芳基硫脲及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：：芳基硫脲及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及芳基硫脲新化合物、合成及其抑制VEGFR-2的用途，更具體地說(shuō)，是含芳基硫脲化合物作為高效的靶向VEGFR的抗腫瘤藥及其合成和用途，屬藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VascularEndothelialGrowthFactorRec印tor，VEGFR)酪氨酸激酶因其在介導(dǎo)腫瘤血管生成過(guò)程中的關(guān)鍵作用，是目前最受關(guān)注的抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)革巴標(biāo)[Sebolt—Leopold，J.S.;English，J.M.，Mechanismsofdruginhibitionofsignallingmolecules.Nature2006，441，(7092)，457-62]。這個(gè)生長(zhǎng)因子受體家族現(xiàn)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)調(diào)控跨膜糖蛋白受體[Neufeld，G.;Cohen，T.;Gengrinovitch，S.;Poltorak，Z.，Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)anditsreceptors.FASEBJ1999,13，(1)，9-22.]:VEGFR-l(Fms-likeTyrosineKinase,Flt-1)、VEGFR-2(KinaseInsertDomainContainingRec印tor，KDR/Fsk-1)禾PVEGFR-3。像其它蛋白激酶一樣，它們通過(guò)催化轉(zhuǎn)移ATP末端磷酸，把細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)移到靶蛋白基體的酪氨酸殘基上，由此調(diào)控著許多生命過(guò)程，如細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移和凋亡等。VEGFR-2是單次跨膜蛋白，與所有VEGFR—樣，分為膜外的配體結(jié)合域、跨膜區(qū)和膜內(nèi)的酪氨酸激酶域。VEGFR-2的膜外區(qū)結(jié)構(gòu)柔性大，在與VEGF結(jié)合前后其構(gòu)象變化也大，因此不是小分子化合物的理想作用靶點(diǎn)。VEGFR-2膜內(nèi)酪氨酸激酶域分為幾個(gè)重要的功會(huì)g區(qū)[Crystalstructureofthekinasedomainofhumanvascularendothelialgrowthfactorreceptor2:akeyenzymeinangiogenesis.Structure1999,7，(3)，319-30.]:A)連接兩個(gè)蛋白小葉的絞鏈區(qū)；B)兩小葉之間扁平的三磷酸腺苷(AdenosineTri-Phosphate，ATP)結(jié)合域；C)富含甘氨酸的核苷結(jié)合環(huán)，催化環(huán)，高度柔性的活化環(huán)和激酶插入域。小分子抑制劑與ATP競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合，阻止酶的活化，從而阻斷VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)通路，達(dá)到抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成的目的。因此，VEGFR-2膜內(nèi)酪氨酸激酶域的ATP結(jié)合域自然地成為理想的小分子抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。目前為止，VEGFR-2的抑制劑研究取得了比較大的進(jìn)展。索拉非尼(nexavar，sorafenib)是由美國(guó)Onyx制藥公司和德國(guó)拜爾公司開發(fā)的針對(duì)VEGFR-2，VEGFR-3，RAF/MEK/ERK等信號(hào)途徑的多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，它在臨床前實(shí)驗(yàn)中能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管的生成。在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的臨床III期試驗(yàn)中，索拉非尼顯著地提高了患者的總生存期[Preclinicaloverviewofsorafenib，amultikinaseinhibitorthattargetsbothRafandVEGFandPDGFreceptortyrosinekinasesignaling.MolCancerTher2008，7，(10)，3129-40.]。另一個(gè)能作用于VEGFR-2的TKI藥物是輝瑞公司的舒尼替尼(sutent，sunitinib)，在隨機(jī)臨床III期治療中，舒尼替尼成功地抑制了對(duì)伊馬替尼產(chǎn)生抗性的胃腸道間質(zhì)瘤患者的腫瘤發(fā)展[Efficacyandsafetyofsunitinibinpatientswithadvancedgastrointestinalstromaltumourafterfailureofimatinib:arandomisedcontrolledtrial.Lancet2006,368，(9544)，1329-38.]。5現(xiàn)有藥物還是不能完全滿足臨床用藥的需求，因此目前藥物研發(fā)者還在積極地尋找新的具有VEGFR-2抑制作用的化合物。如CN101056871A、CN101052634A公開了作為VEGFR激酶抑制劑的鄰氨基苯甲酰胺吡啶脲類化合物。