專利名稱:A型肉毒桿菌毒素中和組合物及人抗a型肉毒桿菌毒素抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及對(duì)于A型肉毒桿菌毒素具有結(jié)合活性且具有完全人可變區(qū)的基因重 組抗體、編碼該抗體的核酸分子、生產(chǎn)該抗體的轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的抗體制備方法以及 使用該抗體的A型肉毒桿菌毒素中和組合物等。
背景技術(shù):
肉毒桿菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生的毒素根據(jù)血清型的不同分類為A型 G型。A、B、E、F型毒素對(duì)人健康有重大影響。在人的肉毒桿菌中毒疾病中,有“食物性肉毒 桿菌病(肉毒桿菌食物中毒)”、“嬰兒肉毒桿菌病”、“創(chuàng)傷型肉毒桿菌病”和“感染型肉毒 桿菌病”4種。A型毒素與肉毒桿菌食物中毒的26%有關(guān)。A型毒素與肉毒桿菌食物中毒的 26%有關(guān)。B和E型次之,F(xiàn)型毒素與肉毒桿菌食物中毒的相關(guān)比例比較低。另外,有報(bào)告 創(chuàng)傷型肉毒桿菌中毒只由A型或B型毒素引起(非專利文獻(xiàn)1)。成人的肉毒桿菌食物中毒通常為,菌或芽孢在食品中增殖,結(jié)果產(chǎn)生的毒素經(jīng)口 攝取而發(fā)病,另一方面,在新生兒肉毒桿菌病中,在蜂蜜等的食品中存在的菌或芽孢經(jīng)口攝 取,結(jié)果菌在腸管發(fā)育、增殖,并產(chǎn)生毒素,由此引起中毒癥狀。食物中毒的原因毒素根據(jù)國(guó) 家的不同而異,但有報(bào)告A型、B型和E型引起的病例。另外,嬰兒肉毒桿菌病的一大半是A 型、B型,但也有報(bào)告C. butiricum引起的E型毒素、引起的F型毒素。肉毒桿菌毒素是重鏈和輕鏈S-S鍵合(二硫鍵)的結(jié)構(gòu)的分子。肉毒桿菌毒素阻 滯向肌肉的神經(jīng)傳遞,由此引起弛緩性麻痹。如果肉毒桿菌毒素進(jìn)入氣道、呼吸肌,則引起 致死性的呼吸障礙。肉毒桿菌中毒導(dǎo)致的死亡率為12%,在特定的危險(xiǎn)人群中,死亡率更高 (非專利文獻(xiàn)3)。另一方面,由于肉毒桿菌毒素作為生物學(xué)毒素是致死性最高的毒素(純化 的A型毒素對(duì)70kg的人的致死量為,靜注或肌肉注射時(shí)為0. 09-1. 5μ g,在吸入時(shí)為 0. 70-0. 90µ ;g,經(jīng) 口時(shí)為 70 μ g (JAMA. 2001Feb28 ;285 (8) 1059-70),因此除 了通常 的中毒以外,具備用于生物恐怖的特殊性,在社會(huì)上也受到廣泛關(guān)注。作為對(duì)于肉毒桿菌毒素的中和劑,在日本得到批準(zhǔn)的物質(zhì)是以馬血清為原材料的 制劑。該制劑為源自馬血清的球蛋白,即由于對(duì)人是以異種蛋白作為主成分,因此存在引起 過敏反應(yīng)等的免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)性。另外,還存在未知病毒感染、血清病的問題。而且,也難 以穩(wěn)定地供給。進(jìn)而,該制劑的制備需要1年以上,因此存在難以應(yīng)對(duì)生物恐怖等非常時(shí)期 的情況。此外,由于馬的飼養(yǎng)管理存在問題,因此該制劑不適用于儲(chǔ)備目的。對(duì)于嬰兒肉毒桿菌病,為了避免過敏反應(yīng)等的嚴(yán)重的副作用,現(xiàn)實(shí)情況是不進(jìn)行 利用該馬球蛋白制劑的治療。在美國(guó),利用由使健康人對(duì)肉毒桿菌類毒素免疫而得到的中 和抗體效價(jià)高的血漿調(diào)制的人球蛋白制劑,進(jìn)行對(duì)于嬰兒肉毒桿菌病的特異性治療。實(shí)際 上,“BabyBIG”的商品名下,以嬰兒肉毒桿菌病為對(duì)象的藥品在美國(guó)FDA是作為罕用藥而批 準(zhǔn)制造許可的。但是,該方法除了倫理上的問題以外,還存在得到原材料、生物危害的問題,而且從確保安全性的觀點(diǎn)考慮,有在制造時(shí)必須進(jìn)行各種病毒檢查這樣的問題等。另外,在 日本,該制劑未得到批準(zhǔn),不能使用。有報(bào)告成功制作對(duì)于A型毒素的重組中和嵌合體抗體(專利文獻(xiàn)1).但是,在使 用該抗體時(shí),必須解決HACA(人抗嵌合體抗體)出現(xiàn)的問題、過敏反應(yīng)等的問題。另一方面,在美國(guó),特別是從具備生物恐怖威脅的角度考慮而進(jìn)行毒素中和的研 究開發(fā),嘗試由對(duì)肉毒桿菌毒素五聚物免疫的人的B淋巴細(xì)胞制作噬菌體抗體文庫,由其 中選擇期望的完全人中和抗體的方法。但是,對(duì)于A型病毒,沒有成功取得單獨(dú)發(fā)揮充分的 中和活性的抗體克隆。因此,通過在由噬菌體呈現(xiàn)篩選的結(jié)果得到的1種人抗體中,混合源 自XENO小鼠的克隆1種,進(jìn)而混合將通過小鼠免疫得到的小鼠抗體人化得到的抗體(寡克 隆化),從而必須使中和活性強(qiáng)化,尚未達(dá)到期望的目的,即通過完全人中和抗體引起的毒 素中和(專利文獻(xiàn)2、3,非專利文獻(xiàn)4、5、6)。專利文獻(xiàn)1 日本特開2006-311857號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開第2005/016232號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)3 國(guó)際公開第2007/094754號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1 :H. Sugiyama, Microbiol. Rev. 44 :419,1980專利文獻(xiàn)2 :S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3 :45,1981非專利文獻(xiàn)3 :C. 0. Tacket et al.,Am. J. Med. 76 :794,1984非專利文獻(xiàn) 4 :P. Amersdorfer et al.,Infect. Immun. 65(9) :3743,1997非專利文獻(xiàn)5 :P. Amersdorfer et al.,Vaccine 20:1640,2002非專利文獻(xiàn)6 :Α· Nowakowski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 (17) 11346, 200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于以上的背景,提供中和A型肉毒桿菌毒素的有效的組合物,從而解決 以往技術(shù)中的各種問題(過敏反應(yīng),異種蛋白、病毒的混入等)。另外,鑒于在現(xiàn)有的重組抗 體的檢測(cè)法中難以客觀地評(píng)價(jià)中和活性的情況,本發(fā)明的課題還在于,作為其它方面,在提 供A型肉毒桿菌毒素中和組合物時(shí),通過適合于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)值表示中和活性。本發(fā)明人首先仿效現(xiàn)有技術(shù),構(gòu)建人噬菌體抗體文庫,嘗試分離特異性識(shí)別肉毒 桿菌毒素A的抗體克隆。在重復(fù)實(shí)施篩選時(shí),可知雖然通過每次篩選選擇多個(gè)抗體克隆,但 反復(fù)選擇表位相同的抗體。對(duì)于產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因進(jìn)行研究,結(jié)果認(rèn)為,存在抗原性極高的 表位,其引起表位的重疊。依據(jù)該假設(shè),將該表位封閉是用于有效地取得表位不同的抗體的 有效方法。因此,確立了以下的策略通過添加用多次篩選重復(fù)取得的抗體的片段,將抗原 性強(qiáng)的表位封閉(遮蔽)以后,使噬菌體抗體文庫與肉毒桿菌A型毒素反應(yīng)。通過依照該 策略再次實(shí)施篩選,成功取得表位不同的多個(gè)抗體克隆。對(duì)成功取得的各抗體的表位進(jìn)行 分析,結(jié)果根據(jù)表位的不同,分類為4種。即,判明成功取得與4個(gè)表位相關(guān)的特異性抗體 克隆。接著,依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(以日本藥局法在醫(yī)藥品各條記錄的生物學(xué)制劑醫(yī)藥品中記 載的“干燥肉毒桿菌馬抗毒素(干燥肉毒桿菌抗毒素)”項(xiàng)3. 2.7 “效價(jià)試驗(yàn)”為基準(zhǔn)),進(jìn) 行比較和評(píng)價(jià)將這些抗體3種或4種組合時(shí)的中和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),作為提供高中和活性的抗體克隆的組合,有3種抗體克隆的組合。另外,表明如果進(jìn)一步組合1種抗體克隆,則 中和活性提高。以上,本發(fā)明人成功取得多個(gè)對(duì)于A型肉毒桿菌毒素具有高中和活性的抗體克 隆,同時(shí)明確被該抗體識(shí)別的4種表位與中和活性的關(guān)系。本發(fā)明主要基于這些成果,如下 所示。[1]A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其含有識(shí)別具有由序列編號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)8的氨基酸 序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,識(shí)別具有由序列編號(hào)36的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)40的氨基 酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,和識(shí)別具有由序列編號(hào)44的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)48的氨基 酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位、或者具有由序列編號(hào)52的氨基酸序列構(gòu)成的重 鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)56的基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第3人抗A型肉 毒桿菌毒素抗體。[2]根據(jù)[1]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是下述(4)或(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(6) ⑶中任一種的抗體(1)具有由序列編號(hào)1的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)2的氨 基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)3的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、 由序列編號(hào)5的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)7的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(2)具有由序列編號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)10的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)11的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)13的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)14的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)15的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(3)具有由序列編號(hào)17的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)18的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)19的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)21的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)22的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)23的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(4)具有由序列編號(hào)25的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)26的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)27的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)29的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)30的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)31的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(5)具有由序列編號(hào)33的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)34的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)35的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)37的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)38的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)39的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(6)具有由序列編號(hào)41的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)42的
7氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)43的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)45的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)46的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)47的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(7)具有由序列編號(hào)49的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)50的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)51的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)53的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)54的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)55的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(8)具有由序列編號(hào)57的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)58的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)59的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)61的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)62的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)63的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體。[3]根據(jù)[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自所述⑴ ⑶中任一種的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(4)或(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體,進(jìn)一步含有所述(7)或(8)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[4]根據(jù)[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體。[5]根據(jù)[4]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,進(jìn)一步含有所述(7)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[6]根據(jù)[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(7)的抗體。[7]根據(jù)[6]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,進(jìn)一步含有所述(4)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[8]根據(jù)[2] [7]任一項(xiàng)所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,所述(1)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)4的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)8的氨基酸序列,所述(2)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)12的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)16的氨基酸序列,所述(3)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)20的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)24的氨基酸序列,所述(4)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)28的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)32的氨基酸序列,所述(5)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)36的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)40的氨基酸序列,
所述(6)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)44的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)48的氨基酸序列,所述(7)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)52的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)56的氨基酸序列,所述(8)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)60的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)64的氨基酸序列。[9] 一種分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,其包含[2]規(guī)定的(1) (8)中任一 種的抗體。[10]根據(jù)[9]所述的分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,其中,所述(1)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)4的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)8的氨基酸序列,所述(2)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)12的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)16的氨基酸序列,所述(3)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)20的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)24的氨基酸序列,所述(4)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)28的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)32的氨基酸序列,所述(5)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)36的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)40的氨基酸序列,所述(6)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)44的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)48的氨基酸序列,所述(7)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)52的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)56的氨基酸序列,所述(8)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)60的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序 列編號(hào)64的氨基酸序列。[11] 一種分離的核酸分子,編碼[10]所述的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。[12] 一種載體,保持[11]所述的核酸分子。[13] 一種轉(zhuǎn)化體,用[12]所述的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的。[14] 一種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的制備方法,其包含培養(yǎng)[13]所述的轉(zhuǎn)化體,生產(chǎn)人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序,回收培養(yǎng)上清液,由培養(yǎng)上清液純化人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序。(用語)為了方便說明,對(duì)于用于本說明書的用語的一部分,總結(jié)其定義如下所示。在本說明書中,用語“包含 ”或“包含 而成”用作也包括“由 構(gòu)成”的意思的 表達(dá)。因此,例如在記載“含有多個(gè)要素(構(gòu)件)而構(gòu)成的物質(zhì)(或者方法)”時(shí),作為其意 思,也當(dāng)然可考慮為“由該多個(gè)要素(構(gòu)件)構(gòu)成的物質(zhì)(或者方法)”?!胺蛛x”的意思是指,由其本來的環(huán)境(例如,為天然物質(zhì)時(shí)是天然的環(huán)境)取出的 狀態(tài),即,通過人為的操作,以與本來的存在狀態(tài)不同的狀體存在。
“分離的抗體”中不包括天然且未實(shí)施任何另外操作(人為操作)的抗體,即,不包 括在某個(gè)個(gè)體體內(nèi)產(chǎn)生,在其中停留狀態(tài)的抗體。應(yīng)予說明,分離的抗體典型的是不與其它 種類的抗體混合存在的狀態(tài),即,單獨(dú)(作為同種抗體的集合)存在。對(duì)于“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)”,依據(jù) kabat 等(參照 Sequences of Proteinsof Immunological Interest,4th edition US Department of Health andHuman Services (1987))的定義?!唉⌒腿舛緱U菌毒素中和組合物”是指,含有多種抗體作為有效成分,對(duì)于A型肉毒 桿菌毒素表現(xiàn)出中和活性的藥學(xué)上的混合物。本發(fā)明中的“抗毒素效價(jià)”只要沒有特別提及,以國(guó)際單位表示?!翱苟舅匦r(jià)” 依據(jù)日本藥局法在醫(yī)藥品各條記錄的生物學(xué)制劑醫(yī)藥品中記載的“干燥肉毒桿菌馬抗毒素 (干燥肉毒桿菌抗毒素)”項(xiàng)3. 2. 7 “效價(jià)試驗(yàn)”確定。在本說明書中,根據(jù)需要,依據(jù)習(xí)慣使用以下簡(jiǎn)寫(括號(hào)內(nèi))。重鏈(H鏈),輕鏈(L鏈),重鏈可變區(qū)(VH),輕鏈可變區(qū)(VL),互補(bǔ)決定區(qū) (CDR),互補(bǔ)決定區(qū)1(⑶R1),互補(bǔ)決定區(qū)2(⑶R2),互補(bǔ)決定區(qū)3(⑶R3),重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 1(VH CDR1),重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(VH CDR2),重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 (VH CDR3),輕鏈互補(bǔ)決定區(qū) 1 (VIXDRl),輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 (VL⑶R2),輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 (VL⑶R3)
圖1 抗體文庫的構(gòu)成。圖2 在篩選實(shí)驗(yàn)1取得的抗體的結(jié)合活性。將在對(duì)于無毒成分蛋白質(zhì)的ELISA中 表現(xiàn)出ABS492 < 0. 2的克隆作為陽性克隆(箭頭)。圖3:以在篩選實(shí)驗(yàn)1取得的抗體為樣本的中和試驗(yàn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。表中 的符號(hào)(+、_等)表示癥狀的強(qiáng)度。按士、+、++的順序癥狀增強(qiáng)。圖4 在篩選試驗(yàn)2采用的、表位遮蔽法的概要。圖5 在篩選實(shí)驗(yàn)2取得的抗體的結(jié)合活性(圖5下(4th))和在篩選實(shí)驗(yàn)3取得 的抗體的結(jié)合活性(圖5上(3rd-2))。圖6 在篩選試驗(yàn)3取得的抗體的氨基酸序列的比對(duì)。由上方開始依次為BT-058 的VH序列(序列編號(hào)20)、BT-047的VH序列(序列編號(hào)12)、BT-015的VH序列序列編號(hào) 4)、BT-058的VL序歹Ij (序列編號(hào)24)、BT-047的VL序列(序列編號(hào)16)、BT-015的VL序 列(序列編號(hào)8)。圖7 在篩選實(shí)驗(yàn)4取得的抗體的結(jié)合活性。將在此所示的全部的抗體克隆作為 陽性克隆。圖8 以在篩選實(shí)驗(yàn)4取得的抗體為樣本的中和試驗(yàn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。表中 的符號(hào)(+、++等)表示癥狀的強(qiáng)度。按++、+++的順序癥狀增強(qiáng)。d表示“小鼠死亡”。圖9 使用肉毒桿菌類毒素的篩選過程。圖10 在篩選實(shí)驗(yàn)5取得的抗體的結(jié)合活性。圖11 在篩選實(shí)驗(yàn)5取得的抗體的結(jié)合活性。圖12 在篩選實(shí)驗(yàn)6取得的抗體的結(jié)合活性。圖13 在篩選實(shí)驗(yàn)6取得的抗體的結(jié)合活性。
10
圖14:以在篩選實(shí)驗(yàn)5和6取得的抗體為樣本的中和試驗(yàn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。 表中的符號(hào)(+、++等)表示癥狀的強(qiáng)度。按士、+、++、+++的順序癥狀增強(qiáng)。d表示“小鼠
