專利名稱：一種人白介素-32在治療或預(yù)防a型流感病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子克隆、A型流感病毒滴度和病毒效價(jià)檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一 種人白介素-32在治療或預(yù)防A型流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
典型的A型流感病毒粒子呈球型，直徑為80 120nm，平均為100nm。從家禽分離 的A型流感病毒，有些毒株主要為球形，而有些毒株為多形性，有的呈長絲狀，有的為奇形 怪狀的顆粒。A型流感病毒的多形性在病毒遺傳學(xué)研究中可作為一種遺傳標(biāo)志，但初分離的 多形態(tài)的病毒粒子，經(jīng)過雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)傳代后主要變?yōu)榍蛐?。A型流感病毒的囊 膜由纖突、雙層類脂膜和基質(zhì)蛋白構(gòu)成。囊膜表面的纖突呈放射狀排列，纖突可分為兩類， 一類呈棒狀，由血凝素(HA)分子的三聚體構(gòu)成，另一種呈蘑菇狀，由神經(jīng)氨酸酶(NA)的四 聚體構(gòu)成。HA和NA是病毒的兩種主要保護(hù)性抗原。HA在病毒吸附及穿膜過程中起關(guān)鍵作 用，剌激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可中和病毒的感染，從而可以阻止禽流感的發(fā)生，HA在感染過 程中可被水解為兩條肽鏈HA1和HA2，是感染細(xì)胞的先決條件。NA剌激機(jī)體產(chǎn)生的抗體雖然 不能中和病毒的感染，但可使病毒的釋放量減少，進(jìn)而使禽流感發(fā)生的嚴(yán)重程度大大降低。 HA變異率高，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因，具有亞型特異性；NA具有比HA基因變異速 度慢的特點(diǎn)。基質(zhì)蛋白是病毒粒子內(nèi)的主要蛋白成分，其形成的基質(zhì)膜緊貼在類脂雙層內(nèi) 面包圍著核衣殼，，是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白。A型流感病毒的核衣殼呈螺旋對稱，分為大 小不同的8個(gè)片段，核酸外被螺旋排列的殼粒，主要由核蛋白構(gòu)成。 A型流感病毒的復(fù)制是一個(gè)高度有序的過程，從病毒感染宿主開始到釋放子代病 毒，完成這一周期約需5 6小時(shí)。首先病毒粒子經(jīng)表面的HA糖蛋白介導(dǎo)，與宿主細(xì)胞表面 受體結(jié)合，通過膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用使病毒進(jìn)入胞漿并脫殼。在核內(nèi)，病毒RNA1 6合 成6個(gè)單順反子mRNA，轉(zhuǎn)譯為PB2， PB1， PA， NP， HA和NA，病毒RNA7 8的互補(bǔ)RNA經(jīng)拼接 各產(chǎn)生兩個(gè)mRNA，轉(zhuǎn)譯合成Ml， M2和NS1， NS2，其中NP和NS1含量最高，高濃度NP觸發(fā)病 毒RNA (負(fù)鏈)的合成，新合成的病毒RNA在核內(nèi)與NP組成復(fù)合體，進(jìn)而組裝病毒核衣殼， 又可作為轉(zhuǎn)錄第二代mRNA的模板。HA和NA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，經(jīng)高爾基體修飾，隨后移植于細(xì) 胞膜中。Ml移行至布滿HA和NA的細(xì)胞質(zhì)膜下面，經(jīng)過與HA、NA或M2的相互作用，發(fā)出芽 生的信號。NA使子代病毒從細(xì)胞膜上釋放出來，避免子代病毒在膜上聚集，病毒成熟的最后 一步是HA靠宿主的蛋白酶裂解為HA1和HA2，使病毒粒子有感染性。關(guān)于子代病毒裝配過 程中有選擇性的只包裝8個(gè)不同RNA片段而不出差錯(cuò)，至今仍是一個(gè)謎。
白介素32(IL-32)，之前被稱為自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子4(NK4)。白介素32主要表 達(dá)于自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血單核細(xì)胞。白介素32的六種轉(zhuǎn)錄本現(xiàn)在已被發(fā) 現(xiàn)。IL-32在先天性免疫和獲得性免疫當(dāng)中發(fā)揮了重要的作用。IL-32和許多其它先天性 免疫因子的協(xié)同作用已經(jīng)得到了很好的證實(shí)。它不僅僅可以通過激活炎癥因子來剌激宿主 的免疫反應(yīng)，同時(shí)也能夠通過分化單核細(xì)胞成為巨噬細(xì)胞來直接影響特殊的免疫反應(yīng)。蛋白酶PR3和PR3激活的IL-32能夠在Wegener肉芽腫病中把先天性免疫和自身免疫聯(lián)系起 來。