CN1972925A公開了一類具有VEGFR激酶抑制作用的雙芳基脲衍生物，但通式中取代基定義的多種基團(tuán)化合物從未實(shí)施，并且與已公開的取代基化合物有較大的性質(zhì)差異，因此我們無(wú)法預(yù)見通式中包含的硫脲類化合物是否具有VEGFR激酶抑制活性及其藥物安全性能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一類具有抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的芳基硫脲類新化合物。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一類芳基硫脲化合物的制備方法及用途。本發(fā)明提供的一類芳基硫脲化合物，具有如下結(jié)構(gòu)I其中，R為C6—1Q芳基，C4_C8雜芳基，取代的C6—1Q芳基，取代的C4_C8雜芳基，所述的C6—1Q芳基或C4-C8雜芳基被一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)取代-CN、-CF3、-N02、-CO具、-C(O)NR^'、、、鹵素或至多全鹵代；&和R/獨(dú)立的選自H，C卜1Q烷基，C6—14芳基，C3—13雜芳基，至多全鹵代的C卜1Q烷基。本發(fā)明所述化合物優(yōu)選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物16本發(fā)明式I化合物的合成如下反應(yīng)式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>具體的說(shuō)，以異硫腈酸酯(II)及[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]_^甲基甲酰胺(III)為原料，在溶劑中混合直接縮合得到芳基硫脲衍生物。其中，溶劑選自乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)。反應(yīng)溫度為20-10(TC，一般在室溫下或溶劑的回流溫度下進(jìn)行反應(yīng)。[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]-N-甲基甲酰胺(III)與異硫腈酸酯(II)的原料摩爾比為1:0.8-1.2。本發(fā)明式I化合物作為VEGFR的抑制劑的用途，優(yōu)選其在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述的腫瘤包括但不限于結(jié)腸癌、十二指腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、導(dǎo)管癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)惡性腫瘤和血液惡性腫瘤。我們通過(guò)計(jì)算機(jī)分子模型設(shè)計(jì)合成了大量的新系列化合物。通過(guò)大量的體外篩選實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這一系列芳基硫脲化合物具有顯著的抑制VEGFR-2和抗腫瘤的活性，且其作用顯著優(yōu)于脲類化合物sorafenib。此外，通過(guò)考察對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的影響，我們還意外地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的影響要顯著小于脲類化合物sorafenib，也就是說(shuō)本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物對(duì)人正常肝細(xì)胞具有更低毒性，表現(xiàn)其更加良好的抗腫瘤藥物安全性能。本發(fā)明是基于VEGFR蛋白激酶與小分子抑制相互作用的晶體結(jié)構(gòu)[Harris,P.A.;Cheung,M.;Hunter，R.N.，3rd;Brown，M丄；Veal，J.M.;Nolte，R.T.;Wang，L.;Liu，W.;Crosby，R.M.;Johnson，J.H.;Epperly，A.H.;Kumar，R.;Luttrell，D.K.;Stafford，J.A.，Discoveryandevaluationof2_anilino_5_aryloxazolesasanovelclassofVEGFR2kinaseinhibitors.JMedChem2005，48，(5)，1610-9.]，通過(guò)聚焦型化合物庫(kù)的合成方法，選定以藥效團(tuán)芳基硫脲為核心結(jié)構(gòu)，通過(guò)在硫脲氮原子上引進(jìn)不同的取代基，合成一系列不同取代芳基硫脲新化合物，在分子水平測(cè)定了各化合物對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體蛋白激酶的抑制活性，同時(shí)在細(xì)胞水平測(cè)定了各化合物對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤的抑制作用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1中間體111的合成步驟1:250mL三口瓶中，通氮?dú)庵脫Q空氣，并于N2保護(hù)下加入36mLS0Cl2，小心滴入1.2mL干燥的DMF，控溫42"，攪拌10min后，緩慢加入12g2-吡啶甲酸(30min內(nèi)加完)，然后升溫至72。C，攪拌反應(yīng)16h，冷卻至室溫，加入lOOmL甲苯，減壓濃縮至40mL，再加入60mL甲苯后濃縮至40mL，重復(fù)上述過(guò)程一次，有少量紅色固體出現(xiàn)，抽濾，用50mL甲苯洗滌固體，濾液置于250mL燒瓶中，冰水浴下緩慢加入40mL甲醇，攪拌10min，撤去冰浴，室溫下攪拌45min，再置于冰水浴中5min，加入40mL乙醚，有白色沉淀析出，過(guò)濾，用30mL乙醚洗滌所得固體，干燥后得淡黃色粉末(2)14.9g，產(chǎn)率73.5%。