死亡”。圖15 使用神經(jīng)毒素的篩選過程(神經(jīng)毒素特異性抗體的濃縮)。圖16 在篩選實(shí)驗(yàn)1 6取得的抗體的氨基酸序列的比對(duì)。由上方開始依次為 BT-175的VH序列(序列編號(hào)36)、NT_221的VH序列(序列編號(hào)28)、NT_320的VH序列(序 列編號(hào)44)、NT-539的VH序列(序列編號(hào)60) ,BT-015的VH序列(序列編號(hào)4)、NT_523的 VH序列(序列編號(hào)52)、NT-320的VL序列(序列編號(hào)48)、NT-539的VL序列(序列編號(hào) 64)、NT-221的VL序列(序列編號(hào)32)、BT_175的VL序列(序列編號(hào)40) ,BT-015的VL序 列(序列編號(hào)8)、NT-523的VL序列(序列編號(hào)56)。應(yīng)予說明,與種系(Germline)的同 源性也一并表示。圖17 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為BT-015的Fab-PP型抗體)。圖18 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為BT-015的IgG型抗體)。圖19 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為BT-175的Fab-PP型抗體)。圖20 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為BT-175的IgG型抗體)。圖21 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為NT-221的Fab-PP型抗體)。圖22 利用Biacorel的結(jié)合常數(shù)分析的結(jié)果(樣品為NT-320的Fab-PP型抗體)。圖23 利用Biacorel的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(與BT-015的競(jìng)爭(zhēng))。表示BT-015與 NT-221 競(jìng)爭(zhēng)。圖24:利用Biacorel的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(與BT-175的競(jìng)爭(zhēng))。表示BT-175與 NT-221 競(jìng)爭(zhēng)。圖25:利用Biacorel的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(與NT-221的競(jìng)爭(zhēng))。由于NT-539在 250秒附近發(fā)生強(qiáng)噪音,因此刪除該區(qū)域。圖26 利用Biacorel的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(與NT-320的競(jìng)爭(zhēng))。圖27:利用Biacorel的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(與NT-523的競(jìng)爭(zhēng))。表示NT-523與 NT-539 競(jìng)爭(zhēng)。圖 28 以 5 種抗體克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)為樣品的中和 試驗(yàn)的結(jié)果。表中的符號(hào)(+、++等)表示癥狀的強(qiáng)度。按+、++、+++的順序癥狀增強(qiáng)。-表 示“未發(fā)現(xiàn)癥狀”,d表示“小鼠死亡”。圖29 利用ELISA的抗體的表位分析和對(duì)于毒素亞型 A2毒素的反應(yīng)性。更詳細(xì)地分析6種中和抗體(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、 NT-539)的表位,另外,同時(shí)為了還確認(rèn)對(duì)于作為其亞型的A2型的神經(jīng)毒素(CHIBA-H)的反 應(yīng)性,使用下述抗原實(shí)施ELISA。每個(gè)克隆以表形式表示0D492nm處的值。圖30 利用免疫印跡法的表位分析。對(duì)于神經(jīng)毒素(NT)和重鏈C末端側(cè)的神經(jīng) 細(xì)胞結(jié)合區(qū)域(He,大腸桿菌重組體蛋白質(zhì)),利用免疫印跡法進(jìn)行表位分析,示出其結(jié)果。 對(duì)于各抗體克隆,稀釋到2種濃度(50 μ g/ml (實(shí)線的泳道)、5 μ g/ml (虛線的泳道)),使 其反應(yīng)。確認(rèn)NT-523為Hc區(qū)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)。另一方面,在該實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于其它抗體未檢出 條帶。圖31 利用免疫沉淀的表位分析。使用3種抗原(神經(jīng)毒素、H鏈、L鏈)進(jìn)行各克 隆的免疫沉淀,進(jìn)行表位分析的結(jié)果。對(duì)照為直接將H鏈、L鏈進(jìn)行上層電泳,使其與親和 純化的兔抗A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素抗體(稀釋1000倍)反應(yīng)。BT-015、NT-523、NT-539識(shí)
11別H鏈(實(shí)線圓)、BT_175識(shí)別L鏈的可能性高(虛線圓)。另一方面,由該實(shí)驗(yàn)不能判斷 NT-221、NT-320識(shí)別H鏈和L鏈中的哪一個(gè)。圖32 總結(jié)表位分析的結(jié)果,分類6種抗體的表位的表。綜合地判斷表位分析的 結(jié)果,在表的最下端總結(jié)抗體表位候補(bǔ)。應(yīng)予說明,對(duì)于各克隆的結(jié)合性(表位候補(bǔ)),與神 經(jīng)毒素具有結(jié)合性時(shí)用NT表示,具有H鏈結(jié)合性時(shí)用H表示,與H鏈C末端側(cè)的神經(jīng)細(xì)胞 結(jié)合區(qū)域具有結(jié)合性時(shí)用Hc表示,與L鏈具有結(jié)合性時(shí)用L表示。(-)表示不能判斷。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的第一方面涉及A型肉毒桿菌毒素中和組合物(以下,也稱為“本發(fā)明的組 合物”)。在本發(fā)明的組合物中,至少使用3種抗體。該3種抗體都是識(shí)別A型肉毒桿菌毒 素的人抗體。在本說明書中,該3種抗體稱為“第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體”、“第2人 抗A型肉毒桿菌毒素抗體”、“第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體”。此外,為了方便說明,以下 將“第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體”簡(jiǎn)稱為“第1抗體”,將“第2人抗A型肉毒桿菌毒素 抗體”簡(jiǎn)稱為“第2抗體”,將“第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體”簡(jiǎn)稱為“第3抗體”。本發(fā)明人成功取得有效中和A型肉毒桿菌毒素的人抗體克隆(BT-015、BT-047、 BT-058、NT-221、BT-175、NT-320、NT-523、NT-539)(參照實(shí)施例欄)。另外,成功取得的抗 體克隆基于表位的異同,示出分類為4種。第1抗體為,對(duì)應(yīng)于如果與其它抗體克隆組合使 用則表現(xiàn)出有效中和A型肉毒桿菌毒素的抗體克隆BT-015的抗體,抗體克隆BT-015的特 征在于,即識(shí)別“具有由序列編號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)8的氨基 酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體”的表位。由于第1抗體的表位與抗體克隆BT-015的表位 一致,因此如果使第1抗體和抗體克隆BT-015同時(shí)與A型肉毒桿菌毒素反應(yīng),則發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)。 因此,作為第1抗體的適認(rèn)性可以通過利用抗體克隆BT-015的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。第2抗體為,對(duì)應(yīng)于如果與其它抗體克隆組合使用則表現(xiàn)出有效中和A型肉毒桿 菌毒素的抗體克隆BT-175的抗體,抗體克隆BT-175的特征在于,即識(shí)別“具有由序列編號(hào) 36的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)40的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗 體”的表位。應(yīng)予說明,對(duì)于作為第2抗體的適認(rèn)性,可以與第1抗體的情況同樣地進(jìn)行確 認(rèn)。第3抗體為,對(duì)應(yīng)于如果與抗體克隆BT-015和抗體克隆BT-175組合使用則表現(xiàn) 出有效中和A型肉毒桿菌毒素的抗體克隆(NT-320或NT-523)的抗體,抗體克隆NT-320的 特征在于,即識(shí)別“具有由序列編號(hào)44的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)48的 氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體”的表位,另外,抗體克隆NT-523的特征在于,即識(shí)別 “具有由序列編號(hào)52的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)56的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈可變區(qū)的抗體”的表位。應(yīng)予說明,對(duì)于作為第3抗體的適認(rèn)性,可以與第1抗體的 情況同樣地進(jìn)行確認(rèn)。在本發(fā)明的一個(gè)方式中,第1抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體。第2 抗體是下述⑷或(5)的抗體。第3抗體是選自下述(6) ⑶中任一種的抗體。(1)具有由序列編號(hào)1的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)2的氨 基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)3的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、 由序列編號(hào)5的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕
12鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)7的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(2)具有由序列編號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)10的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)11的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)13的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)14的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)15的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(3)具有由序列編號(hào)17的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)18的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)19的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)21的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)22的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)23的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(4)具有由序列編號(hào)25的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)26的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)27的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)29的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)30的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)31的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(5)具有由序列編號(hào)33的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)34的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)35的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)37的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)38的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)39的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(6)具有由序列編號(hào)41的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)42的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)43的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)45的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)46的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)47的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(7)具有由序列編號(hào)49的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)50的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)51的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)53的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)54的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)55的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(8)具有由序列編號(hào)57的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)58的 氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)59的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3、由序列編號(hào)61的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)62的氨基酸序列構(gòu)成 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)63的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體(1)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆BT-015,(2)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆BT-047,(3)對(duì)應(yīng)于人抗體 克隆BT-058,(4)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆NT-221,(5)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆BT-175,(6)對(duì)應(yīng)于人 抗體克隆NT-320,(7)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆NT-523,(8)對(duì)應(yīng)于人抗體克隆NT-539。以下,表 示各克隆的序列信息。(BT-015)VH CDRl 序列編號(hào) 1VH CDR2 序列編號(hào) 2VH CDR3 序列編號(hào) 3VH:序列編號(hào)4VL CDRl 序列編號(hào) 5
