代抗原提供一種經由 卵白蛋白特異的、OT-I TCR轉基因的CD8+細胞的獲得性轉移在體內精確測定CD8+CTL 擴增的方法。已知建立的腫瘤對于CTL擴增是抑制性的。為測定在建立的腫瘤的存在和不 存在時的CTL的反應，我們使用TCR轉基因的OT-I系統(tǒng)，其中轉基因的CD8+CTL響 應于分泌gp96-Ig-0va的卵白蛋白-轉染的同基因腫瘤或異基因腫瘤。作為可移植的腫 瘤模型，我們使用了通過卵白蛋白轉染源于EL4的被分類為免疫原性的和高致腫瘤性的 EG7。另外，我們也使用了被認為具有較低免疫原性且高致腫瘤性的Lewis肺癌(LLC及 LLC-ova) 0兩種細胞系的分裂速率非常迅速，在培養(yǎng)中具有8-12小時的倍增時間。用一百萬EG7-gp96_Ig-細胞單次i.p.免疫接種之后，24小時內每IO6細胞分泌 60-80ng的gp96-Ig，OT-I由在CD8+門(gate)中的低免疫前水平( 0.2% )擴增至在無 腫瘤小鼠中的高頻率(15% -40% )。輻照的不分泌gp96-Ig的EG7的施用不能引起顯著 的OT-I擴增。但在肋腹中的遠端位點出現(xiàn)的皮下建立的EG7腫瘤顯著抑制gp96-疫苗 誘導的在腹膜腔中及系統(tǒng)性地在脾和淋巴結中的OT-I的擴增。EG7腫瘤分泌卵白蛋白并 表達Kb-0Va。因此，通過腫瘤床或腫瘤引流淋巴結的再循環(huán)后，獲得性轉移的OT-I由于 接收通過其Kb-Ova-特異性TCR的信號而不接收共刺激信號2而變得無反應性是可能的。 為評價這個假說，在遠端位點皮下建立都不表達卵白蛋白的同基因腫瘤EL4和LLC。隨 后，靜脈內(i.v.)獲得性轉移OT-I并用EG7-gp96-Ig i.p.免疫小鼠。建立的EL4和LLC 通過分泌的gp96-0va在抑制OT-I擴增上與建立的EG7同樣有效，表明所述抑制不依賴 于腫瘤中合適的TCR抗原Kb_0va。雖然在腹膜腔中的和系統(tǒng)性的OT-I的擴增被在遠端 位點的LLC和EL4的出現(xiàn)抑制，但是當與無腫瘤小鼠相比時，EG7-gp96-Ig i.p.免疫接種 后募集至腹膜腔的總細胞實際上增加。也如其他人所報告的，數(shù)據(jù)顯示建立的腫瘤能夠誘導抗原非特異性的CTL擴增 的抑制。這種抑制的誘導與增加的細胞募集至在腹膜腔中的疫苗位點相關。疫苗誘導的 腹膜細胞從攜帶腫瘤小鼠至無腫瘤小鼠的轉移抑制在受體小鼠中的OT-I的擴增，表明調 節(jié)性或抑制性細胞的存在。因此，由于在攜帶腫瘤小鼠中不依賴抗原的細胞抑制反應， CD8+T細胞是無反應性的。為克服抗原非特異性的免疫抑制，我們評價了通過疫苗接種對CD8+CTL的頻繁 地重復的抗原特異性刺激是否可抵消攜帶腫瘤小鼠中發(fā)現(xiàn)的抑制性活性。建立的腫瘤的排斥需要頻繁的gp96_Ig免疫接種雖然許多疫苗接種策略(包括分泌的gp96_Ig)能夠在小鼠中建立對抗腫瘤和腫 瘤抗原的保護性免疫，但是通過治療性的疫苗接種排斥已經建立的腫瘤是更困難的?？紤]到抗原非特異的CD8擴增的抑制的觀察，我們分析了不同的疫苗接種時間表如何影響 腫瘤排斥和/或腫瘤生長。我們首先通過在與腫瘤移植同一天開始疫苗接種以分析治療性疫苗接種的效 應。將一百萬個EG7腫瘤細胞皮下移植于同基因小鼠的肋腹中。在同一天(第0天)， 一百萬個分泌gp96-Ig的EG7疫苗細胞(EG7-gp96-Ig)，以60_80ng/106細胞X24小時 的速率分泌gp96-Ig)作為疫苗i.p.