專利名稱：物質(zhì)在制備治療感冒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療和/或預防鼻病毒所引起的疾病。
背景技術：
眾所周知，上呼吸道中的正常細菌菌群，對防止致病菌過度生長和后續(xù)感 染，是非常重要的。正常菌群的大多數(shù)細菌，是由α-血溶鏈球菌(alpha haemo lyticstreptococci,AHS)組成。已經(jīng)顯示，為了抑制鼻竇炎和中耳炎致病菌，AHS利用的最 重要機制之一是，產(chǎn)生相當量的過氧化氫，H2O2[1]。過氧化氫也是鼻咽粘膜非特異性防御體系的成員之一、乳過氧化物酶(LPO)的底 物。乳過氧化物酶依靠過氧化氫產(chǎn)生亞(hypo)硫氰酸酯，0SCN-，一種更加有效的抗菌物 質(zhì)。包含AHS的正常細菌菌群和人體粘膜，對過氧化氫和亞硫氰酸酯都有天然保護[2]。先前已經(jīng)公開了產(chǎn)氫酶在油膏中應用，用于皮膚周圍和鼻孔以治療葡萄球菌，本 文則是針對皮膚菌群的治療，一個包含過氧化氫的油膏Microcid 的平行方案。EP 1 490 096公開了產(chǎn)生過氧化氫的鼻噴劑在治療中耳炎中的應用，優(yōu)選用于治 療兒童。然而，雖然存在多種可望治療中耳炎的抗生素，但其沒有顯示出可以積極治療鼻病 毒所引起的感冒。發(fā)明概述本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以使用產(chǎn)生過氧化氫的酶，以使引發(fā)感冒的鼻病毒失活。本發(fā)明的一個實施方式涉及治療和/或預防鼻病毒所引發(fā)的疾病的方法，其中有 需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進行治療。在本發(fā)明進一步的實施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶，木糖醇氧 化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。在本發(fā)明的另一個實施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶是與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖 氧化酶。在本發(fā)明的一個實施方式中，疾病是感冒。在本發(fā)明進一步的實施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶在Ringer' s溶液中制備。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述藥物是水溶性的。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述藥物被制成鼻噴劑。在本發(fā)明進一步的實施方式中，所述藥物被制成鼻滴劑。在本發(fā)明的另一實施方式中，將酶底物加至所述藥物中。發(fā)明詳述鼻病毒(RV)是引起感冒的最普通的媒介[3]。而且，感冒通常發(fā)生在兒童的中耳 炎之前。RV不是全身性的感染，而是位于鼻腔和鼻咽[4]。已知過氧化氫能使RV失活[5]， 但是，基于下列多種原因，不可能制備為了失活RV感染而包含過氧化氫的鼻噴劑a.噴劑在鼻的散布不能涉及到大多數(shù)病毒顆粒所處的鼻腔的后部[6]。b.粘膜細胞中豐富的過氧化氫酶，會在過氧化氫到達鼻后部區(qū)域很早之前，就會 將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣。
c.足量的過氧化氫濃度肯定是高的初始濃度，因此將會相當刺激鼻粘膜[7]。除了針對例如流鼻涕有癥狀的減輕之外，目前還沒有針對感冒發(fā)作有文獻證明效 果的藥物。本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以利用產(chǎn)生過氧化氫的酶，以持續(xù)失活鼻病毒。已顯示，溫 育僅30分鐘，可足以失活相當量(> IOOTCID5ci)的接種在人氣管細胞中的鼻病毒。TCID5tl 定義為在至少50%的接種管中顯示出細胞病變效應(=感染)需要的病毒濃度。這表明其 可以治療鼻病毒感染位于鼻腔的后部的感冒。因此，過去不可能預見產(chǎn)生過氧化氫的酶，例 如G0，將會具有下列特性1.在30分鐘內(nèi)持續(xù)失活鼻病毒。2.可預防細胞的進一步感染，即使在開始接種后超過兩天時進行GO的加入，這意 味著其不僅可以用于預防感冒，而且可以用于治療癥狀開始之后的感染。3.可在鼻咽維持足量的過氧化氫濃度一段時間，以失活粘膜中的所有病毒場所。 只有那樣，感冒癥狀會消失。驚奇地是，如我們的實驗所示，包含GO和葡萄糖的鼻噴劑滿足以上所有標準。葡糖氧化酶(GO)是產(chǎn)生過氧化氫的酶，其對人類使用具有良好耐受性。它是蜂蜜 的天然成分[8]，并已經(jīng)作為抗菌防腐劑使用了許多年。GO的產(chǎn)氫效應，也已經(jīng)在各種漱口 產(chǎn)品(Oral Balance )和牙膏(Zendium )中，用作抗菌添加劑。