(NT-320)VH CDRl 序列編號(hào) 41VH CDR2 序列編號(hào) 42VH CDR3 序列編號(hào) 43VH:序列編號(hào)44VL CDRl 序列編號(hào) 45VL CDR2 序列編號(hào) 46VL CDR3 序列編號(hào) 47VL:序列編號(hào)48(NT-523)VH CDRl 序列編號(hào) 49VH CDR2 序列編號(hào) 50VH CDR3 序列編號(hào) 51VH:序列編號(hào)52VL CDRl 序列編號(hào) 53VL CDR2 序列編號(hào) 54VL CDR3 序列編號(hào) 55VL:序列編號(hào)56(NT-539)VH CDRl 序列編號(hào) 57VH CDR2 序列編號(hào) 58VH CDR3 序列編號(hào) 59VH:序列編號(hào)60VL CDRl 序列編號(hào) 61VL CDR2 序列編號(hào) 62VL CDR3 序列編號(hào) 63VL 序列編號(hào)64在優(yōu)選的一個(gè)方案中,(1)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)4的氨基酸序列,輕 鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)8的氨基酸序列。對(duì)于(2)的抗體,重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)12的 氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)16的氨基酸序列。對(duì)于(3)的抗體,重鏈可變區(qū)具 有序列編號(hào)20的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)24的氨基酸序列。對(duì)于(4)的抗 體,重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)28的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)32的氨基酸序 列。對(duì)于(5)的抗體,重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)36的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)40的氨基酸序列。對(duì)于(6)的抗體,重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)44的氨基酸序列,輕鏈可 變區(qū)具有序列編號(hào)48的氨基酸序列。對(duì)于(7)的抗體,重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)52的氨 基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)56的氨基酸序列。對(duì)于(8)的抗體,重鏈可變區(qū)具有 序列編號(hào)60的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)64的氨基酸序列。各抗體的來源、種類、級(jí)別、形態(tài)等沒有限定。優(yōu)選的是,作為完全人IgG抗體而調(diào) 制各抗體。此時(shí),規(guī)定區(qū)域的種類沒有特別限定。即,重鏈不限定于 鏈,還可以是μ鏈、α鏈或ε鏈。同樣地,輕鏈可以是κ鏈,也可以是λ鏈??梢哉{(diào)制各抗體作為?313、?313,、?(313,)2、80 ¥或(18 ¥抗體等的抗體片段。Fab 是通過將IgG抗體在半胱氨酸存在下進(jìn)行木瓜蛋白酶消化而得到的,由L鏈和H鏈可變區(qū) 以及由CHl區(qū)和鉸鏈部的一部分構(gòu)成的H鏈片段構(gòu)成的分子量約5萬的片段。如果有期望 的IgG抗體,可以通過將其進(jìn)行木瓜蛋白酶消化得到Fab。另外,還可以將編碼H鏈的一部 分和L鏈的DNA重組入適當(dāng)?shù)妮d體,使用該載體通過轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體調(diào)制Fab。Fab'是通過將后述的F(ab’)2的H鏈間的二硫鍵切斷而得到的分子量約為5萬 的片段。如果有期望的IgG抗體,可以通過將其進(jìn)行胃蛋白酶消化,使用還原劑切斷二硫鍵 而得到Fab,。另外,與Fab相同地,還可以使用編碼Fab’的DNA進(jìn)行基因工程上的調(diào)制。F(ab' )2是將IgG抗體進(jìn)行胃蛋白酶消化而得到的,由L鏈和H鏈可變區(qū)以及由 CHl區(qū)和鉸鏈部的一部分構(gòu)成的H鏈片段構(gòu)成的片段(Fab’ )以二硫鍵結(jié)合的分子量約10 萬的片段。如果有期望的IgG抗體,可以通過將其進(jìn)行胃蛋白酶消化得到F(ab’)2。另外, 與Fab相同地,還可以使用編碼F(ab,)2的DNA進(jìn)行基因工程上的調(diào)制。scFv是將由H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)構(gòu)成的Fv通過將一方的鏈的C末端與另一 方的N末端以適當(dāng)?shù)倪B接肽連接而單鏈化的抗體片段。作為連接肽,例如可以使用柔軟性 高的(GGGGS) 3等。例如,可以使用編碼H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的DNA和編碼連接肽的DNA 構(gòu)建編碼scFv抗體的DNA,將其重組入適當(dāng)?shù)妮d體,使用該載體通過轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體調(diào)制 scFv。dsFv是在H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的適當(dāng)位置引入Cys殘基,通過二硫鍵使H鏈 可變區(qū)和L鏈可變區(qū)穩(wěn)定化的Fv片段。在各鏈中的Cys殘基的導(dǎo)入位置可以基于利用分 子模型預(yù)測(cè)的立體結(jié)構(gòu)而確定。例如,可以由H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列預(yù)測(cè) 立體結(jié)構(gòu),基于所述立體結(jié)構(gòu),構(gòu)建分別編碼導(dǎo)入了變異的H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的DNA, 將其重組入適當(dāng)?shù)妮d體,并且使用該載體通過轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體調(diào)制dsFv。其中,在本發(fā)明的組合物中,作為優(yōu)選的抗體組合,可以列舉以下的組合。該組合 對(duì)應(yīng)于在后述的實(shí)施例所示的中和試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非常高的中和活性的組合。第1抗體⑴的抗體第2抗體(5)的抗體第3抗體(6)的抗體在采用上述組合時(shí),優(yōu)選并用(7)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體(第 4抗體)。這樣得到的4種抗體的組合對(duì)應(yīng)于在后述的實(shí)施例所示的中和試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最高 的中和活性的抗體的組合。優(yōu)選的抗體組合的其它例子如下所示。該組合對(duì)應(yīng)于在后述的實(shí)施例所示的中和 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非常高的中和活性的組合。第1抗體⑴的抗體第2抗體(5)的抗體第3抗體(7)的抗體應(yīng)予說明,在有效成分的抗體限于3種時(shí),在A型毒素中,對(duì)于其亞種的A2毒素, 優(yōu)選使用保持比(7)更強(qiáng)的結(jié)合性的(8)抗體作為上述第3抗體。在采用上述組合時(shí),優(yōu)選并用(4)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體(第4抗體)。并用4種抗體時(shí)的組合不限于上述的兩個(gè)例子。以下,表示并用4種抗體時(shí)的優(yōu) 選的組合。第1抗體選自(1) (3)中任一種的抗體第2抗體⑷或(5)的抗體第3抗體(6)的抗體第4抗體(7)或(8)的抗體(1) ⑶的抗體用作對(duì)于A型肉毒桿菌毒素表現(xiàn)出高中和活性的組合物的有效 成分,其自身具有高效價(jià)。因此,作為本發(fā)明的第2方面,提供包含(1) (8)任一項(xiàng)的抗 體的A型肉毒桿菌毒素中和抗體。另外,作為本發(fā)明的第3方面,提供編碼該抗體的重鏈可 變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的、分離的核酸分子。以下,示出對(duì)應(yīng)于⑴ ⑶的抗體克隆的堿 基序列(重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū))。(BT-015)VH 序列編號(hào)65VL 序列編號(hào)66(BT-047)VH:序列編號(hào)67VL 序列編號(hào)68(BT-058)VH 序列編號(hào)69VL 序列編號(hào)70(NT-221)VH 序列編號(hào)71VL 序列編號(hào)72(BT-175)VH 序列編號(hào)73VL:序列編號(hào)74(NT-320)VH 序列編號(hào)75VL 序列編號(hào)76(NT-523)VH 序列編號(hào)77VL 序列編號(hào)78(NT-539)VH 序列編號(hào)79VL 序列編號(hào)80應(yīng)予說明,即使對(duì)于作為A型的亞種的A2毒素,上述各(1) (8)的抗體也可以 保持強(qiáng)結(jié)合性,形成表現(xiàn)出強(qiáng)中和活性的組合物的有效成分。本發(fā)明的抗體((1) (8)的抗體)可以以基因工程的方法以各抗體克隆序列信
17息為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)制。即,典型的是,可以通過一系列工序調(diào)制本發(fā)明的抗體,該一系列工序 包括編碼目的抗體的基因表達(dá)構(gòu)建物的調(diào)制、利用適當(dāng)表達(dá)體系的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的回 收。表達(dá)體系沒有特別限定。即,只要使目的重組抗體得到表達(dá),可以使用任意的表達(dá) 體系。其中,使IgG型的重組抗體表達(dá)時(shí),可以使用利用動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)體系。另外,使源 自可變區(qū)的Fab、Fab,、F(ab,)2、scFv或dsFv等的抗體片段表達(dá)時(shí),除了動(dòng)物細(xì)胞之外,還 可以使用利用大腸桿菌、酵母等微生物的表達(dá)體系。根據(jù)使用的宿主,可以使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá) 載體。如果利用信號(hào)肽,可以使目的重組抗體分泌到細(xì)胞外,輸送至周質(zhì)區(qū)域,或在細(xì)胞內(nèi) 儲(chǔ)留。以下,對(duì)于最一般的利用動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)方法,進(jìn)行詳細(xì)敘述。首先,將編碼目的 抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的DNA通過化學(xué)合成、生化切斷/再結(jié)合等進(jìn)行制作。將得到的編 碼H鏈可變區(qū)的DNA與編碼人H鏈規(guī)定區(qū)域的DNA進(jìn)行連接,重組入表達(dá)用載體,得到H鏈 表達(dá)載體。用同樣的方法制作L鏈表達(dá)載體。應(yīng)予說明,在夾著CDR區(qū)域而存在的FR(框 架區(qū)域)中,還可以使用導(dǎo)入了若干變異的可變區(qū)。即,由于CDR區(qū)域全部相同的抗體識(shí)別 相同的表位,因此最終得到的抗體識(shí)別A型肉毒桿菌毒素,只要表現(xiàn)出充分的結(jié)合活性,可 以改變FR。其中,如果氨基酸序列明確,則可以預(yù)測(cè)可變區(qū)的立體結(jié)構(gòu)(空間配置),還 可以預(yù)測(cè)對(duì)FR施加特定的改變引起的立體結(jié)構(gòu)的變化。另外,還可以利用計(jì)算機(jī)程序 ENCAD (Energy Calculation and Dynamics),構(gòu)建可變區(qū)的分子模型,或者可以確定為了與 ⑶R潛在地相互作用而充分接近的、FR中的氨基酸等(例如,參照W097/002290)。另外,還 可以利用定量地評(píng)價(jià)各氨基酸殘基是否處于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中的計(jì)算機(jī)程序Verify-3D、免疫 球蛋白專用的模型方法(WAM-ffeb Antibody Modeling 或 OxfordMoleclelar 公司的 AbM) 等??勺儏^(qū)的變異的最優(yōu)化可以通過利用隨機(jī)PCR、噬菌體呈現(xiàn)法等常規(guī)的操作進(jìn)行。(參 照 Manuel B, et al J. Biol ChemVo1. 272 no. 16 10678 "Antibody humaniζation using monovalent pagedisplay,,、W02007/094754 等)。所改變的氨基酸的數(shù)量?jī)?yōu)選為FR全體的15%以下,進(jìn)一步優(yōu)選為FR全體的10% 以下,進(jìn)一步更優(yōu)選為FR全體的5%以下,最優(yōu)選為FR全體的1 %以下。“表達(dá)載體”是指,可以將插入其的核酸導(dǎo)入目的細(xì)胞(目標(biāo)細(xì)胞)內(nèi),且在該細(xì)胞 內(nèi)使其表達(dá)的核酸性分子,包括病毒載體和非病毒載體。使用病毒載體的基因?qū)敕ㄇ擅?地利用病毒對(duì)細(xì)胞的感染現(xiàn)象,得到高基因?qū)胄?。作為病毒載體,可以示例SV40virUS based載體、EB virusbased載體、BPV(牛乳頭瘤病毒)based載體等,但不限定于這些。 作為非病毒載體,開發(fā)有脂質(zhì)體、正電荷型脂質(zhì)體(Feigner, P. L.,Gadek, T. R.,Holm, Μ. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. ,84 7413-7417,1987) 、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan) -月旨質(zhì)體(Dzau, V. J. , Mann, Μ. , Morishita, R. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93 :11421-11425,1996、Kaneda, Y. , Saeki, Y. Morishita, R. , Molecular Med. Today, 5 298-303,1999)等。表達(dá)載體還可以構(gòu)建為這樣的非病毒載體。作為在表達(dá)載體中所含的啟動(dòng)子,利用SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、巨細(xì) 胞病毒啟動(dòng)子、雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。準(zhǔn)備H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體后,使用它們對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。作為宿主