施用，并在第3、7、10和14天重復疫苗接種。與未 接受治療的小鼠相比，腫瘤生長被在與腫瘤移植的同一天開始的四次EG7-gp96-Ig疫苗 接種降低。治療效應是gp96依賴和抗原依賴的。不分泌gp96-Ig的輻照的EG7或不 表達EG7-抗原但以與EG7-gp96-Ig相同的速率分泌gp96_Ig的LLC-gp96_Ig，當按與 EG7-gp96-Ig相同的劑量和時間表作為疫苗i.p.施用時不能延緩腫瘤生長。當在EG7接 種之后兩天或更遲開始用EG7-gp96-Ig疫苗接種時，使用相同疫苗接種時間表的治療效 應實質上被降低。這些數(shù)據(jù)說明即使在兩天后建立的腫瘤也比新移植的腫瘤更難以被疫 苗接種控制。我們接下來評價建立的腫瘤是否可以被更頻繁的疫苗接種時間表所控制。將 一百萬個EG7腫瘤細胞皮下移植于肋腹中并允許其建立三到七天，允許至少七次或更 多次腫瘤細胞倍增。在這期間，出現(xiàn)肉眼可檢測的腫瘤結節(jié)的血管形成。之后每天 一次用一百萬個EG7-gp96-Ig細胞i.p.接種小鼠，或在特異性對照中用相同的時間表和 劑量的LLC-gp96-Ig細胞、或輻照的EG7細胞i.p.接種小鼠，或保持小鼠未接種。用 EG7-gp96-Ig每天一次的疫苗接種有效地控制了已經建立三天的EG7的生長，而用輻照 的EG7或用LLC-gp96-Ig的每天一次的疫苗接種對建立的EG7的生長無效應。在進一 步的研究中，在用EG7-gp96-Ig開始疫苗接種之前，我們允許移植的EG7腫瘤建立5和 7天。需要每天兩次的疫苗接種以在腫瘤建立的這個較晚階段延緩腫瘤生長。數(shù)據(jù)顯示 頻繁的免疫接種能夠在小鼠中抑制腫瘤生長達24天的時期。將需要進一步的研究以確定 持續(xù)的長期疫苗接種時間表是否能夠徹底根除腫瘤。為證實用免疫原性EG7淋巴瘤獲得的數(shù)據(jù)，用較低免疫原性、建立的LLC重復 實驗。開始于腫瘤移植后第三天的用LLC-gp96-Ig的重復的i.p.免疫接種(第3天、7 天、10天、14天)導致LLC的腫瘤進展的延緩。LLC的每天一次的免疫接種在腫瘤延 緩中并未更有效。由于EG7-gp96-Ig疫苗接種不能夠控制LLC腫瘤生長，所以免疫接種 效應是腫瘤特異性的。腫瘤生長的控制也不能通過輻照的LLC實現(xiàn)，但腫瘤生長的控制 依賴于gp96-Ig的分泌。這些數(shù)據(jù)啟示通過分泌的gp96_Ig和它的陪伴肽的頻繁的DC激活和NK激活與 抗原交叉呈遞相結合能夠克服建立的腫瘤誘導的、抗原非特異性免疫抑制。gp96介導的DC募集和NK募集及CD8 CTL擴增在B細胞缺陷小鼠中被增強若干團體已經報導當與野生型小鼠相比時Thl抗腫瘤反應在B細胞缺陷小鼠 (BCDM)中被增強。因此我們研究B細胞在gp96介導的CTL擴增和抗腫瘤免疫中的作 用。腹膜腔中被CD5-CD19+B細胞和CD5+CD19+B1-B細胞填充，CD5+CD19+B1-B 細胞產生IgM抗體且在激活后不經歷同種型轉換。用EG7-gp96-Igi.p.免疫接種后， CD5-CD19+群到免疫接種后第4天增加約五倍，而CD5+B1B細胞僅適度增加。gp96介 導的OT-I擴增在免疫接種后第4天和第5天是最大的。這在疫苗接種位點腹膜腔中DC和NK細胞的募集和激活之后。