步驟2:250mL三口瓶中，化合物(2)14.9g溶于10mL甲醇與50mLTHF的混合溶劑中，N2保護(hù)下(TC攪拌10min，緩慢滴入70mL甲胺醇溶液，保持反應(yīng)溫度低于5°C，滴畢，(TC下反應(yīng)5h后，減壓蒸干溶劑，加入150mL乙酸乙酯洗滌殘余物，過(guò)濾，用50mL乙酸乙酯洗滌所得濾渣，所得濾液無(wú)水Na2S04干燥后，旋蒸得黃色油狀液體(3)12.4g。步驟3:250mL燒瓶中加入8.8g對(duì)氨基苯酚，130mL無(wú)水DMF和8.5g叔丁醇鉀，室溫下攪拌2h后，加入5.4g無(wú)水K2C03及12.4g化合物(3)，N2保護(hù)下升溫至8(TC反應(yīng)6h，反應(yīng)液中加入乙酸乙酯及飽和Na2C03溶液分液，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，無(wú)水Na2S04干燥后，硅膠柱層析分離(PE:EA=2:1(v/v))得6.Og棕黃色固體(III)。力NMR(600MHz，CDC13):S3.00(d，3H)，3.69(brs，2H)，6.71(d，2H)，6.87(d，2H)，6.90-6.91(m，1H)，7.66(d，1H)，7.99(brs，1H)，8.32(d，1H)實(shí)施例2中間體II異硫腈酸酯的合成方法1:100mL單口瓶中加入1.85g對(duì)甲氧基苯胺，6.3mL三乙胺和20mL甲苯，室溫?cái)嚢柘拢?0min內(nèi)滴加2.7mLCS2，加完后繼續(xù)室溫反應(yīng)直至析出大量固體。冰水浴下冷卻上述反應(yīng)液，緩慢滴加溶有1.48g三聚光氣(BTC)的15mL甲苯溶液，加完后繼續(xù)室溫反應(yīng)約4h，過(guò)濾，濾渣用甲苯洗2次，濾液減壓蒸餾得粗品，硅膠柱層析分離(純PE)得無(wú)色液體II-l1.86g，產(chǎn)率75.1%。^NMR(600MHz，CDC13):S3.79(s，3H)，6.83-6.84(d，2H)，7.13-7.15(d，2H).方法2:lOOmL單口瓶中加入O.89g對(duì)三氟甲氧基苯胺，3.30g三乙烯二胺六水和10mL甲苯，室溫?cái)嚢柘?，?0min內(nèi)滴加0.9mLCS2(溶于15mL甲苯)，加完后繼續(xù)室溫反應(yīng)直至析出大量固體。抽濾，并用少量甲苯洗滌所得固體，烘干得黃色固體。以上黃色固體懸浮于15mL二氯甲烷中，冰水浴冷卻至5-10°C，緩慢滴加溶有0.50g三聚光氣(BTC)的15mL二氯甲烷溶液，加完后室溫反應(yīng)lh，然后升溫回流反應(yīng)完全，冷卻至室溫，過(guò)濾除去不溶物，濾液減壓蒸餾得粗品，硅膠柱層析分離(純PE或PE:EA=5:1(v/v))得無(wú)色液體II-20.56g，產(chǎn)率50.7%。力NMR(600MHz，CDC13):S7.18-7.20(d，2H)，7.23-7.24(d，2H)實(shí)施例3化合物1的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>25mL單口瓶中，73mg中間體III溶于5mLDMF中，冰水浴冷卻攪拌下滴加溶于5mLDMF中的對(duì)三氟甲氧苯異硫腈酸酯71mg，滴畢室溫反應(yīng)，TLC板檢測(cè)反應(yīng)完成后，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水NS04干燥后，硅膠柱層析分離(PE:EA=2:l(v/v))得76mg淺灰色粉末，產(chǎn)率52.8%。1HNMR(600MHz，DMS0_d6):S2.96-2.97(d，3H)，7.01-7.02(m，1H)，7.05—7.06(d，2H)，7.18—7.19(d，2H)，7.42—7.45(t，4H)，7.62(d，1H)，8.11-8.12(brd，1H)，8.39-8.40(d，1H)，8.64(s，1H)，8.70(s，1H)MS(ESI):461.06(M_H)實(shí)施例4化合物2的制備操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為對(duì)氟苯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:0.8。所用溶劑為DMF，溫度50。C，產(chǎn)率為86%。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(d，3H)，6.90(d，2H)，6.98(d，2H)，7.02(m，1H)，7.07(m，1H)，7.31(d，2H)，7.55(d，2H)，8.05(br，3H)，8.51(m，1H)MS(ESI):395.02(M—H)實(shí)施例5化合物3的制備操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為對(duì)溴苯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.2所用溶劑為DMF，溫度20。C，產(chǎn)率為67%。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.99-3.00(d，3H)，7.02-7.03(m，1H)，7.10-7.12(t，4H)，7.36-7.38(m，2H)，7.44-7.45(d，2H)，7.67(d，1H)，7.85(s，1H)，7.87(s，1H)，8.01(brd，1H)，8.41—8.42(d，1H).MS(ESI):456.34(M-H)實(shí)施例6化合物4的制備COOEt操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為間苯甲酸乙酯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.O，所用溶劑為DMF，溫度20。