18細(xì)胞,優(yōu)選使用CHO細(xì)胞(中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞)(A. ffright&S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402 (1998))、SP2/0 細(xì)胞(小鼠骨髓瘤)(K. Motmans et al. ,Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-519(1996),R. P. Junghans et al.,Cancer Res. 50,1495-1502 (1990))等。在轉(zhuǎn)化中 優(yōu)選使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(R. W. Malone et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6077(1989), P. L. Feigner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413 (1987)、電穿孔法、磷酸鈣法 (F. L. Graham&A. J. van der Eb, Virology52,456-467 (1973)) > DEAE-Dextran 法等。對(duì)H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體的比例、導(dǎo)入的時(shí)機(jī)等沒有特別地限定。兩載體 的比例(H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體(摩爾比))例如為1 0.5 5,優(yōu)選為1 0.8 1.2。對(duì)于導(dǎo)入的時(shí)機(jī),可以將H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞,還可以首 先導(dǎo)入任一種。另外,如上所述,還可以不分別構(gòu)建H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體,而構(gòu)建 重組了編碼VH的DNA和編碼VL的DNA兩者的表達(dá)載體,用該表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn) 化。作為用于轉(zhuǎn)化體的選擇的標(biāo)記(選擇標(biāo)記),可以利用氨基糖苷-3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶 (neo)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因、嘌呤霉素耐性酶基因、谷氨酰胺合成酶(GS)基因 等一般的標(biāo)記基因(例如參照MichaelKriegler著、加藤郁之進(jìn)監(jiān)譯、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)動(dòng)物細(xì)胞 的基因工程、寶酒造(1994))。通過轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)液回收(分離、純化)抗體??贵w的回收依照常規(guī)方 法即可。即,利用離心分離、硫酸銨分級(jí)、鹽析、超濾、親和層析(使用蛋白質(zhì)A樹脂、蛋白質(zhì) G樹脂等)、離子交換層析、凝膠過濾層析等,回收抗體。如上得到的抗體用作本發(fā)明的組合物的有效成分。構(gòu)成本發(fā)明的組合物時(shí)的制劑 化依照常規(guī)方法即可。在制劑化時(shí),可以含有制劑上容許的其它成分(例如,載體、賦型劑、 崩解劑、緩沖劑、乳化劑、懸濁劑、去痛劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等)。作為賦型 劑,可以列舉水、生理食鹽水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、各種緩沖液(磷酸緩沖液、重 碳酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液等)、乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白 糖等。作為崩解劑,可以使用淀粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑,可以使用磷酸鹽、 檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為乳化劑,可以使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸濁劑, 可以使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷 基硫酸鈉等。作為去痛劑,可以使用芐醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作為穩(wěn)定劑,可以使用丙二 醇、亞硫酸二乙酯、抗壞血酸等。作為保存劑,可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、對(duì)羥 基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑,可以使用苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。進(jìn)行制劑化時(shí)的劑型也沒有特別限定,但優(yōu)選注射劑、外用劑或栓劑等有即效性 的制劑處方。作為有效成分的各抗體的混合比沒有特別限定,但典型的是,使各抗體的存在量 相同(每種等摩爾混合)。應(yīng)予說明,對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說,通過與后述的實(shí)施例所示 的中和試驗(yàn)相同的試驗(yàn),可以使混合比最優(yōu)化。另外,各抗體的級(jí)別或形態(tài)等是任意的。因此,本發(fā)明的組合物可以以不同級(jí)別的 抗體混合的狀態(tài),或者不同形態(tài)的抗體混合的狀態(tài)而構(gòu)成。優(yōu)選本發(fā)明的組合物中的抗體濃度在參考最終的給藥形態(tài)和給藥方案后,反向計(jì) 算而確定。
本發(fā)明的組合物的狀態(tài)也沒有特別限定。例如,將本發(fā)明的組合物調(diào)制為液狀或 干燥狀態(tài)(優(yōu)選凍干狀態(tài))。例如,在凍干時(shí),可以在調(diào)整濃度后進(jìn)行凍干,以使在用溶劑溶 解后的最終ImL中作為有效成分的抗毒素效價(jià)為500單位以上。應(yīng)予說明,依照在日本藥局 法醫(yī)藥品各條記錄的生物學(xué)制劑醫(yī)藥品中記載的“干燥肉毒桿菌馬抗毒素(干燥肉毒桿菌 毒素)”的項(xiàng)5. 2 “小容器的含有單位數(shù)”,優(yōu)選使小容器的含有單位數(shù)為抗毒素效價(jià)10000 單位以上。本發(fā)明的組合物典型的是用于肉毒桿菌中毒疾病的治療和預(yù)防。本發(fā)明的組合物 根據(jù)其形態(tài),通過口服給藥或非口服給藥(靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌肉、腹腔內(nèi)注射、直接 導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞等)用于對(duì)象(患者)。本發(fā)明的組合物的給藥量根據(jù)癥狀、患者年齡、性別以及體重等而異,但本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以設(shè)定適宜的適當(dāng)給藥量。例如,以成人(體重約60kg)為對(duì)象可以進(jìn)行適當(dāng)設(shè) 定,以使每一次的抗毒素的給藥量為10000單位 100000單位。在給藥量、方案的設(shè)定中, 可以以馬抗毒素時(shí)的使用量、方案(日醫(yī)雜志第128卷,第1號(hào)/平成14(2002)年7月1 日)為參考,參照本發(fā)明的組合物和馬抗毒素的相對(duì)效價(jià),考慮患者的病癥、效果的持續(xù)時(shí) 間等。為了使其適用于國(guó)際使用,優(yōu)選以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)本發(fā)明的組合物的抗毒素效價(jià)。 以日本藥局方在醫(yī)藥品各條記錄的生物學(xué)制劑醫(yī)藥品中記載的“干燥肉毒桿菌馬抗毒素 (干燥肉毒桿菌抗毒素)”項(xiàng)、詳細(xì)為生物學(xué)制劑基準(zhǔn)的“干燥肉毒桿菌馬抗毒素”3. 2. 7 “效 價(jià)試驗(yàn)”為基準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè),就可以算出基于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的抗毒素效價(jià)。實(shí)施例1.肉毒桿菌類毒素免疫抗體文庫的制作1-1.肉毒桿菌類毒素對(duì)人志愿者的接種培養(yǎng)各A、B、E和F型菌,以純化得到的毒素而得到的毒素為材料,進(jìn)行類毒素的 調(diào)制。特別是A型為,將用作現(xiàn)在治療用毒素的由肉毒桿菌97株(C. botulinum 97)或 62A株(C. botulinum 62A)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素依據(jù)在B型神經(jīng)毒素中進(jìn)行的方法(Infect. Immun. 18 :761_766,1977)進(jìn)行純化。純化的各型毒素用福爾馬林使其失活,與鋁佐劑混合 得到沉淀ABEF型多元混合類毒素。以該多元類毒素為基礎(chǔ)免疫,以3 4周間隔皮下注射 0. 5mL 3次,進(jìn)一步約12個(gè)月后皮下注射0.5mL 1次。進(jìn)一步10年后,20年后追加注射, 進(jìn)一步在以下的成分采血時(shí)約3周前注射相同量。1-2.抗體文庫的制作由接種了 ABEF型肉毒桿菌類毒素人通過成分采血采取相當(dāng)于3升血液的單核細(xì) 胞成分血(約50ml)。用PBS稀釋2倍,回收血細(xì)胞后,以IOml/試管分裝的Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare Bioscience)上重層,在400g、RT、30分鐘的條件下進(jìn)行離心處理,只 對(duì)單核細(xì)胞部分再純化,分離1. 8 X IO9細(xì)胞。使用0. 9 X IO9細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取(RNA ExtractionKit =Amersham),回收 1. 89mg。使用隨機(jī)引物調(diào)制 cDNA 后(Super ScriptII Invitrogen),使用對(duì)抗體的H鏈(VH)特異性的引物組(參照下述)和對(duì)抗體的L鏈(VLCL κ鏈、λ鏈)特異性的引物組(參照下述),擴(kuò)增目的抗體基因。H鏈重組入pscFvCA-ESVHd 載體(利用Sfil-Xhol),L鏈重組入噬菌粒載體(pFCAH9-E8d:參照再表01/062907,利用 SfiI-AscI),得到H鏈文庫、κ鏈文庫和λ鏈文庫。文庫的大小是,H鏈文庫為7. 05X 109,κ鏈文庫為5. 87X 108,λ鏈文庫為5. 05Χ108。(1)對(duì)VH特異性的引物組人抗體重鏈基因的取得用5’末端側(cè)引物(VHl VH7)和3’末端側(cè)引物(將human JH引物4種(697 700)等量混合的引物)用于各VH家族的擴(kuò)增的引物人VH引物(SfiI位點(diǎn)用下劃線表示)628hVHla (序列編號(hào) 81)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG629hVH2a (序列編號(hào) 82)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG630hVH3a (序列編號(hào) 83)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG631hVH4a (序列編號(hào) 84)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG632hVH5a (序列編號(hào)邪)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC633hVH6a (序列編號(hào)邠)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG629-2hVH2a-2 (序列編號(hào) 87)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC631-2hVH4a-2 (序列編號(hào) 88)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG632-2hVH5a-2 (序列編號(hào) 89)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG712hVH7 (序列編號(hào) 90)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT人JH引物(BstPI,XhoI位點(diǎn)用下劃線表示)697hJHl-2 (序列編號(hào) 91)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC698hJH3 (序列編號(hào) 92)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC699hJH4-5 (序列編號(hào) 93)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC700hJH6 (序列編號(hào) 94)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC(2)對(duì)L鏈(VLCL :κ鏈、λ鏈)特異性的引物組輕鏈基因取得用VL的在5’側(cè)芳基化的引物(κ 1 κ 6、λ 1 λ 6)和在Ck、 CX的3’側(cè)芳基化的引物(hCKASC引物或hCLASC引物)L 鏈(VLCL κ 鏈、λ 鏈)
21