在B細胞缺陷小鼠中，DC細胞并且尤其NK細胞的募 集在三次獨立試驗中增加并且募集的NK細胞在腹膜腔中保留較長久。差異未達到顯著 性但是可重復的。野生型B細胞至BCDM的獲得性轉移消除了 DC細胞和NK細胞的募 集的增加。該發(fā)現(xiàn)啟示B細胞影響gp96誘導的先天性免疫細胞的募集并啟示B細胞也 可參與調節(jié)或抑制CD8+CTL的擴增。因此我們評價了 gfp-標記的OT-I的擴增在BCDM中是否增加。到第4天， BCDM中gp96免疫接種之后的OT-I擴增是在野生型小鼠中所見的約二倍強。重要的 是，在腹膜腔中和在引流淋巴結中OT-I在免疫接種后第7天和第12天維持在顯著更高的 頻率。先于免疫接種的野生型B細胞至BCDM的獲得性轉移降低OT-I的擴增至在野生 型小鼠中所見的那些水平或以下。由于IL-IO缺陷小鼠展示類似于野生型小鼠的OT-I擴 增而非在BCDM中所見的增強的擴增，因此B細胞存在對OT-I擴增的抑制不是由IL-IO 的產生介導。gp96介導的對建立的腫瘤的排斥在B細胞不存在時被加強如上述所示，在野生型小鼠中建立的EG7的生長控制最低限度需要每天一次的 gp96免疫接種。類似地，LLC的進展能夠被頻繁的免疫接種延緩。在BCDM中EG7 細胞和EL4細胞被排斥并且不能建立腫瘤；但是LLC和LLC-ova能夠在BCDM中建 立，雖然它們以比在野生型小鼠中更緩慢的速率生長。在BCDM中和在野生型小鼠中 LLC-ova在肋腹皮下地建立7天。i.v.獲得性轉移OT-I并且兩天后以單次劑量i.p.施用 LLC-ova-gp96-Ig并監(jiān)測腫瘤生長。在BCDM中單次的免疫接種導致在三只小鼠中建立 的七天LLC-ova腫瘤的徹底的排斥且在兩只小鼠中導致顯著的腫瘤減小。在治療不存在 時LLC-ova在BCDM中繼續(xù)逐漸生長，雖然是以比在野生型小鼠中更低的速率。BCDM 的B細胞重建產生類似于在野生型小鼠中所見的疫苗接種效應，即進展延緩。單次免疫接種對BCDM中建立的LLC的最適的腫瘤控制被足夠高的數(shù)量的腫 瘤特異的CTL前體(OT-I)和被抗原特異的免疫接種(LLC-ova-gp96-Ig) 二者支持。在 BCDM中一百萬個獲得性轉移的OT-I的存在而無gp96免疫接種在大多數(shù)小鼠中不導致 腫瘤排斥。同樣地僅gp96-免疫接種而無OT-I轉移比組合有效性低。在非小細胞肺癌(NSCLC)中的異基因癌疫苗的臨床試驗用gp96_Ig和HLA-Al轉染異基因肺癌細胞系AD100。一百萬細胞中至少70% 的細胞每24小時表達多于60ng gp96-Ig。重組癌細胞被輻照并且然后被皮內注射于患有 晚期、復發(fā)或轉移的NSCLC (IIIB/IV期)的人類受治療者。不需要HLA匹配。如果未 產生關于毒性的顧慮，將在17周期間每周一次或每兩周一次用5X IO7個異基因癌細胞接 種患者。可選擇地，可通過以下遞送總計4.5X IO8個異基因癌細胞(a)在18周期間的 九次注射，(b)在18周期間的18次注射，或(c)在18周期間的36次注射。討論非常期望建立的腫瘤抑制抗腫瘤免疫。在建立的腫瘤存在時腫瘤特異性T細胞 變得無反應性。對本研究中使用的B細胞淋巴瘤的無反應性是抗原特異的、MHC限制 的且依賴于MHC匹配的骨髓來源的抗原呈遞細胞的存在。在其他研究中抗原非特異的 骨髓抑制性細胞和抗原非特異的T調節(jié)性細胞已經被牽涉在抗腫瘤免疫的抑制中。