另外，IL-32還具有抗艾滋病的功能。IL-32具有6種不同的剪接異構(gòu)體，并且這些亞 型各自的功能目前并不清楚。 IL-32在多種人類和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系都可誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN- Y剌激人上皮Wish 細(xì)胞，在細(xì)胞裂解液里以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)IL-32的產(chǎn)生，46h后減少；IL-18和IL-1 P 剌激A549-RP (轉(zhuǎn)染IL-18RP的人肺癌A549細(xì)胞系)，在其裂解液里也以時(shí)間依賴性方式 誘導(dǎo)IL-32的產(chǎn)生，在未剌激的A549-RP里則不能檢測到IL-32的合成，在A549-WT (未轉(zhuǎn) 染IL-18RP的人肺癌A549細(xì)胞系)里只有IL_1 P能誘導(dǎo)IL-32的產(chǎn)生，類似于IL_1 P 誘導(dǎo)這種細(xì)胞系產(chǎn)生IL-6和IL-8，且IFN- y能誘導(dǎo)A549-WT裂解液產(chǎn)生IL-32 ;IL_12與 IL-18合用能剌激人NK細(xì)胞產(chǎn)生IL-32,這兩種細(xì)胞因子表現(xiàn)協(xié)同作用；用絲裂原ConA剌 激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) ， 60h后在其上清和裂解液里都能檢測到IL-32產(chǎn)生，且裂解 液比上清含更多的IL-32,但是用LPS剌激人PBMC則不能檢測到IL-32的產(chǎn)生。IL_2活化 的NK細(xì)胞或絲裂原剌激的T細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-32。 IL-32能在E. coli和3種不同來源的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞(人上皮293T細(xì)胞系的衍生物Aniou65、Cos7-S和Cos7_T)里產(chǎn)生rIL_32。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清里rlL-32P最大量為lng/ml， IL-32 a低于100pg/ml。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種人白介素-32在制備治療或預(yù)防A型流感病毒感 染藥物中的應(yīng)用，利用分子生物學(xué)方法克隆和構(gòu)建了 IL-32各個(gè)剪接異構(gòu)體IL-32(a ， 13 ， Y， S， e，和O基因的克隆，并且分別轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。申請人發(fā)現(xiàn)只有IL-32 Y是分泌 型的，過表達(dá)了白介素-32的所有亞型的MDCK細(xì)胞對A型流感病毒的抵抗力都增強(qiáng)了 ，其 中IL-32 y作用最為明顯。 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
— . IL-32各個(gè)剪接異構(gòu)體基因的克隆和構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 白介素32的基因組結(jié)構(gòu)和其在染色體上的定位已經(jīng)被分析。利用NCBI的基因數(shù) 據(jù)庫中比對發(fā)現(xiàn)白介素32在人染色體16pl3. 3上，含有8個(gè)小外顯子，跨長約5kb，外顯子 l-外顯子8長分別為762-935bp、1223-1266bp、2817-2855bp、2994-3053bp、3424-3450bp、 3620-3679bp、4430-4549bp和4721_4995bp，第2個(gè)外顯子含有1個(gè)ATG起始密碼子。由于 mRNA的可變剪接，白介素32有六種轉(zhuǎn)錄本IL-32a 、IL-32P 、 IL-32 y 、 IL-32 S 、IL_32 e 、 和IL-32 ;(見附圖1)。據(jù)此設(shè)計(jì)的IL-32各種亞型的克隆質(zhì)粒構(gòu)建的引物如下(酶切位 點(diǎn)為EcoRI和Hindi 11): 5' -CAGCGAATTCAATGTGCTTCCCGAAGG-3， (sense primer for isoform a， p， y， and e ); 5' -CAGCGAATTCAATGAAGAAGCTGAAGG-3， (sense primer for isoform S);
5' -CAGCGAATTCAATGCAAAATGCAGAAT-3， (sense primer for isoform";
5' -GTCGAAGCTTTCATTTTGAGGATTGGG-3' (antisense primer for all isoforms).