C，產(chǎn)率為75%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S1.36(t，3H)，2.98(s，3H)，4.36(q，2H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.01(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.45(m，1H)，7.74(m，1H)，7.95(d，1H)，8.16(d，1H)，8.39(br，3H)，8.51(d，lH).11MS(ESI):450.51(M)+實(shí)施例7化合物5的制備,NH^NHCONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為1-萘異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為l:1.2，所用溶劑為DMS0，溫度100。C，產(chǎn)率為86%。lHNMR(600MHz，DMSO-d6):S2.75-2.76(d，3H)，7.10-7.12(m，1H)，7.14-7.16(d，2H)，7.38(d，1H)，7.50-7.55(m，4H)，7.59-7.60(d，2H)，7.83-7.85(t，1H)，7.93-7.97(m，2H)，8.48(d，1H)，8.71(br，1H)，9.78(s，1H)，9.89(s，1H)MS(ESI):429.22(M+H)+實(shí)施例8化合物6的制備,NH，CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為6-吲哚異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為l:0.8，所用溶劑為乙酸乙酉旨，溫度70。C，產(chǎn)率為54%。lHNMR(600腿z，DMSO-d6):S2.76-2.77(d，3H)，6.45(s，1H)，7.04-7.07(t，1H)，7.11-7.12(m，1H)，7.13-7.14(d，2H)，7.22—7.25(t，2H)，7.32—7.33(t，1H)，7.39(d，1H)，7.60—7.62(d，2H)，8.49-8.50(d，1H)，8.72(brd，1H)，9.61(s，1H)，9.84(s，1H)，11.16(brs，1H)MS(ESI):416.20(M_H)+實(shí)施例9化合物7的制備、CTvCONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為1-吡咯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:0.8，所用溶劑為乙醇，溫度20"，產(chǎn)率為48%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.98(s，3H)，5.97(d，1H)，6.23(m，1H)，6.90(d，2H)，6.96(d，1H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.35(dd，2H)，8.51(d，1H)，9.52(br，4H).MS(ESI):367.41(M)+實(shí)施例10化合物8的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為3-苯甲酰甲胺異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.0，所用溶劑為DMF，溫度2(TC，產(chǎn)率為84^。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.82(s，3H)，2.98(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.68(m，1H)，7.76(m，1H)，7.82(m，1H)，8.01(br，4H)，8.13(d，1H)，8.51(d，1H)MS(ESI):436.49(M+H)+實(shí)施例ll化合物9的制備CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為4-苯甲酰苯胺異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.2，所用溶劑為DMF，溫度IO(TC，產(chǎn)率為78%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，1H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.14(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，2H)，7.86(m，2H)，7.89(dd，2H)，8.16(dd，2H)，8.38(br，4H)，8.51(d，1H)MS(ESI):498.56(M+H)+實(shí)施例12化合物10的制備CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為4-苯甲硫醚異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.2，所用溶劑為DMF，溫度50。C，產(chǎn)率為79%。lHNMR(600腿z，DMS0-d6):S2.60(s，3H)，2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.30(dd，2H)，7.31(dd，2H)，7.51(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1H).MS(ESI):424.53(M)+實(shí)施例13化合物11的制備0v、C0NHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為4-吡啶異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.0，所用溶劑為DMF，溫度20。C，產(chǎn)率為62%。