我們 的研究顯示體內CTL反應的抑制能夠通過抗原非依賴途徑由建立的腫瘤獲得。響應于gp96-ova疫苗接種的OT-I擴增不依賴于腫瘤的卵白蛋白表達被建立的腫瘤抑制。這種 類型的抑制可由T調節(jié)性細胞或通過其他抑制性細胞(諸如骨髓抑制性細胞或M2巨噬細 胞)實現(xiàn)。根據(jù)這個假說，通過在攜帶腫瘤小鼠中由gp96-疫苗接種引發(fā)的腹膜細胞的 轉移，抑制性活性可轉移至無腫瘤小鼠。雖然針對gp96-OVa免疫接種的OT-I反應在建立的腫瘤存在時被強烈抑制，但是 它未被完全阻斷，啟示建立的腫瘤的免疫抑制和由分泌的gp96-0va刺激的激活的DC經 由抗原交叉呈遞對CD8-CTL的激活之間存在平衡。我們先前已經顯示在腫瘤首次接受試 驗的小鼠中gp96-0va導致NK和DC的募集和激活及隨后的OT-I擴增。建立的腫瘤， 雖然通過LLC-gp96-Ig疫苗接種實際上增強細胞募集入腹膜腔，但抑制OT-I擴增并啟示 在建立的腫瘤存在時，許多募集的細胞可能是抑制性細胞。這個假說預測，用gp96-0va 頻繁的免疫接種可經由通過重復的gp96介導的DC的刺激和NK的刺激、增加的抗原交 叉呈遞及CTL啟動來使平衡由抑制轉向增加的免疫激活以克服抑制活性。頻繁的免疫接 種確實對腫瘤進展的延緩具有顯著效應。在建立的EG7情況中，每天一次或每天兩次的 疫苗接種在停止腫瘤進展中更有效。對于LLC，每兩天一次或每三天一次的免疫接種是 足夠的且每天一次的免疫接種并不是更有效的。這些腫瘤特異性差異可能與在外周腫瘤 存在時產生抑制性細胞的速率相關?？蛇x擇地，這些腫瘤特異的差異可取決于腫瘤介導 抑制性細胞的誘導的機制或已經誘導出的抑制性細胞的性質。這些疑問正在研究中。通過研究OT-I對用腫瘤分泌的gp96-ova i.p.免疫接種的反應，我們注意到大量 的B細胞被募集入腹膜腔。已經報導B細胞對于抗腫瘤免疫是抑制的，提示問題在于B 細胞在gp96介導的OT-I擴增中的作用。使用B細胞缺陷小鼠，立即變得清楚的是，B 細胞抑制gp96-0va免疫接種后的NK和DC的募集以及OT-I擴增二者。B細胞重建的 BCDM對gp96-0va介導的OT-I擴增的反應類似野生型小鼠，排除B細胞缺陷已經以與 B細胞的不存在無關的方式改變BCDM對gp96-0va免疫接種的反應性的可能性。即使 在僅一次的gp96-0va免疫接種后，B細胞缺陷導致增強的OT-I擴增并導致七天建立的 LLC-ova腫瘤的強烈增強的腫瘤排斥。數(shù)據(jù)顯示腫瘤介導的抑制性細胞的誘導在B細胞 不存在下大大減少或B細胞自身充當抑制性細胞。B細胞是否參與抑制性細胞的誘導或 B細胞自身是否對CTL反應是免疫抑制性的需要進一步研究；但是IL-IO看來似乎不參 與B細胞介導的腫瘤免疫的抑制。在進行中的研究中，我們已經發(fā)現(xiàn)OX40-L缺陷的B 細胞顯示抑制抗腫瘤免疫反應的能力下降。仍需確定B細胞上表達的OX40-L如何介導 gp96的抗腫瘤免疫的抑制和CTL擴增。我們的研究提供能夠研究和進一步確定抗原非依賴性的免疫抑制的模型。尤其 B細胞在這個過程中的作用將是極受關注的。另外，我們的研究指出能夠使抗腫瘤疫苗 更有效的方法。用抗體和后續(xù)的頻繁疫苗接種例如用腫瘤分泌的gp96-疫苗進行的B細 胞的消除，可導致比用常規(guī)疫苗接種方法所見更有效的腫瘤生長的控制。本文引用的專利、專利申請、書籍、及其它出版物通過引用方式以它們的 整體并入。