申請人:把構(gòu)建好的6種IL-32亞型過表達(dá)質(zhì)粒(IL-32 a 、 IL-32 P 、 IL-32 Y 、 IL-32 S 、IL-32 e 、和IL-32 ;)經(jīng)過測序確認(rèn)后，轉(zhuǎn)染進(jìn)MDCK， 48小時(shí)之后用ELISA檢測培 養(yǎng)基上清中的IL-32表達(dá)量。結(jié)果表明，只有過表達(dá)IL-32 y的細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)量大大高于陰性對照，由此證明6種亞型當(dāng)中，只有IL-32Y可以分泌到細(xì)胞外。(見附圖2)
二 .血凝效價(jià)法測IL-32對A型流感病毒滴度的影響 IL-32降低A型流感病毒的滴度。首先，申請人檢測了分別過表達(dá)不同IL-32亞 型之后的MDCK細(xì)胞對A型流感病毒感染的抵抗能力。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用A型流感病毒 感染MDCK細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，用于HA試驗(yàn)檢測病毒滴度。申請人 發(fā)現(xiàn)IL-32均可以抑制病毒的滴度，抑制能力的強(qiáng)弱為IL-32 y > IL-32 4 > IL-32 P > IL-32 a > IL-32 S > IL-32e。其中IL-32 y抑制效果最顯著；IL_32 ; ， IL-32 P和IL-32 a 次之；IL_32 S和IL-32 e僅僅有微弱的抑制作用。(見附圖3)
三.熒光定量PCR檢測IL-32對A型流感病毒三種RNA表達(dá)水平的影響
IL-32抑制A型流感病毒復(fù)制過程中3種類型RNA的水平。為了進(jìn)一步在復(fù)制水 平證實(shí)IL-32對A型流感病毒復(fù)制的影B向，申請人檢測了 A型流感病毒復(fù)制過程中的3種 RNA的表達(dá)水平(mRNA， cRNA和vRNA)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用A型流感病毒感染MDCK細(xì)胞， 感染后3小時(shí)收集細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-32各種亞型 均對A型流感病毒的mRNA， cRNA和vRNA有不同程度的抑制作用，其中IL-32 y的抑制效果 最顯著，且所有亞型的抑制效果與血凝效價(jià)試驗(yàn)基本吻合。(見附圖4)
本發(fā)明的應(yīng)用前景有以下幾個(gè)方面 本發(fā)明通過分子生物學(xué)技術(shù)得IL-32的各個(gè)剪接異構(gòu)體真核克隆，并在人源真核 細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IL-32具有有效的抗A型流感病毒作用，以此依據(jù)為預(yù)防和治療A型流 感病毒的藥物研究提供一種新的方法和方向，即利用人體自身免疫基因IL-32開發(fā)的藥物 在制備預(yù)防和治療A型流感病毒的藥物中的應(yīng)用。具體應(yīng)用前景有以下幾個(gè)方面一，以 IL-32為靶基因，開發(fā)能調(diào)控該基因表達(dá)的藥物，通過增強(qiáng)人體自身的免疫能力從而達(dá)到對 抗A型流感病毒的目的；二，利用IL-32的真核表達(dá)克隆在酵母中或制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大量表 達(dá)IL-32，純化后作為藥物直接應(yīng)用于抗A型流感病毒的預(yù)防和治療中；三，隨著基因治療 技術(shù)的興起，利用該基因直接開發(fā)抗A型流感病毒的藥物在基因療法中的應(yīng)用。本發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果 —.本發(fā)明的應(yīng)用前景之一是利用人IL-32的基因表達(dá)產(chǎn)物制備蛋白注射藥物用 于治療A型流感病毒感染，該藥物中的有效成分是IL-32蛋白，是人體自身的免疫因子，避 免了其他抗A型流感病毒藥物的毒副作用。 