lHNMR(600MHz，13DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.80(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.45(dd，2H)，8.51(d，1H)MS(ESI):397.75(M)+實(shí)施例14化合物12的制備CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為3-硝基苯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.1，所用溶劑為乙腈，溫度50"，產(chǎn)率為87%。lHNMR(600腿z，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.67(m，1H)，7.86(m，1H)，8.05(br，3H)，8.20(m，1H)，8.51(d，1H)，8.87(d，1H)MS(ESI):422.44(M_H)+實(shí)施例15化合物13的制備N中間體III和中l(wèi)HNMR(600MHz，CTv、CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為2-腈基苯異硫腈酸酯間體II的摩爾比例為1:1.2，所用溶劑為匿F，溫度2(TC，產(chǎn)率為79%DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.22(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.54(m，1H)，7.66(m，1H)，7.75(m，1H)，8.07(br，3H)，8.51(d，1H)MS(ESI):402.45(M_H)+實(shí)施例16化合物14的制備CONHCH3操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為4-氯_3-三氟甲基苯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.0，所用溶劑為乙腈，溫度3(TC，產(chǎn)率為85X。1H畫R(600MHz，DMS0-d6):S2.97-2.98(d，3H)，7.05-7.06(m，1H)，7.07-7.08(d，2H)，7.41-7.44(t，3H)，7.60(d，1H)，7.66-7.68(dd，1H)，7.71(d，1H)，8.14-8.15(brd，1H)，8.41-8.42(d，1H)，8.61(s，1H)，8.81(s，1H).MS(ESI):479.04(M—H)+，■10(M+)14實(shí)施例17化合物15的制備操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為5-氯萘異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為1:1.0，所用溶劑為DMF，溫度20。C，產(chǎn)率為65%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，1H)，7.44(m，1H)，7.71(m，1H)，7.78(m，1H)，8.05(m，1H)，8.05(br，3H)，8.09(m，1H)，8.51(d，lH).MS(ESI):462.95(M)+實(shí)施例18化合物16的制備操作方法同實(shí)施例3，所用中間體II為苯異硫腈酸酯，中間體III和中間體II的摩爾比例為l:1.O，所用溶劑為DMF，溫度20。C，產(chǎn)率為91%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.91(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.06(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.34(m，2H)，7.58(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1).MS(ESI):378.45(M)+以下通過(guò)具體藥效試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體[VEGFR]蛋白激酶抑制活性測(cè)試將VEGFR-2蛋白激酶的胞質(zhì)區(qū)序列Val805_Val1356在Sf9細(xì)胞中大量表達(dá)，接種于6孔板(5'105/孔)，無(wú)血清培養(yǎng)液同步化24小時(shí)后，在4t:下用細(xì)胞裂解液作用20分鐘，刮下細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，離心后收集上清，通過(guò)連續(xù)色譜發(fā)分離得到純度>90%的激酶蛋白。在96孔板中，用poly(Glu4-Tyr)在Tris緩沖溶液(25mMTris，pH7.2，150mMNaCl)中配比成0.5mg/mL的懸液，1小時(shí)候用TBS溶液洗滌兩次。VEGFR-2激酶稀釋到激酶反應(yīng)緩沖溶液中，加入用匿SO配制的化合物溶液孵化10分鐘。在各孔中加入ATP/MgCl2激發(fā)反應(yīng)，最后的溶液濃度組成是1M的ATP，10mM的MgCl2，lmM的MnCl2，4mM的HEPES，pH為7.4，20mM的Na3V04，20mg/mL的BSA，和2%的DMSO。室溫下40分鐘后，除去清液，并用TBST溶液(TBSwith0.05%Tween20)洗滌3次。加入濃度約0.lmg/mL的銪共軛抗磷酸酪氨酸抗體75ml孵化1小時(shí)，然后用TBST溶液洗滌3次，加入100ml增強(qiáng)液在暗箱中孵化15分鐘。然后將96孔板置于維克多電壓多標(biāo)簽柜臺(tái)使用默認(rèn)的銪檢測(cè)協(xié)議進(jìn)行讀數(shù)。與空白樣數(shù)據(jù)進(jìn)行比較計(jì)算出化合物的抑制百分率。表l化合物l-16對(duì)VEGFR蛋白激酶的抑制效果化合物編號(hào)抑制率(％)(濃度lOPg/mL)分子水平的酶活性測(cè)試顯示，本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體蛋白激酶有很強(qiáng)的抑制效果，其抑制率顯著高于sorafenib，特別是化合物2，4，5，6，9，10，14和16。