淀粉葡糖苷酶(AGO)是從淀粉生產(chǎn)葡萄糖的酶，它在溫度50-60°C有其最佳效果。 GO和AGO有時組合使用，以阻止GO在低溫下激活。當溶液達到體溫時，AGO將開始釋放葡 萄糖，同時GO產(chǎn)生過氧化氫。否則，必須使用兩腔室的系統(tǒng)，以避免酶(GO)與底物(葡萄 糖)的混合。鼻用的合適底物，例如可以是木糖醇(其本身有抗菌效應)，甘露醇(對某些中 耳炎病原體有粘附效應)，乳酸(天生存在的物質(zhì))，半乳糖，甘油(對鼻粘膜有益處)和葡 萄糖。這意味著下列產(chǎn)生過氧化氫的酶，適合在抗鼻病毒的鼻噴劑中用作藥物葡糖氧化 酶，木糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶。根據(jù)我們的試 驗室研究，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶，對人肺成纖維細胞(WI 38)是非常溫和的。在另一實施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶是與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧化酶。臨床研究顯示，在鼻粘膜的粘膜纖毛系統(tǒng)中，Ringer' s溶液比生理鹽溶液有更 有益的效果[9]。這可能顯示，Ringer' s溶液是鼻腔藥物制劑的優(yōu)選載體溶液。本發(fā)明現(xiàn)在將更緊密聯(lián)系實驗部分進行描述。下列說明的目的是表明由酶產(chǎn)生的 抑制性物質(zhì)——過氧化氫，可以失活引起感冒的鼻病毒。鼻病毒(屬于鼻病毒屬的病毒) 是感冒的起因媒介物。先前的研究顯示，有良好抑制活性的AHS可產(chǎn)生對應過氧化氫濃度約10mM(= 0. 03% )水平的過氧化氫。產(chǎn)生過氧化氫濃度約0. 05%的葡糖氧化酶濃度，應該因此足以 模擬具有極好抑制活性的體內(nèi)正常細菌菌群的效果。下列試驗顯示，低于20U/ml的GO濃 度對鼻病毒感染有作用，這相當于高于IOmM的過氧化氫濃度。實施例1和2中記載的實驗顯示，20U/ml的葡糖氧化酶濃度足以在WI 38細胞中， 不可逆地失活鼻病毒的細胞病變效應。該失活是在低于30分鐘的溫育時間內(nèi)完成的，這樣 在葡糖氧化酶經(jīng)過鼻和鼻咽期間、在其被咽下之前，將足以失活鼻病毒[10]。在第二個實施例中，即使葡糖氧化酶加入的時間晚于開始溫育之后2天，也可以預防鼻病毒進一步的細 胞感染，這可能暗示葡糖氧化酶鼻噴劑，即使在癥狀開始之后也可能具有感冒治療效應。第三個實施例表明，感冒癥狀的顯著減輕，在治療12小時后就已經(jīng)取得。本發(fā)明 人在最近三年在感冒期間使用鼻噴劑，使用方案幾乎通常相同在開始的12小時每隔2小 時，高頻率使用GO鼻噴劑之后，以低頻率使用(在接著的2-3天，每天2-4次)，感冒癥狀在 治療開始之后的12-24小時內(nèi)消失。其他志愿者也報道噴劑的相同效果。這些試驗性研究 顯示，GO以足夠的量長時間的存在，以失活位于鼻和鼻咽的RV。過氧化氫酶將過氧化氫迅速轉(zhuǎn)化為氧和水，因此用包含過氧化氫的鼻噴劑來起效 是不可行的，特別是鼻病毒通常位于鼻咽的腺體[5]。過氧化氫酶是催化H2O2轉(zhuǎn)化成O2和 H2O的特異性酶。該反應迅速進行。將來源于人紅細胞的純化過氧化氫酶(> 30000U/mg)， 用于本實驗。在模擬感冒的病毒試驗中，來自ATCC的兩種標準分離物被使用，即ATCC1117(= 鼻病毒7)和ATCC 1118(=鼻病毒8)。鼻病毒試驗中所用的細胞培養(yǎng)物，為來自于人胎兒 肺成纖維細胞的推薦WI 38細胞系，其與鼻病毒一起溫育時，其具有明顯的細胞病變效應 (CPE)。在用包含葡糖氧化酶的鼻噴劑進行的臨床研究中，GO在Ringer' s溶液中以 100U/ml濃度，與于等滲溶液中含有5% β-D葡萄糖的葡萄糖噴劑，一起使用。噴劑每次噴 射施放0. 1ml，在本試驗中，從各瓶中的各2次噴射作為一個劑量(1瓶G0，1瓶葡萄糖)。臨床試驗性研究提示，與包含5%葡萄糖溶液的鼻噴劑一起使用的、包含100U葡 糖氧化酶/ml的鼻噴劑，被良好耐受，而且顯示可縮短感冒發(fā)作的持續(xù)時間。GO鼻噴劑的結果迄今為止是非常有前景的，而且本發(fā)明人已經(jīng)得到了倫理委員會 和瑞典醫(yī)藥產(chǎn)品機構的許可，將開始進行隨機、安慰劑對照、雙盲試驗，以研究鼻噴劑縮短 感冒發(fā)作的可能性。
實施例實施例1下列實施例的目的是，顯示產(chǎn)生過氧化氫的酶——葡糖氧化酶，對引起感冒的鼻 病毒的效果。實驗1病毒鼻病毒7，購自ATCC (VR-1117)，其用于代表鼻病毒群。在本試驗中，使用10_2 和10_3的稀釋液。當與WI 38—起試驗時，該濃度應與IOOTCID5ci相聯(lián)系，并且在以前的稀 釋系列中，可產(chǎn)生出清晰、清楚的細胞病變效應(CPE)。將0.3ml各稀釋液加入至瓶中。細胞培養(yǎng)將人肺細胞成纖維細胞(WI 38，ATCC-CCL-75)，用于病變效應檢測。 10-倍系列的稀釋液，從濃縮的病毒懸液制備。0. ImlliT4-IO-5稀釋液，足以在2ml孔中5天 之內(nèi)，產(chǎn)生可見的細胞病變效應。10_3或更高的稀釋液，足以在接種5天后，破壞大多數(shù)的 細胞。將細胞首先培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI中，直到孔底部看到鋪平層。接著，將 培養(yǎng)基換為含有2%胎牛血清的RPMI，在試驗期間保存使用。將細胞在37°C、富CO2空氣中 溫育。在試驗期間，使用細胞培養(yǎng)物的第17-18代。過氧化氫酶來自Sigma-Aldrich 。100000U/ml溶液制備自106U/ml的原溶液。