在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，中請人轉(zhuǎn)染了 IL-32的七種剪接異構(gòu)體質(zhì)粒，在細(xì)胞中過表 達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的各種IL-32蛋白亞型含量超出細(xì)胞內(nèi)源性IL-32水平10倍以上，申請人發(fā) 現(xiàn)六種IL-32亞型對細(xì)胞活力均無顯著性影響，由此申請人確認(rèn)從細(xì)胞水平上講IL-32沒 有毒副作用。(見附圖5) 二 .如將該基因作為治療A型流感病毒藥物開發(fā)的靶基因，其原理是尋找能特異 性地誘導(dǎo)IL-32基因大量表達(dá)的藥物用于治療A型流感病毒感染，這與傳統(tǒng)的中醫(yī)理驗(yàn)有 異曲同工之妙，即通過改善人體自身的免疫能力從而達(dá)到抵抗疾病的目的。本發(fā)明旨在以 IL-32基因作為靶位點(diǎn)，與傳統(tǒng)中醫(yī)相比又具有明確的目標(biāo)性。
圖1IL-32六種轉(zhuǎn)錄本的基因組組成模式圖。
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圖2轉(zhuǎn)染IL-32的六種剪接異構(gòu)體真核表達(dá)質(zhì)粒后，分別用elisa法檢測細(xì)胞上 清中IL-32的含量，只有IL-32 y分泌到上清中。 圖3IL-32的六種剪接異構(gòu)體均能降低A型流感病毒感染細(xì)胞之后的滴度，其中 IL-32 y的效果最為明顯。 圖4熒光定量PCR方法檢測IL-32各種亞型均對A型流感病毒的mRNA(A圖)， cRNA(B圖)和vRNA(C圖)有不同程度的抑制作用，其中IL-32 y的效果最為明顯。
圖5MTT法檢測IL-32各種亞型對細(xì)胞活力影響，數(shù)據(jù)顯示IL-32各種亞型對細(xì)胞 活力沒有顯著性影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 : 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 提取Jurkat細(xì)胞的mRNA后逆轉(zhuǎn)錄PCR得到cDNA，以它為模版用各個(gè)間接異構(gòu)體 的克隆引物擴(kuò)增出的目的片段。載體Pcmv-Tag2A (Sigma公司)經(jīng)Mlul和HindIII雙酶切 后，純化回收，16t:水浴連接過夜。電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a (中國典型培養(yǎng)物保藏中 心_武漢大學(xué)保藏中心，普通大腸桿菌)中，涂布到氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)板上，37t:培養(yǎng) 12-16h，挑選單克隆進(jìn)行PCR及酶切鑒定，挑選2個(gè)克隆進(jìn)行測序，鑒定目的片段的序列及 編碼框是否正確。 A. DNA片段的回收，玻璃奶(glass-milk)法 1.取PCR產(chǎn)物，加入1/10體積lOXloading buffer,在含有0. 5 ii g/ml溴化乙錠 的瓊脂糖凝膠中電泳分離酶切片段。 2.當(dāng)待回收片段與其它片段完全分離后，用無菌刀片切下含目的DNA帶的凝膠。
3.轉(zhuǎn)移凝膠至E卯endorf管中，加入3倍體積的凝膠緩沖液(6M NaCl ， 50mM Tris-Cl， pH 8. 0， 10mM EDTA) ，50。C保溫20min。 4.待凝膠完全融化，加入10 玻璃奶，振蕩均勻，室溫(20-25t:以下相同)靜置 lOmin。 5. 15000rpm離心30sec，棄上清。6.加入lml洗滌緩沖液(50%乙醇，0. 4M NaCl，20mM Tris-Cl，pH7. 5，2mM EDTA)， 振蕩均勻，15000rpm離心30sec，棄上清。
7.重復(fù)步驟6三次。 8.吸棄上清，加入100ii1 TE溶液，振蕩均勻后，5(TC洗脫10min。
9. 15000rpm離心lmin，轉(zhuǎn)移上清至另一各無菌的E卯endorf管中。
10.重復(fù)步驟9一次，合并兩次上清，15000rpm離心5min，完全去除玻璃奶。
11.依次用苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取上清。 12.加入1 ii 1肝糖原(glycogen) 、 1/5體積的10M NH4Ac (pH 5. 2)和2. 5倍體積 預(yù)冷的無水乙醇，混勻，置-20°C lhr以上，以沉淀DNA。 13. 15000rpm離心20min，吸棄上清，DNA沉淀用預(yù)冷的70% (體積比)乙醇清洗 兩次后，于37t:溫箱內(nèi)干燥。 14.加入10 ii 1無菌雙蒸水融解DNA沉淀，_20°C中保存?zhèn)溆谩?br>