試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體[VEGFR]蛋白激酶高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[HUVEC]高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，用來(lái)測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。用四氮唑鹽(MTT)法觀察化合物對(duì)于細(xì)胞的增殖作用將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100mL，在培養(yǎng)箱中孵化24h。在無(wú)菌條件下，以無(wú)藥培養(yǎng)液和各種濃度的含藥培養(yǎng)液處理96孔培養(yǎng)板(每種化合物設(shè)3個(gè)平行)24-72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT顯色，在活細(xì)胞內(nèi)可形成有色結(jié)晶，懸浮細(xì)胞離心后吸棄上清液。用匿S0溶解結(jié)晶后，測(cè)定570nm處的吸光度。按以下方法求得抑制率(％)。增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)表2化合物1-16對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[HUVEC]生長(zhǎng)的抑制效果化合物編號(hào)抑制率％(濃度l(mg/mL)細(xì)胞水平的藥理結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物是一類高活性的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑，對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞顯示很高的抑制活性，顯著優(yōu)于sorafenib，尤其是化合物6，9，11，12和14。試驗(yàn)例3本發(fā)明化合物對(duì)肝癌的作用將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌S匪C-7721細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)制成密度為5乂107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取0.2ml接種于70只BALB/C裸鼠右腋部皮下。于8d后隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和化合物2、6、9、11、14組?？诜o藥，實(shí)驗(yàn)組分別給予0.lg/kg體重的化合物2、6、9U1、14，每天1次，同樣給予模型組等量的生理鹽水，對(duì)照組O.lg/kg體重的sorafenib。4周后處死動(dòng)物，無(wú)菌狀態(tài)下取出瘤塊，測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑、短徑，并稱瘤重。腫瘤體積(V)=(長(zhǎng)徑X短徑)2/2，體積抑瘤率=(對(duì)照組體積-實(shí)驗(yàn)組體積)/對(duì)照組體積X100%;重量抑瘤率=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重X100%。腫瘤微血管密度(MVD)按Wendner法(張必翔等，環(huán)氧合酶_2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子共表達(dá)與肝細(xì)胞癌血管形成的關(guān)系，中華實(shí)驗(yàn)外科雜質(zhì)，2004，21:671-675)進(jìn)行檢測(cè)。表3化合物對(duì)肝癌作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別體積抑瘤率(％)重量抑瘤率(％)MVD模型組0020.94±5.63對(duì)照組61.3259.289.64±1.91*化合物274.3972.947.88±1.79*△Sorafenib64.35180.55282.14380.26489.35589.52694.35787.35880.87991.271087.361195.681294.281387.541497.361579.991685.24合合合合合合合合合JJ^MJ，J,tbbk.tbIs."Iv:l乂l乂l乂lzl乂l乂l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*:與模型組比較P<0.01△:與對(duì)照組比較P<0.05動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物和sorafenib均可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，顯著降低MVD，證實(shí)了二者均有抑制腫瘤血管形成的作用。與sorafenib比較，化合物2、6、9、11、14的抑瘤率顯著提高，降低模型動(dòng)物MVD的作用也顯著增強(qiáng)(P<0.05)。實(shí)施例4:藥物對(duì)人體正常肝細(xì)胞L0-2增殖的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常肝細(xì)胞L0-2用lml0.5%的胰蛋白酶消化后，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有的細(xì)胞表面。在室溫下孵育約8min，將培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)消化液，加入含牛血清的培養(yǎng)液，用彎頭吸管反復(fù)吹打瓶?jī)?nèi)壁細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.OX105個(gè)/L。