5,-引物 κ 1 κ 6hVKla (序列編號(hào) 95)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCChVK2a (序列編號(hào) 96)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCChVK3a (序列編號(hào) 97)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCChVK4a (序列編號(hào) 98)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCChVK5a (序列編號(hào) 99)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCChVK6a (序列編號(hào) 100)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC5,-引物 λ 1 λ 6hVLl (序列編號(hào) 101)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCChVL2(序列編號(hào) 102)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGChVL3a (序列編號(hào) 103)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACChVL3b (序列編號(hào) 104)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCChVL4(序列編號(hào) 105)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCACGTTATACTGACTCAACCGCChVL5(序列編號(hào) 106)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCChVL6(序列編號(hào) 107)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA3,-引物 hCKASC(序列編號(hào) 108)TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG3,-引物 HCLASC(序列編號(hào) 109)TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC由H鏈文庫用HindIII、XhoI切出H鏈基因,重組入將κ鏈文庫和λ鏈文庫等摩 爾混合而制作的L鏈文庫,最終得到文庫大小為1.3Χ IOltl的抗肉毒桿菌毒素篩選用Fab型 抗體文庫(圖1)。認(rèn)為抗體的種類由VH的CDR3的多樣性而產(chǎn)生,此次制作的巨大的抗體 文庫充分覆蓋分離的抗體基因的多樣性。2.使用A型肉毒桿菌類毒素和肉毒桿菌毒素的無毒成分蛋白質(zhì)的抗體文庫的篩 選2-1.篩選實(shí)驗(yàn)1
(1)特異性克隆的選擇、回收為了取得中和抗體,理想的是篩選在具有神經(jīng)毒的活性的神經(jīng)毒素部位結(jié)合的抗 體。但是,對(duì)獻(xiàn)血志愿者免疫毒素全長(zhǎng)制作的類毒素,與無毒成分蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體(在此 時(shí)不需要的抗體)也在體內(nèi)產(chǎn)生。另外,取得具有神經(jīng)毒的活性的神經(jīng)毒素也是受限制的。 因此,采用以下的篩選策略最初使無毒成分蛋白質(zhì)和人抗體文庫反應(yīng),將不需要的抗體吸 收至無毒成分蛋白質(zhì)后,回收反應(yīng)上清液,接著使肉毒桿菌類毒素與未吸收至無毒成分蛋 白質(zhì)的人抗體文庫反應(yīng)。首先,在微型杯(Nunc公司制,Maxisorp) 6孔分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml 的濃度的肉毒桿菌類毒素和無毒成分蛋白質(zhì)各100μ 1,在4°C反應(yīng)過夜并固相化。除去溶 液后,分別分裝BSA/PBS各200μ 1,在37°C下進(jìn)行1小時(shí)封閉。將制作的人抗體文庫 1.0X IO13克隆當(dāng)量首先分裝(130μ1/孔)入最初將無毒成分蛋白質(zhì)固相化的微型杯,在 37°C下反應(yīng)2小時(shí)。之后,回收反應(yīng)上清液重新分裝入將肉毒桿菌類毒素固相化的微型杯, 在37°C下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢后,除去反應(yīng)液,用PBS洗凈5次。分裝0. IM HCl (溶解甘 氨酸調(diào)制為PH2. 2) 100 μ 1/孔,在室溫下反應(yīng)15分鐘,回收與抗原結(jié)合了噬菌體抗體。將其對(duì)OD 0. 5的大腸桿菌DH12S 20ml進(jìn)行1小時(shí)感染,添加至60ml的SBGA培養(yǎng) 基(在 SB 培養(yǎng)基(將 MOPS IOg,Typtone 3Og 和 Yeast Extract2Og 溶解,用 3N NaOH 調(diào)節(jié) 至PH7后,使最終溶液量為1升)作為最終濃度添加125 μ g/ml氨芐青霉素硫酸鹽和0. 5% glucose),在37°C下培養(yǎng)2小時(shí)后,添加至500ml的SBA培養(yǎng)基進(jìn)一步在37°C下培養(yǎng)2小 時(shí)。接著,添加IX IO12當(dāng)量的輔助噬菌體K07,在37°C下培養(yǎng)2小時(shí)后,添加卡那霉素以使 終濃度為50μ g/ml,在30°C下培養(yǎng)18小時(shí)。將其以8000rpm進(jìn)行10分鐘離心處理,回收 上清液,在其中混合IlOml的PEG液(20%聚乙二醇6000,2. 5M NaCl)充分?jǐn)嚢杌旌虾?,?8500rpm進(jìn)行15分鐘離心處理,使噬菌體沉淀。將其在2. 5ml的PBS中懸濁,使用其一部分 研究大腸桿菌感染數(shù)。這樣,得到第一次(1st)篩選的噬菌體(第一次噬菌體)。第二次(2nd)篩選為,除了使用第一次噬菌體400 μ 1和使PBS洗凈次數(shù)為20次 以外,在與第一次篩選相同的條件下實(shí)施。第三次(3rd)篩選為,除了使用第二次噬菌體 400μ1以外,在與第二次篩選相同的條件下實(shí)施。在第三次篩選后,提取46克隆。(2)抗體克隆的堿基序列確定將通過篩選得到的大腸桿菌稀釋,撒在添加了氨芐青霉素(100μ g/ml)的普通瓊 脂培養(yǎng)基上。挑取得到的菌落(相當(dāng)于上述(1)的46克隆),以2xYTGA培養(yǎng)基在30°C下 培養(yǎng)過夜后,以PI_50(倉敷紡織株式會(huì)社)提取DNA,用雙脫氧法確定堿基序列。(3)各抗體克隆的cp3融合蛋白質(zhì)的表達(dá)、調(diào)制將通過篩選得到的大腸桿菌稀釋,撒在添加了氨芐青霉素(100μ g/ml)的普通瓊 脂培養(yǎng)基上。挑取得到的菌落(相當(dāng)于上述(1)的46克隆),以2xYTGA培養(yǎng)基在30°C下 培養(yǎng)過夜后,將20 μ 1接種至2ml的0. 05%葡萄糖2xYTA(2xYT,100 μ g/ml氨芐青霉素硫 酸鹽,0.05%葡萄糖)。在30°C下培養(yǎng)3小時(shí)后,添加IM IPTG20y 1,進(jìn)一步培養(yǎng)20小時(shí)。 接著,以微量離心機(jī)以15000rpm離心處理5分鐘,回收上清液。在上清液中含有各抗體克 隆的cp3融合蛋白質(zhì)。使用該上清液進(jìn)行與類毒素、無毒成分的ELISA。(4)與肉毒桿菌類毒素以及無毒成分的ELISA反應(yīng)以使用肉毒桿菌類毒素以及無毒成分蛋白質(zhì)的ELISA判定抗體的結(jié)合能力。只與
23肉毒桿菌類毒素反應(yīng)的抗體是分離目的的抗體(即中和抗體)。首先,在微型杯(Nunc公司制,Maxisorp)分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml的濃度 的肉毒桿菌類毒素和無毒成分蛋白質(zhì)各ΙΟΟμΙ,在4°C反應(yīng)過夜并固相化。除去溶液后,分 別分裝1%BSA/PBS各200μ1,在37°C下進(jìn)行1小時(shí)封閉。分裝在(3)得到的上清液(含 有抗體的cp3融合蛋白質(zhì))各100μ 1,在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。除去溶液后,用PBS洗凈, 將用PBS稀釋為2. 5 μ g/ml的兔抗cp3抗體(MBL)在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。除去溶液后,用 PBS洗凈,將用PBS稀釋10000倍的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(MBL)在37°C下反應(yīng)1小 時(shí)。除去溶液后,用PBS洗凈,在室溫下使100 μ 1的OPD液反應(yīng)5分鐘。以2Ν硫酸使反應(yīng) 停止,以 SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)測(cè)定 492nm 處的吸光度。如上所述,研究在(1)回收的46克隆的結(jié)合能力的結(jié)果為,40克隆(作為氨基酸 序列不同的為22種)對(duì)于肉毒桿菌類毒素表現(xiàn)出反應(yīng)性。另外,對(duì)于肉毒桿菌毒素的無毒 成分蛋白質(zhì),19種反應(yīng)。(5)抗體蛋白質(zhì)的調(diào)制另一方面,在以上述肉毒桿菌類毒素為抗原的篩選中得到的抗體中,對(duì)于肉毒桿 菌毒素的無毒成分蛋白質(zhì)不表現(xiàn)出反應(yīng)性,而與肉毒桿菌類毒素反應(yīng)的抗體有3種(圖2)。 應(yīng)予說明,以對(duì)于無毒成分蛋白質(zhì)的ABS <0.2為判定標(biāo)準(zhǔn)。用箭頭表示的BT-015、37、39、 44中,BT-037和與無毒成分蛋白質(zhì)反應(yīng)的BT-014的氨基酸序列相同)。以限制酶SalI將 這些噬菌粒DNA消化后,使其自身再結(jié)合,轉(zhuǎn)變?yōu)镻roteinA融合抗體(Fab-pp型抗體),使 用其對(duì)DH12S進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后,以25ml的2xYTGA在30°C下培養(yǎng)過夜。將該培養(yǎng)液20ml 與2升的2xYTA混合培養(yǎng)3小時(shí)后,添加2ml的IM IPTG,在30°C下培養(yǎng)20小時(shí)。將培養(yǎng) 液在4°C、8000rpm條件下進(jìn)行10分鐘的離心處理,回收上清液。在回收的上清液中緩慢加 入1122g的硫酸銨,在室溫下攪拌混合1小時(shí)后,在4°C、8500rpm條件下進(jìn)行30分鐘的離 心處理。將沉渣放入100ml的加有Complete (Roche公司制)的PBS中懸濁。接著,對(duì)于 PBS,在4°C下透析過夜后,在4°C、IOOOOrpm條件下進(jìn)行10分鐘的離心處理?;厥丈锨逡?, 將其添加至填充了 3ml的IgG瓊脂糖(GE Healthcare Bioscience)的柱,在室溫下以自然 滴下的方式使其通過柱內(nèi)。用300ml的PBS洗凈柱后,用6ml的0. 2M甘氨酸(pH3)、3ml的 0. 2M甘氨酸(pH2. 5) UOml的0. 2M甘氨酸(pH3)洗脫。將洗脫液分別以2M Tris調(diào)節(jié)pH 至7. 0后,裝入透析濃縮用管中(Millipore公司制,Amicon Ultra-15,4°C、轉(zhuǎn)速5530rpm), 對(duì)PBS進(jìn)行透析,濃縮。之后進(jìn)行SDS-PAGE,算出蛋白質(zhì)濃度。(6)利用動(dòng)物試驗(yàn)的抗體評(píng)價(jià)通過將分離、調(diào)制的Fab-pp型抗體與毒素混合皮下給藥后,觀察小鼠的麻痹等 的癥狀這樣的半定量試驗(yàn)法,評(píng)價(jià)各抗體的中和能力。方法以參考文獻(xiàn)(MTakahashi et al. , International Journal of Food Microbiology,11,271-278,1990. Jpn. J. Med. Sci. Biol. ,43. 163-170,1990)為標(biāo)準(zhǔn)。作為比較對(duì)照,將A型肉毒桿菌毒素抗毒素日本標(biāo)準(zhǔn)品 (10單位/ml)稀釋10倍,得到作為儲(chǔ)備溶液的抗毒素原液(1單位/ml),進(jìn)一步調(diào)制將其 用PBS進(jìn)行每次3倍的6步稀釋而得到的的溶液(以下,稱為“標(biāo)準(zhǔn)稀釋”)。另一方面,將 在(5)得到的抗體溶液用PBS稀釋5倍制成抗體原液,進(jìn)一步進(jìn)行每次5倍的4步稀釋,得 到樣本(以下稱為“樣本稀釋液”)。另外,將肉毒桿菌神經(jīng)毒素(3. 8 X 105LD50/ml)稀釋400倍得到儲(chǔ)備溶液
24(950LD50/ml),進(jìn)一步稀釋500倍制作試驗(yàn)毒素(1. 9LD50/ml)。準(zhǔn)確量取試驗(yàn)毒素0. 25ml、 各標(biāo)準(zhǔn)稀釋以及樣本稀釋液0. 25ml,充分混合在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后,對(duì)1組2只的小鼠進(jìn) 行每只0. 2ml的皮下接種,觀察3天。根據(jù)試驗(yàn)組的小鼠的臨床癥狀(完全緩解、麻痹的程 度),判定樣本的效價(jià)。結(jié)果,BT-015表現(xiàn)出中和能力(圖3)。2-2.篩選實(shí)驗(yàn)2在篩選實(shí)驗(yàn)1取得的抗體中,用以下的方法調(diào)制混合了判斷為陰性(與無毒素部 位也反應(yīng)的抗體)的19克隆的抗體蛋白質(zhì)的抗體。首先,將該19克隆的DNA混合,以限制酶SalI消化后,使其自身再結(jié)合,轉(zhuǎn)變?yōu)?Fab-pp型抗體,使用其對(duì)DH12S進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后,以IOOml的2xYTGA在30°C下培養(yǎng)過 夜。將該培養(yǎng)液40ml與4升的2xYTA混合培養(yǎng)3小時(shí)后,添加4ml的IM IPTG,在30°C下 培養(yǎng)20小時(shí)。將培養(yǎng)液在4°C、8000rpm條件下進(jìn)行10分鐘的離心處理,回收上清液。在 回收的上清液中緩慢加入2244g的硫酸銨,在室溫下攪拌混合1小時(shí)后,在4°C、8500rpm條 件下進(jìn)行30分鐘的離心處理。將沉渣放入200ml的加有Complete (Roche公司制)的PBS 中懸濁。接著,對(duì)于PBS,在4°C下透析過夜后,在4°C、IOOOOrpm條件下進(jìn)行10分鐘的離心 處理?;厥丈锨逡海瑢⑵涮砑又撂畛淞?3ml的IgG瓊脂糖(GE Healthcare Bioscience)的 柱,在室溫下以自然滴下的方式使其通過柱內(nèi)。用500ml的PBS洗凈柱后,用6ml的0. 2M甘 氨酸(PH3)、3ml的0. 2M甘氨酸(pH2. 5) UOml的0. 2M甘氨酸(pH3)洗脫。將洗脫液分別 以2M Tris調(diào)節(jié)pH至7.0后,裝入透析濃縮用管中(Millipore公司制,Amicon Ultra-15, 4°C、轉(zhuǎn)速5530rpm),對(duì)PBS進(jìn)行透析,濃縮。之后進(jìn)行SDS-PAGE,算出蛋白質(zhì)濃度。