連接 10x buffer lul pGL3載體(Promega公司)/M+H lul IL-32啟動(dòng)子PCR回收產(chǎn)物/M+H 3ul T4連接酶 0.5ul 16。C連接過夜。 B.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1.在1000ml LB培養(yǎng)基中接入活化過夜的宿主菌大腸桿菌DH5 a ， 37。C劇烈振搖 至0D600值為0. 5-1. 0。 2.將菌液收集在冰預(yù)冷的離心管中，4。C，4000rpm離心15min。 3.用1000ml冰預(yù)冷的去離子水洗滌菌體沉淀，4°C ， 4000rpm離心15min。4.用500ml冰預(yù)冷的去離子水洗滌菌體沉淀，4°C ， 4000rpm離心15min。 5.用20ml冰預(yù)冷的10% (體積比)甘油洗滌菌體沉淀，4°C ， 4000rpm離心15min。 6.加入2-3ml冰預(yù)冷的10% (體積比)甘油重懸菌體，調(diào)整細(xì)胞濃度在3 X 1010/
ml左右，分裝成每管40 iU，保存于-70°C 。 7.臨用前，室溫融化一小份感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，加入待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA l-2iil，混勻。 8.設(shè)置電穿孔儀參數(shù)為25iiF，2. 5kV，200Q 。 9.轉(zhuǎn)移感受態(tài)細(xì)胞和DNA的混合物至0.2cm的冰預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，裝入電轉(zhuǎn)化槽， 打開電脈沖開關(guān)，產(chǎn)生一個(gè)4秒的脈沖。 10.迅速加入400ii1 LB培養(yǎng)基，一起轉(zhuǎn)移至無菌Eppendorf管中，于37t:振搖 (220rpm)，復(fù)蘇lhr。 11.取100 iU菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的LB平板上，至液體被完全吸收后，倒置 平板，于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)入宿主菌DH5a ，涂布于含氨芐青霉素 (Amp)的LB平板上，于37"溫箱培養(yǎng)12-16hrs。
C.陽性克隆的篩選 挑取上述平板上長出的單個(gè)菌落并接種到裝有滅菌的LB液體培養(yǎng)基(含有氨芐 霉素)的試管中，置37t:搖床培養(yǎng)12-16小時(shí)后用堿裂解法提取質(zhì)粒。
D.質(zhì)粒DNA的提取和純化
質(zhì)粒DNA的小量提取 1.以無菌牙簽挑取生長在抗性平板上的單菌落，接種到3ml含相應(yīng)抗生素的LB培 養(yǎng)基中，37°C ， 250rpm振搖培養(yǎng)過夜。 2.次日取出，取1.5ml培養(yǎng)物于Eppendorf管中，4。C，12000rpm離心30s，收集 菌體沉淀，吸棄上清液，加入100 iil冰預(yù)冷的溶液I(溶液I :50mM葡萄糖，25mMTris-Cl， pH8. 0， lOmM EDTA， pH8. 0)，劇烈振蕩使沉淀完全懸浮。 3.加入20iil溶液II(溶液I1 :0. 2M NaOH，l% SDS，臨用前配制)，顛倒5至7次 混勻，待整個(gè)溶液澄清，冰浴靜置5min。 4.加入150 ii 1冰預(yù)冷的溶液III (溶液III :將5M KAc 60mL、 HAc 11. 5mL、 H20 28. 5mL混勻配制成100mL)，輕微振蕩均勻，冰浴10min，澄清的溶液會出現(xiàn)絮狀沉淀。
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5. 4°C ， 12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)無菌的Eppendorf管中。 6.加入等體積的苯酚/氯仿(1 : 1)，反復(fù)混勻，12000rpm，5min，將上清移到另一