尤其，本文描述的改進可應用于施用以引用方式并入的美國專利申請第 11/878,460號的癌細胞疫苗。在陳述數(shù)值范圍中，應理解也描述該范圍內的所有值(例如，一至十也包括一 和十之間的每個整數(shù)以及所有的中間范圍比如二至十、一至五和三至八)。術語“約”可指與測量相關的統(tǒng)計學不確定性或數(shù)量的變化性，本領域技術人員將理解其不影響本 發(fā)明的操作或其專利性。在權利要求的含義及它們的法律等效物的范圍內的所有修改和替代均包含于權 利要求的范圍內。敘述“包含”的權利要求允許其他要素包括在權利要求的范圍內；本 發(fā)明也通過敘述過渡詞“主要由......組成”(即，如果其他要素不實質上影響本發(fā)明的操
作，允許它們包括在權利要求的范圍內)”或“由......組成”(即，僅允許權利要求中列
舉的要素而不允許通常與本發(fā)明相關的雜質或無關緊要的活性)替代敘述“包含”術語 的這種權利要求而被描述。應理解，如果權利要求中沒有明確地敘述，在本說明書中描述的要素不應被解 釋為對要求保護的發(fā)明的限制。因此，授權的權利要求而不是對權利要求作出解釋的來 自說明書的限制是用于確定法律保護的范圍的基礎。截然相反，現(xiàn)有技術被明確地從本 發(fā)明排除至預料到要求保護的發(fā)明或破壞新穎性的具體實施方案的程度。此外，預期權利要求的限定之間無特定關系，除非權利要求中明確地敘述這種 關系(例如，產品權利要求中組分的排列或方法權利要求中步驟的順序不是對權利要求 的限制，除非明確陳述是限制)。本文公開的單獨要素的所有可能的組合及排列被認為是 本發(fā)明的方面。類似地，對本發(fā)明描述的概括被認為是本發(fā)明的部分。由上所述，可以其他特定形式實施本發(fā)明而不背離本發(fā)明的精神或本質特征， 這將對本領域技術人員是顯然的。因為提供給本發(fā)明的法律保護范圍將由所附的權利 要求書而非本說明書標明，所以所描述的實施方案應該僅被當作說明性的、而非限定性 的。
權利要求
1.一種免疫人類受治療者的方法，所述方法包括(a)施用給人類受治療者分泌修飾的gp96熱休克蛋白的異基因癌細胞的免疫原性組 合物，其中所述修飾至少去除天然gp96中含有內質網(ER)滯留信號的結構域，以及之 后(b)施用給人類受治療者分泌修飾的gp96熱休克蛋白的異基因癌細胞的另一種免疫 原性組合物，其中所述修飾至少去除天然gp96中含有內質網滯留信號的結構域；其中施用所述免疫原性組合物和所述另一種免疫原性組合物之間間隔少于二周。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中施用所述免疫原性組合物和所述另一種免疫原性 組合物之間間隔一周或更少。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中至少每周將至少九種免疫原性組合物施用給人類 受治療者，所述至少九種免疫原性組合物的每一種包括分泌所述修飾的gp96熱休克蛋白 的異基因癌細胞。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述天然gp96通過至少用IgGl或 IgG2的一個或多個重鏈恒定區(qū)替代含有ER滯留信號的結構域而被修飾。