將以上的方法調(diào)制的抗體混合蛋白質(zhì)以230μ g/ml添加來遮蔽抗原后(參照?qǐng)D 4),用與篩選實(shí)驗(yàn)1相同的方法實(shí)施篩選。結(jié)果,回收46克隆。用ELISA分析各抗體克隆, 結(jié)果可知類毒素特異性反應(yīng)的新型抗體克隆含有27種。這樣,通過將抗原遮蔽,大幅減少 與無毒素部位反應(yīng)的抗體(2/46),提高篩選效率(圖5下方(第四次(4th)))。2-3.篩選實(shí)驗(yàn)3由于在篩選實(shí)驗(yàn)1的第三次篩選中判斷為陰性的克隆數(shù)多,因此認(rèn)為在該階段已 經(jīng)產(chǎn)生偏差,中和抗體的存在比例降低。因此,使用篩選中途階段的第二次篩選后的噬菌體 抗體(第二次噬菌體),實(shí)施篩選(第三次_2)。首先,在微型杯(Nunc公司制,MaXiS0rp)6 孔分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌類毒素100μ 1,在4°C反應(yīng)過夜并固 相化。除去溶液后,分別分裝1%BSA/PBS 200μ1,在37°C下進(jìn)行1小時(shí)封閉。除去封閉溶 液后,以30μ g/孔分裝在2-2.調(diào)制的抗體混合蛋白質(zhì),在37°C下反應(yīng)1小時(shí)來遮蔽抗原。 除去抗體蛋白質(zhì)溶液后,將第二次噬菌體3. 6X IO13當(dāng)量和在2-2.調(diào)制的抗體混合蛋白質(zhì) 180 μ g混合后,分裝入微型杯,在37°C下反應(yīng)2小時(shí)。以后的操作與上述篩選實(shí)驗(yàn)1相同。最后挑取46克隆,用ELISA確認(rèn)它們的結(jié)合能力。結(jié)果,類毒素特異性反應(yīng)的新 型抗體克隆有20種。通過將抗原遮蔽,大幅減少與無毒素部位反應(yīng)的抗體(1/46),提高篩 選效率(圖5上方(第三次-2))。由這些各抗體克隆調(diào)制抗體蛋白質(zhì),實(shí)施毒素的中和試驗(yàn)。結(jié)果,兩個(gè)克隆 (BT-058、BT-047)表現(xiàn)出中和活性,但它們的H鏈的氨基酸序列與在篩選實(shí)驗(yàn)1取得的克 隆BT-015的H鏈的氨基酸序列基本相同(圖6)。因此,認(rèn)為這3個(gè)克隆的表位相同。2-4.篩選實(shí)驗(yàn)4(同時(shí)實(shí)施利用抗體群共存的群體排除和利用抗體共存的相同克隆排除)通過使判斷為陰性的抗體與篩選系共存,進(jìn)行改善,以有效地取得類毒素特異性 抗體克隆,但只能取得與在篩選實(shí)驗(yàn)1取得的抗體克隆BT-015相同或類似的抗體克隆。因 此,為了取得新型抗體克隆,采取以下的策略除了判斷為陰性的抗體克隆19種的抗體蛋 白質(zhì)以外,也使抗體克隆BT-015的抗體蛋白質(zhì)共存,由此遮蔽這些抗體克隆的表位(第四 次_2篩選)。首先,在微型杯6孔分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌類毒素 100μ 1,在4°C反應(yīng)過夜并固相化。除去溶液后,分別分裝1%BSA/PBS 200 μ 1,在37°C下進(jìn) 行1小時(shí)封閉。除去封閉溶液后,分裝在2-2.調(diào)制的抗體混合蛋白質(zhì)和由抗體克隆BT-015 調(diào)制的抗體蛋白質(zhì)(各自30yg/孔),在37°C下反應(yīng)1小時(shí)來遮蔽抗原。除去抗體蛋白質(zhì) 溶液后,將在篩選實(shí)驗(yàn)3得到的噬菌體(第三次-2噬菌體)7. 2X IO12當(dāng)量和在2-2.調(diào)制 的抗體混合蛋白質(zhì)180 μ g以及由抗體克隆BT-015調(diào)制的抗體蛋白質(zhì)180 μ g混合后,分裝 入微型杯,在37°C下反應(yīng)2小時(shí)。以后的操作與上述篩選實(shí)驗(yàn)1相同。挑取94克隆,用ELISA確認(rèn)它們的結(jié)合能力,全都與類毒素特異性反應(yīng)(圖7)。 在這些克隆中,具有新型氨基酸序列的克隆有26種。另外,不含有與抗體克隆BT-015相同 或類似的抗體。應(yīng)予說明,以上的篩選過程如圖9所示。接著,通過觀察與毒素混合進(jìn)行皮下給藥時(shí)小鼠的生死、麻痹等的癥狀這樣的簡(jiǎn) 易的試驗(yàn)方法,評(píng)價(jià)各抗體克隆的中和能力。具體的試驗(yàn)方法以參考文獻(xiàn)(日本生物學(xué)制 劑基準(zhǔn)厚生勞動(dòng)省)為標(biāo)準(zhǔn)。在試驗(yàn)中,使用由各抗體克隆調(diào)制的Fab-pp型抗體。作為比 較對(duì)照,將A型肉毒桿菌毒素抗毒素日本標(biāo)準(zhǔn)品(10單位/ml)稀釋10倍,得到作為儲(chǔ)備溶 液的抗毒素原液(1單位/ml),將其用PBS稀釋調(diào)制成0. 1單位的溶液進(jìn)一步調(diào)制進(jìn)行每次 2倍的5步稀釋的溶液(以下,稱為“標(biāo)準(zhǔn)稀釋”)。樣本直接使用調(diào)制的原液。將肉毒桿菌神經(jīng)毒素稀釋400倍,得到儲(chǔ)備溶液(950LD50/ml),進(jìn)一步稀釋10倍, 制作試驗(yàn)毒素(95LD50/ml)。準(zhǔn)確量取試驗(yàn)毒素0. 25ml和各標(biāo)準(zhǔn)稀釋以及樣本0. 25ml,充 分混合在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后,對(duì)1組2只的小鼠進(jìn)行每只0. 2ml的皮下接種,觀察4天。 根據(jù)試驗(yàn)組的小鼠的臨床癥狀(完全緩解、麻痹的程度),判定樣本的效價(jià)。結(jié)果,抗體克隆 BT-175表現(xiàn)出中和能力(圖8)。2-5.篩選實(shí)驗(yàn)5 (使用A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素的篩選)由肉毒桿菌 62A 株,依照文獻(xiàn) INFECTION AND IMMUNITY, Vol. 12,No. 6Dec. 1975, p. 1262-1270,由純化的肉毒桿菌毒素除去無毒成分蛋白質(zhì),純化調(diào)制的神經(jīng)毒素(毒素的 活性中心150kDa)。實(shí)施以其為抗原的篩選,嘗試取得識(shí)別與抗體克隆BT-015、BT-175不 同的表位的中和抗體。首先,在微型杯6孔分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌神經(jīng)毒素 100 μ 1,在4°C反應(yīng)過夜并固相化。除去溶液后,分別分裝BSA/PBS 20(^1,在371下 進(jìn)行1小時(shí)封閉。除去封閉溶液后,分裝人抗體文庫1.0Χ1013(130μ 1/孔),在37°C下反 應(yīng)2小時(shí)。以后的操作與上述篩選實(shí)驗(yàn)1相同(實(shí)施到第四次篩選為止。在第四次篩選使 用第三次噬菌體400 μ 1)。實(shí)施第四次篩選后,挑取188克隆,用ELISA確認(rèn)它們的結(jié)合能力的結(jié)果為,類 毒素特異性反應(yīng)的克隆有6種(圖10、11)。其中,大量含有與至此取得的2種抗體克隆
26(BT-015、BT-175)相同或相似的克隆(對(duì)于BT-015為6克隆,對(duì)于BT-175為5克隆)。2-6.篩選實(shí)驗(yàn)6 (利用BT-015和BT-175抗體共存的相同克隆排除)在以神經(jīng)毒素為抗原的篩選(2-5.)中,以排除大量的所取得的抗體克隆(與 BT-015或BT-175相同或類似的克隆)為目的,進(jìn)一步實(shí)施篩選實(shí)驗(yàn)。首先,在微型杯8孔分別分裝用PBS調(diào)制至10 μ g/ml的濃度的神經(jīng)毒素100 μ 1, 在4°C反應(yīng)過夜并固相化。除去溶液后,分別分裝l%BSA/PBS200y 1,在37°C下進(jìn)行1小時(shí) 封閉。除去封閉溶液后,分裝由抗體克隆BT-015及BT-175調(diào)制的抗體蛋白質(zhì)(各自30yg/ 孔),在37°C下反應(yīng)1小時(shí)來遮蔽抗原。除去抗體蛋白質(zhì)溶液后,將在篩選實(shí)驗(yàn)5的第三次 篩選得到的噬菌體(第三次噬菌體)2.0X1013和由抗體克隆BT-015以及BT-175調(diào)制的 抗體蛋白質(zhì)(各180yg)混合后,分裝入微型杯,在37°C下反應(yīng)2小時(shí)。挑取188克隆,用 ELISA確認(rèn)它們的結(jié)合能力,與神經(jīng)毒素特異性反應(yīng)的新型克隆有24種(圖12、13)。應(yīng)予 說明,以上的篩選過程如圖15所示。2-7.利用動(dòng)物試驗(yàn)的抗體評(píng)價(jià)由在以神經(jīng)毒素為抗原的篩選(篩選實(shí)驗(yàn)5和6)取得的30種的抗體克隆調(diào)制 Fab-pp型抗體。對(duì)于各Fab-pp型抗體,通過與毒素混合進(jìn)行皮下給藥觀察小鼠的生死、麻 痹等的癥狀這樣的試驗(yàn)方法,判斷中和能力。試驗(yàn)方法以參考文獻(xiàn)(生物學(xué)制劑基準(zhǔn)厚生 勞動(dòng)省日本藥局方)為標(biāo)準(zhǔn),樣本的效價(jià)作為對(duì)于日本標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)效價(jià)求出。將A型肉 毒桿菌抗毒素日本標(biāo)準(zhǔn)品(10單位/ml)稀釋10倍,得到作為儲(chǔ)備溶液的抗毒素原液(1單 位/ml),將其用PBS稀釋調(diào)制成0. 1單位/ml的溶液進(jìn)一步調(diào)制進(jìn)行每次2倍的5步稀釋 的溶液(以下,稱為“標(biāo)準(zhǔn)稀釋”)。樣本直接使用調(diào)制的原液。將肉毒桿菌神經(jīng)毒素稀釋400倍,得到儲(chǔ)備溶液(950LD50/ml),進(jìn)一步稀釋10倍, 制作試驗(yàn)毒素(95LD50/ml)。準(zhǔn)確量取試驗(yàn)毒素0. 25ml和各標(biāo)準(zhǔn)稀釋以及樣本0. 25ml,充 分混合在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后,對(duì)1組2只的小鼠進(jìn)行每只0. 2ml的皮下接種,觀察40天。 根據(jù)試驗(yàn)組的小鼠的臨床癥狀(完全緩解、麻痹的程度),判定樣本的效價(jià)。結(jié)果,4種抗體 克隆(NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)表現(xiàn)出中和能力(圖 14)。3.抗體序列的比較在以上的篩選(篩選實(shí)驗(yàn)1 6)取得的抗體的序列信息如下所示。應(yīng)予說明,在 圖16中,比較這些抗體(其中,除去BT-015的類似克隆,即BT-047和BT-058)的氨基酸序 列,同時(shí)示出與種系的同源性。(DBT-015
(氨基酸序列)
VH CDRl 序列編號(hào)1
VH CDR2 序列編號(hào)2
VH CDR3 序列編號(hào)3
VH 序列編號(hào)4
VL⑶Rl 序列編號(hào)5
VL CDR2 序列編號(hào)6
VL⑶R3 序列編號(hào)7
VL 序列編號(hào)8
(堿基序列)VH 序列編號(hào)77VL 序列編號(hào)78(8) NT-539(氨基酸序列)VH CDRl 序列編號(hào) 57VH CDR2 序列編號(hào) 58VH CDR3 序列編號(hào) 59VH 序列編號(hào)60VL CDRl 序列編號(hào) 61VL CDR2 序列編號(hào) 62VL CDR3 序列編號(hào) 63VL 序列編號(hào)64(堿基序列)VH 序列編號(hào)79VL 序列編號(hào)804.抗體的分析4-1. IgG抗體的調(diào)制由在Fab-pp型抗體中觀察到中和活性的抗體克隆(BT-015、BT-175、NT-221、 NT-320、NT-523)調(diào)制IgG抗體。首先,對(duì)于各抗體克隆,將編碼VH的基因片段與人Yl鏈 規(guī)定區(qū)域DAN連接后,重組入表達(dá)載體“BCMGS Neo載體”(鳥山一“牛乳頭狀瘤病毒載體”, 村松正實(shí)和網(wǎng)山博人編,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊(cè)基因工程手冊(cè),羊土社,PP- 297-299 (1991),制作伴 有規(guī)定區(qū)域的H鏈載體。同樣地,將各抗體克隆的L鏈全長(zhǎng)基因重組入載體,得到L鏈表達(dá) 抗體表達(dá)載體。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法將抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞株CH0-K1,在37°C 下培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后,移入96孔板,選擇高表達(dá)細(xì)胞。使用無血清培養(yǎng)基(CHO-S-SFM II: Invitrogen 公司制,(ν/ν)青霉素-鏈霉素溶液Sigma_Aldrich 公司制,700µ ;g/ ml G418 =Sigma-Aldrich公司制),將選擇的各細(xì)胞在大量培養(yǎng)燒瓶(BectonDickinson公 司制CELLine 1000燒瓶)中培養(yǎng)2周?;厥张囵B(yǎng)上清液,供給Protein G結(jié)合親和柱。用 PBS洗凈柱后,用甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. 7)洗脫,用Tris鹽酸緩沖液(pH8. 9)進(jìn)行中和。 接著,將洗脫液放入透析濃縮用管(Millipore公司制,Amicon Ultra-15)對(duì)PBS進(jìn)行透析 濃縮。將這樣得到的IgG型抗體用于以后的實(shí)驗(yàn)。4-2.利用Biacore的結(jié)合常數(shù)分析分析使用BiaCOre3000生物傳感器裝置。首先將神經(jīng)毒素880RU在傳感器芯片 (CM5)上固相化后,依次改變濃度(1.9nM ΙμΜ)注入(40 μ 1,2分鐘)Fab-pp型或IgG 型抗體。分析結(jié)果如圖17(BT-015的Fab-PP型抗體)、圖18(BT_015的IgG型抗體)、圖 19 (BT-175 的 Fab-PP 型抗體)、圖 20 (BT-175 的 IgG 型抗體)、圖 21 (NT-221 的 Fab-PP 型抗 體)、圖22(NT-320的Fab-PP型抗體)所示。分析的結(jié)果為,都是具有強(qiáng)結(jié)合力的抗體。4-3.利用Biacore的表位分析
30
調(diào)制對(duì)于A型肉毒桿菌毒素表現(xiàn)出中和活性的6種抗體克隆(BT-015、BT-175、 NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)的Fab-PP型抗體,使用其進(jìn)行Biacore的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。將 神經(jīng)毒素800RU固化于傳感器芯片(CM5)后,以以下的濃度依次注射抗體,測(cè)定有無競(jìng) 爭(zhēng)。注射為每次流過40 μ 1(2分鐘)。所有的分析實(shí)驗(yàn)都是在HBS-EP流速20 μ 1/分鐘 HBS-EP(Biacore)中,在 25°C下進(jìn)行。再生是將 IOOmM Glycine-HCl (ρΗ2. 0)以 20 μ 1 (流 速60 μ 1/分鐘,20秒)進(jìn)行的。[表 1]表1 抗體的注射濃度(單獨(dú)或混合、最終濃度)
權(quán)利要求