離心管中。 7.在上清中加入1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)及2. 5體積的無水乙醇，-2(TC放 置lhr以上，以沉淀DNA。 8. 12000rpm離心10min，去上清，加入lml的70% (體積比)乙醇洗滌沉淀，振蕩 并離心，倒去上清液，空氣中干燥。9. DNA沉淀溶于20ii 1含胰RNA酶(20 ii g/ml)的TE溶液(10mM Tris-cl， lmM EDTA，Ph8.0)中，37t:溫箱內(nèi)孵育2-3hr，消化RNA。消化完后，于_20°C中保存。
陽性克隆質(zhì)粒DNA的純化 a.取篩選出的陽性克隆質(zhì)粒DNA 5-lOii g，溶于100 iU雙蒸水中。
b.加等體積的平衡酚振蕩lmin，室溫下5000g離心5min。 c.取上清，加等體積氯仿與異丙醇(體積比為1 : 1)混合液，振蕩lmin，室溫下 5000g離心5min。 4.將上清加2. 5倍體積的無水乙醇，1/10體積的3M乙酸鈉。
5. -20°C ，沉淀2hr。 4°C ， 10000g，離心5min。
6.空氣干燥沉淀，溶于TE中，-2(TC保存。
E.陽性克隆的鑒定并測序 限制性內(nèi)切酶消化檢測陽性克隆，用Mlul+Hindl11雙酶切提取好的質(zhì)粒，37。C溫
浴2hr，電泳酶切產(chǎn)物，鑒定陽性克隆并送Invitrogen生物公司測序。 實(shí)施例2 : 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 A.哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 1.細(xì)胞復(fù)蘇1)將細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速置37t:水浴中解凍，期間不斷搖動(dòng)凍存管，使細(xì)
胞液受熱均勻； 2)將解凍的細(xì)胞移入25ml細(xì)胞瓶中，再加入3ml相應(yīng)的DMEM培養(yǎng)基(生產(chǎn)商 GIBCO，下同)； 3)置于37°C ， 5% (體積比)的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4)細(xì)胞貼壁后，置換新的DMEM培養(yǎng)基。
2.細(xì)胞傳代 1)細(xì)胞長滿生長的平面空間，倒掉DMEM培養(yǎng)基；
2)加入8ml D-Hank' s緩沖液，蕩洗細(xì)胞，再移去洗滌液；
3)加入lml胰酶，置于37"放置5min ;
4)加入4mlDMEM培養(yǎng)基，中和胰酶； 5)吸去2/3的細(xì)胞懸液，再加入6mlDMEM培養(yǎng)基，置于37°C ， 5% (體積比)的C02
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.細(xì)胞凍存 i)配置凍存液(培養(yǎng)基甘油血清=7:i:2);
2)取長滿的細(xì)胞，如上操作，用胰酶消化；
3)用凍存液中和胰酶，分裝入2ml凍存管中； 4oC放置4h，轉(zhuǎn)入-80oC凍存一周后。任取一管細(xì)胞，復(fù)蘇檢測細(xì)胞的活力。復(fù)蘇
成功后，轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存。 B.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。帶有負(fù)電荷的DNA與陽離子型化合物帶有正電荷的末端相結(jié)合
(Feigner, Gadek et al. 1987 ;Mannino and Gould-Fogerite 1988)，然后DNA結(jié)合型脂質(zhì)
和細(xì)胞膜相結(jié)合，使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對有些細(xì)胞能夠產(chǎn)生極高的轉(zhuǎn)染效
率，但是對于其它一些細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率和其它方法相比得到的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)或更差。因此，