5.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述天然gp96通過至少用IgGl或 IgG2的Fc結構域替代含有ER滯留信號的結構域而被修飾。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述癌細胞表達HLA-Al或 HLA-A2。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的方法，其中至少所述修飾的gp96熱休克蛋白 由包括來自牛乳頭狀瘤病毒的一個或多個調節(jié)信號的載體編碼。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述癌細胞來自癌瘤。
9.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述癌細胞來自肺癌。
10.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中AD100用編碼至少用IgGl或IgG2 的Fc結構域替代含有ER滯留信號的結構域而被修飾的天然gp96 (gp96-Ig)和HLA-Al或 HLA-A2并包括來自牛乳頭狀瘤病毒的一個或多個調節(jié)信號的一個或兩個表達載體轉染。
11.根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的方法，還包括在所述免疫原性組合物的初 始施用之前和/或期間消除受治療者的B細胞。
12.根據(jù)權利要求1至10中任何一項所述的方法，還包括在所述免疫原性組合物的 至少一次施用之前和/或期間消除受治療者的B細胞。
13.—種改進的使用分泌修飾的gp96熱休克蛋白的異基因癌細胞免疫接種或疫苗接種 人類受治療者的方法，其中天然gp96的所述修飾至少去除含有內質網(ER)滯留信號的 結構域；所述改進包括頻繁地施用異基因癌細胞，其中異基因癌細胞以少于兩周的間 隔被施用給受治療者；在所述異基因癌細胞的至少一次施用之前和/或期間消除受治療 者中的B細胞；或既頻繁地施用所述異基因癌細胞又消除受治療者中的B細胞。
14.免疫原性組合物用于人類受治療者的免疫治療的用途，所述免疫原性組合物包含 分泌修飾的gp96熱休克蛋白的異基因癌細胞，其中天然gp96的所述修飾至少去除含有內 質網(ER)滯留信號的結構域，其中至少兩種免疫原性組合物以少于兩周的間隔被施用給 受治療者、在所述免疫原性組合物的至少一次施用之前和/或期間消除受治療者中的B細 胞、或兩者。
全文摘要
通過向人類受治療者頻繁施用分泌修飾的熱休克蛋白(例如，gp96)的異基因癌細胞、消除受治療者中的B細胞、或兩者，可改進基于細胞的免疫治療(例如，免疫接種或疫苗接種)。抗原(例如，衍生于異基因癌細胞或同基因癌細胞的新抗原或腫瘤抗原的表位)可誘導受治療者中的特異性免疫反應。例如，免疫原性復合物中與分泌的熱休克蛋白結合的表位可從共表達分泌的gp96和抗原二者的異基因癌細胞、或從僅表達抗原的受治療者的同基因癌細胞獲得。
文檔編號A61P37/00GK102014937SQ200980115985
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權日2008年3月3日
發(fā)明者埃克哈德·R·波達克, 山崎浩一, 約瑟夫·D·羅森布拉特 申請人:邁阿密大學