5將0.01ml加至瓶中，可在瓶中獲得1000U/ml。H2O2 將20%的溶液稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS)，至0. 5%和0. 05%溶液。將 0，Iml加至瓶中，即在瓶中為0. 05%或0. 005% ο含有2. 5%葡萄糖的Rehydrex 每瓶使用0. 6ml作為葡糖氧化酶的底物。葡糖氧化酶(GO)來自Sigma-Aldrich ( )。200U/ml和600U/ml的溶液制備自 6000U/ml的原溶液。將0. Iml各稀釋液加至瓶中，可在瓶中獲得20U/ml或60U/ml葡糖氧化酶。為了評價過氧化氫的作用是否是對病毒本身的直接作用或者細胞保護效應，在病 毒被轉(zhuǎn)移至包含細胞的孔之前，我們將其與過氧化氫預先溫育。WI 38細胞也對過氧化氫敏 感，因此在接種至孔之前，有必要在其中添加過氧化氫酶。而且，通過添加過氧化氫酶失活 RV 7，顯示出該失活的速率。該設計也可揭示，抑制效應僅僅是病毒抑制效應，還是它能夠 不可逆地破壞病毒體。表1列出了 10瓶(Eppendorf)的各瓶內(nèi)含物質(zhì)。將各瓶溫育在加熱器中，保持穩(wěn) 定的37°C溫度。在溫育15，30和60min之后，加入1000U過氧化氫酶。將各瓶2x50 μ 1轉(zhuǎn) 移至雙份細胞孔(96-孔板)。在對照細胞孔中，我們使用了(雙份)細胞+RPMI，細胞+過 氧化氫酶，細胞+葡糖氧化酶，細胞+0. 05 % H2O2，細胞+rehydrex，過氧化氫酶+RV7。將細 胞每天檢測，持續(xù)5天，最終溫育到7天之后。表1.各瓶內(nèi)含物質(zhì)
權利要求
治療和/或預防鼻病毒所引起的疾病的方法，其中將有需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進行治療。
2.權利要求1的方法，其特征在于產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶木糖醇氧化 酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
3.權利要求1的方法，其特征在于產(chǎn)生過氧化氫的酶為與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧 化酶。
4.權利要求1-3任一項的方法，其特征在于所述疾病是感冒。
5.權利要求1-4任一項的方法，其特征在于將產(chǎn)生過氧化氫的酶在Ringer's溶液中 制備。
6.前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述藥物是水溶性的。
7.前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述藥物被制成鼻噴劑。
8.權利要求1-6任一項的方法，其特征在于所述藥物被制成鼻滴劑。
9.前述權利要求任一項的方法，其特征在于將酶的底物加至藥物中。
10.產(chǎn)生過氧化氫的酶在制備藥物中的應用，所述藥物用于權利要求1-9中任一項的 方法。
11.權利要求10的應用，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶，木糖醇氧化酶， 甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
12.權利要求10的應用，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶為與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧化酶。
13.用于權利要求1-9任一項方法的產(chǎn)生過氧化氫的酶。
14.權利要求13的產(chǎn)生過氧化氫的酶，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶木 糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療和/或預防鼻病毒引起的感冒的方法，其中將有需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進行治療。
文檔編號A61K38/44GK101977625SQ200980110037
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權日2008年3月20日
發(fā)明者克里斯特·坦諾 申請人:克里斯特·坦諾