對于不同的細(xì)胞系而言，需要做一些預(yù)實(shí)驗(yàn)確定哪一種方法更為有效。具體方法如下 以下轉(zhuǎn)染操作以24孔板為例。轉(zhuǎn)染全過程必須嚴(yán)格無菌操作。 1)在轉(zhuǎn)染前一天將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于24孔板中，37t:培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞密度以
40-60 %為準(zhǔn)。 2)準(zhǔn)備以下溶液 a)稀釋2-20iU Lipofectin2000試劑于lOOiil無血清、無抗菌素的RIPM培養(yǎng) 基。混勻后室溫靜置3min。 b)稀釋1-2 ii g待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA于100 iil無血清、無抗菌素的RIPM培養(yǎng)基?；靹?后室溫靜置。 3)混合a) 、 b)兩種溶液，室溫靜置20min。然后再加入800 iU無血清、無抗菌素
的匿EM培養(yǎng)基，振蕩混勻(溶液可能會呈霧狀渾濁，但不影響轉(zhuǎn)染)。4)棄掉培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，用2ml無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次。 5)加以上Lipofectin2000試劑-DNA混合物lml覆蓋細(xì)胞。
6)37。C溫育6h。 7)吸出轉(zhuǎn)染液，加入正常生長培養(yǎng)基DMEM，37。C培養(yǎng)。
8)48-72h后檢測。
實(shí)施例3: A. EILSA法檢測IL-32蛋白表達(dá)量 1.血清，細(xì)胞培養(yǎng)上清或者細(xì)胞裂解液樣品按1 : 50用PBS(ra 7.4)稀釋，取 100 iil加入到ELISA板小孔中，37t:包被一小時(shí)或者4t:包被過夜。 2.用PBS洗ELISA板5次(每次洗過盡量把液體拍干凈，以保證盡量洗干凈)。
3.配3% (體積比)PBST脫脂奶粉，用PBST溶解，按每孔100iil加入到ELISA板
上，37t:封閉一小時(shí)或者4t:封閉過夜。 4.用PBST洗5次以上。 5.多肽免疫家兔制備的IL-32抗體用PBST按1 : 500稀釋，每孔加100 iU， 37°C 一小時(shí)。 6.用PBST洗5次以上。 7.辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG用PBST按1 : 5000稀釋，37。C半小時(shí)。 8.用PBST洗5次以上。
9.加酶結(jié)合物，每孔一滴，37t:半小時(shí)
10.用PBST洗5次。 11.每孔分別加入顯色液A和B (Sigma公司生產(chǎn)的ELISA顯色試劑盒，顯色液A和
B分別為商用TMB顯色底物和顯色緩沖液)，各一滴，37t:避光顯色5分鐘。 12.每孔加終止液一滴，酶標(biāo)儀讀數(shù)。 B.血凝效價(jià)實(shí)驗(yàn)測定A型流感病毒滴度(HA assay) 1.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加75y L不同稀釋度的細(xì)胞培養(yǎng)上清
樣品，如表4. l所示 表1. HA試驗(yàn)稀釋度設(shè)置
孔號123456789101112
病毒1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/陰性
稀釋255075100125150175200225250300對照
度 3.自右至左依次向各孔加入O. 5X雞紅細(xì)胞懸液75iiL，在振蕩器上振蕩，室溫下 靜置后觀察結(jié)果。 4.結(jié)果判定從靜置后20min開始觀察結(jié)果，待對照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié) 果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集(++++)，不凝集者(_)紅 細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單 位。 C.熒光定量PCR測定病毒各種RNA含量(Real-Time PCR) 1. A型流感病毒感染3小時(shí)后，收集MDCK細(xì)胞，按照說明書提取總RNA并使用設(shè)計(jì) 好的不同引物逆轉(zhuǎn)錄cDNA。 2.使用針對NP和Y-actin的特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件如下 (95°C ， 5分鐘)，1個(gè)循環(huán)；(95°C ， 30秒)——(55°C ， 30秒)——(72°C ， 1分鐘)，40個(gè)循環(huán)；