取190uL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，371\5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。待細(xì)胞貼壁后，在樣品孔中分別加入10ul索拉非尼、化合物2、化合物6、化合物9、化合物11和化合物14，每組均設(shè)6個(gè)平行孔?？瞻讓?duì)照組加入等體積培養(yǎng)液。在藥物作用24、48、72h后，每孔加入10ul濃度為5mg/mL的四噻唑藍(lán)溶液，37"、5%0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，每孔加匿S0150ul，中速振蕩15s，以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測(cè)各樣品孔吸光度(D)，每孔重復(fù)測(cè)定兩次。增殖抑制率(%)=(D對(duì)照-D測(cè)定)/D對(duì)照X100%。表4化合物對(duì)人正常肝細(xì)胞L0-2增殖抑制率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*:與sorafenib組比較P<0.05;**:與sorafenib組比較P<0.01結(jié)果表明各組對(duì)人正常肝細(xì)胞L0-2均表現(xiàn)出不同程度的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用，并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。在藥物作用24小時(shí)后，化合物6、9、11及化合物14的增殖抑制率明顯低于sorafenib對(duì)照藥物(P<0.05或P<0.01)。作用48、72小時(shí)后，所有化合物的細(xì)胞抑制作用均顯著低于sorafenib(P<0.05或P<0.01)。因此，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的芳基硫脲化合物是一類高活性的新的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體蛋白激酶生長(zhǎng)抑制劑和腫瘤生長(zhǎng)抑制劑，并且對(duì)人體正常肝細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞L0-2)具有顯著的低細(xì)胞毒性，表現(xiàn)其更加良好的抗腫瘤藥物安全性能。19權(quán)利要求一類芳基硫脲類化合物，結(jié)構(gòu)通式為其中R為C6-10芳基，C4-C8雜芳基，取代的C6-10芳基或取代的C4-C8雜芳基。F2009102061390C0000011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的芳基硫脲類化合物，其特征在于所述的CV,。芳基或CfCs雜芳基被一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)取代廣CN、-CF3、-N02、-CO具、-C(0)NR凡'、-OR、-SR"鹵素或至多全鹵代；其中，&和IV為H、1Q垸基、C6—14芳基、CV,3雜芳基或至多全鹵代的C卜w烷基。3.權(quán)利要求2所述的芳基硫脲化合物，其特征在于所述的化合物為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>化合物1化合物2化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>化合物4化合物5化合物6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CONHCH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物14化合物16。4.權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的芳基硫脲化合物的制備方法，其特征在于將式II化合物及式HI化合物在溶劑中混合直接縮合得到式I:H2N.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備芳基硫脲化合物的方法，其特征在于所使用的溶劑為乙腈、乙酸乙酉旨、甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備芳基硫脲化合物的方法，其特征在于反應(yīng)溫度為20-100°C。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備芳基硫脲化合物的方法，其特征在于式III化合物與式II化合物的原料摩爾比為1:0.8-1.2。8.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的化合物在制備治療由VEGFR激酶引起、介導(dǎo)和/或傳播的疾病中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的疾病為腫瘤。全文摘要本發(fā)明公開了一類芳基硫脲及其制備方法和用途，如下具體有通式I的化合物。這類具有芳基取代硫脲的新化合物展示有非常高的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，尤其對(duì)于VEGFR高表達(dá)的HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，半數(shù)抑制率在10μg/mL都大于70％。本發(fā)明也提供了這類化合物的制備方法。文檔編號(hào)A61K31/44GK101723890SQ200910206139公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者姬建新,左承森,李炎飛,金毅申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所