一種A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其含有識(shí)別具有由序列編號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)8的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,識(shí)別具有由序列編號(hào)36的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)40的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,和識(shí)別具有由序列編號(hào)44的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)48的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位、或者具有由序列編號(hào)52的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列編號(hào)56的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗體的表位的第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(4)或(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(6) (8)中任一種的抗體(1)具有由序列編號(hào)1的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)2的氨基酸 序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)3的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由序 列編號(hào)5的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)7的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(2)具有由序列編號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)10的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)11的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)13的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)14的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)15的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(3)具有由序列編號(hào)17的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)18的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)19的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)21的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)22的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)23的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(4)具有由序列編號(hào)25的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)26的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)27的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)29的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)30的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)31的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(5)具有由序列編號(hào)33的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)34的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)35的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)37的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)38的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)39的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(6)具有由序列編號(hào)41的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)42的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)43的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)45的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)46的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)47的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(7)具有由序列編號(hào)49的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)50的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)51的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由序列編號(hào)53的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)54的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)55的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體;(8)具有由序列編號(hào)57的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)58的氨基 酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2、由序列編號(hào)59的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3、由 序列編號(hào)61的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、由序列編號(hào)62的氨基酸序列構(gòu)成的輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)2和由序列編號(hào)63的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自所述⑴ ⑶中任一種的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(4)或(5)的抗體,第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體,進(jìn)一步含有所述(7)或(8)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中, 第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體, 第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,進(jìn)一步含有所述(7)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中, 第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體,第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體, 第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(7)的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,進(jìn)一步含有所述(4)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物,其中,所述(1)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)4的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)8的氨基酸序列,所述(2)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)12的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)16的氨基酸序列,所述(3)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)20的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)24的氨基酸序列,所述(4)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)28的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)32的氨基酸序列,所述(5)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)36的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)40的氨基酸序列,所述(6)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)44的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)48的氨基酸序列,所述(7)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)52的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)56的氨基酸序列,所述(8)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)60的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)64的氨基酸序列。
9.一種分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,其包含權(quán)利要求2規(guī)定的(1) (8)中任 一種的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體,其中,所述(1)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)4的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)8的氨基酸序列,所述(2)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)12的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)16的氨基酸序列,所述(3)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)20的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)24的氨基酸序列,所述(4)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)28的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)32的氨基酸序列,所述(5)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)36的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)40的氨基酸序列,所述(6)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)44的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)48的氨基酸序列,所述(7)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)52的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)56的氨基酸序列,所述(8)的抗體的重鏈可變區(qū)具有序列編號(hào)60的氨基酸序列,輕鏈可變區(qū)具有序列編 號(hào)64的氨基酸序列。
11.一種分離的核酸分子,編碼權(quán)利要求10所述的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。
12.—種載體,保持權(quán)利要求11所述的核酸分子。
13.一種轉(zhuǎn)化體,是用權(quán)利要求12所述的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的。
14.一種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的制備方法,其包含培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體,生產(chǎn)人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序, 回收培養(yǎng)上清液,由培養(yǎng)上清液純化人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種對(duì)于肉毒桿菌中毒疾病和其中毒發(fā)病的預(yù)防有效的方法。本發(fā)明提供表位不同的多種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。另外,本發(fā)明還提供將它們組合的、中和活性高的A型肉毒桿菌毒素中和組合物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101965403SQ200980107100
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者東成見, 向本雅郁, 小崎俊司, 幸田知子, 高橋元秀, 黑澤仁, 黑澤良和 申請(qǐng)人:株式會(huì)社抗體研究所;國(guó)立感染癥研究所所長(zhǎng)代表的日本國(guó);公立大學(xué)法人大阪府立大學(xué)