3.使用Rotor-gene software (Corbett Research)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)Ct值 得到相對的RNA拷貝數(shù)，其中Y -actin作為平衡NP的內(nèi)參。
實(shí)施例4: IL-32不同剪接異構(gòu)體對MDCK細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)。 1、消化T25瓶中MDCK細(xì)胞，加適量細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞10-15次。 2、將細(xì)胞鋪到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h待用。 3、將培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞取出，倒去原有培養(yǎng)液，換用2XFBS的維持培養(yǎng)基稀釋的梯 度藥物，培養(yǎng)24h待用。 4、然后依照實(shí)施例2中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入IL-32七種剪接異構(gòu)體質(zhì)粒以及空載 體質(zhì)粒。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，于培養(yǎng)板加入5mg/mL MTT液50 y L/孔(以不含 血清的匿EM培養(yǎng)基配制成)，置C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 5、培養(yǎng)2-3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMS0 :乙醇體積比為
101 : 1) 100 u L，振蕩5-10分鐘。6、待結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)測定儀上，測定570nm波長處的光密度OD值。 細(xì)胞存活率=IL-32剪接異構(gòu)體過表達(dá)組平均0D570/轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞對照組平
均0D570*100%。
權(quán)利要求
一種人白介素-32在制備治療或預(yù)防A型流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人白介素-32在制備治療或預(yù)防A型流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，利用分子生物學(xué)方法克隆和構(gòu)建了IL-32各個(gè)剪接異構(gòu)體IL-32(α，β，γ，δ，ε，和ζ)的克隆，并且分別轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，申請人發(fā)現(xiàn)過表達(dá)了白介素-32的所有亞型的MDCK細(xì)胞對A型流感病毒的抵抗力都增強(qiáng)了。不同的IL-32亞型顯示出了不同的對A型流感病毒復(fù)制的抑制效果，其中IL-32γ抗A型流感病毒的效果最顯著，并且只有IL-32γ是分泌型的。人白介素-32是宿主免疫反應(yīng)中非常重要的抗病毒基因，申請人第一次提出人白介素-32具有非常有效的抗A型流感病毒的功能，同時(shí)揭示人白介素-32具有開發(fā)抗A型流感病毒有效預(yù)防和治療的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/16GK101703762SQ200910272638
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者吳建國, 孫偉, 朱應(yīng), 李永奎, 黎瑋 申請人:武漢大學(xué)